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문제 정의
- 그러므로, 닭 PGCs의 동결보존기술 향상에 의해 동결 및 융해 후의 많은 생존세포를 확보 하는 방안과 생식계열 키메라의 제작효율을 높이는 방법은 반드시 필요하다. 닭 PGCs의 동결에 관한 기초 자료를 얻기 위하여 본 실험에서는 2개의 다른 동결보호제인 DMSO와 EG를 단독으로 사용하거나 2개의 조합하여 닭 PGCs를 동결하고, 세포의 생존율에 대해 비교 검토, 조사 하였다.
- 동결보호제로 많이 사용되어 온 ethylene glycol (EG), dimethyl sulfoxide (DMSO), propylene glycol (PROH), glycerol 등과 같이 세포 내에 투과성이 있는 침투성 동결보호제(permeable CPA)와 당(sugars) 또는 polyvinylpyrrolidone (PVP), 혈청알부민(serum albumin), 혈청 (serum), polyethylene glycol (PEG), ficoll 거대분자와 같이 세포 내에 투과성이 없는 비침투성동결보호제(non-permeable CPA)로 구분된다(Lovelock 등, 1959; Boutron 등, 1984). 본 연구에서는 투과성(EG, DMSO) 및 비 투과성 억제제 polyvinylpyrrolidone (PVP) 를 가지고, 동결 및 융해 후의 닭 PGCs의 생존율에 관한 조사를 실시하였다. Meryman 등(2007)은 세포 동결에 있어서 중요한 요인으로 동결속도, 세포와 동결보호제의 종류 그리고 동결과정 중에서 변화하는 삼투압에 의한 세포손상을 최대한 줄일 수 있어 세포에 최적화된 동결 배양액을 선택 하는 것이 가장 중요하다고 보고했다.
- 특히, 닭 PGCs의 급속동결방법과 완만동결의 비교 검토로 동결보존기술이 증진된다면, 조류의 유전자원보존의 복원과 함께 형질전환 닭의 보존 방법에 관한 효율성이 증진 될 것으로 판단된다. 우선, 본 연구에서는 동결보존 기술의 개선에 의한 한국 재래닭 오계 PGCs의 동결 및 융해 후의 생존율을 높이기 위해서, 오계 PGCs의 동결 및 융해 후의 생존율을 검토하였으며 동결방법의 개선을 목적으로 완만동결법과 급속동결법을 비교 및 검토하였다.
- 더욱이 닭 PGCs의 배양체계는 아직까지 완전하게 확립되어 있지 않은 영역이라 성공적인 닭 PGCs의 동결보존은 유전자원 보존으로서 필수적인 기술로 추정된다. 일반적으로 닭 PGCs의 정제방법과 이식 방법에 의한 생식 계열 키메라 제작에 관한 연구결과를 많은 연구자들이 보고(Natio 등, 1994; Han 등, 2002; Kino 등, 1997; Naito 등, 2003; Petitte 등, 2006)하고 있으나 닭 PGCs의 동결방법에 관한 직접적인 비교 및 검토는 미진하다고 판단되었기에 본 연구에서 닭 PGCs의 동결 효율성을 증진 시키는 방법에 관한 연구를 실시하였다. 특히, 닭 PGCs의 급속동결방법과 완만동결의 비교 검토로 동결보존기술이 증진된다면, 조류의 유전자원보존의 복원과 함께 형질전환 닭의 보존 방법에 관한 효율성이 증진 될 것으로 판단된다.
제안 방법
- 1) SF: 닭 PGCs를 2.0 M EG 50μL에 현탁해서 두고, 기본 동결용액인 D-PBS (+0.5% BSA) 150μL를 혼합하여 0.25 mL 플라스틱제 스트로(EcoStraw transparent, FHK, Japan)에 흡입하고, 선단부를 봉입해서, 프로그램 freezer (Freezer Control CL-863, Cryologic, Australia) 에서 동결하였다.
- 스트로 내에는, 사전에 D-PBS를 충원해 두고, 흡입 시에 CPA와 섞이지 않게 하기 위해서 기포를 약 2 mm 정도 채워 구분하였다. 2) RF: PGCs를 2.0 M EG 동결배양액 15 mL에 현탁하고, 5분간 정치한 후, 8.0 M EG + 7% PVP 동결배양액을 50 mL 첨가하고, 플라스틱제 스트로에 흡입시키고, 선단부를 봉입한 후, 곧바로 액체질소(LN2) 내에 투입했다. 스트로 내에는 1.
- 0 M EG 동결보호제의 저온상태 처리:1)과 동일한 처리를 10% DMSO 4℃에서 실시했다. 3) 10% DMSO 동결보호제의 저온상태 처리:2)와 동일한 처리를 10% DMSO 용액에서 실시했다. 4) 8.
- 4) 8.0 M EG + 7% (w/v) polyvinyl pyrrolidone (PVP: average molecular weight 10,000, SIGMA) 저온상태 처리: 닭 PGCs를 2.0 M EG용액 15 μL에 현탁하고, 1.5 mL tube 내에서 4℃에 5분 간 정치한 뒤 8.0 M EG 용액을 50 μL 첨가했다.
- CPA 독성을 조사했을 때와 같이 CPA를 이용해서, SF 및 RF 에 대해서 생존율을 검정했다. 1) SF: 닭 PGCs를 2.
- 큰 세포 다발 그리고 분해되지 않은 조직의 단편들을 제거하기 위해서, 세포 부유액은 20 μm 격자크기의 망 구조 필터(BD falcon, Cell Strainer, USA)를 이용해서 필터를 하고, 200 g에 5분간 원심분리를 했다. MiniMACS (magnetic-activated cell sorting) system (Miltenyi Biotec, Auburn, CA, USA)을 이용해서 원시생식선 유래의 닭 PGCs (gPGCs)를 순수 분리 및 정제 하였다(Kim 등, 2004). 원심분리 후 생식선세포(한 개의 tube 당 3×106에서 5×106)는 SSEA-1 항체를 이용해서, MACS 방법으로 순수 gPGCs를 정제하였다.
- 닭 PGCs의 동결실험에서 SF을 위한 CPA로 DMSO와 세포독성이 낮은 EG를 비교하였으며 가축배아의 동결보존에서 우수한 생존율을 얻고 있는 RF에 관한 실험을 실시하였다. 닭 PGCs에 대해서, 4 종류의 방법으로 DMSO와 EG의 독성을 비교 조사한 결과를 Table 1에 나타내었다.
- 그러나 난소와 같은 다양한 크기의 여러 세포로 이루어진 조직은 동결보호제 노출 시간이 30분 이상 되어야 적절한 동결보호제 침투를 이룰 수 있다고 보고했다(Newton 등, 1998). 닭 PGCs의 형태학적인 특징 중의 하나인 일반 세포에 비해 부피가 크고 더불어 수분함유량이 비교적 많아 이를 효과적으로 동결보존하기 위해서는 특히, 얼음결정의 형성을 근본적으로 피할 수 있는 급속동결법을 검토하였다. 완만동결법에 비해 동결 및 융해 후의 닭 PGCs의 생존율은 유의적인 차이는 없었지만, 동결보호제와 보관용기의 조합에 따라 융해 후의 닭 PGCs의 생존율에 차이가 있는 것을 확인했다.
- 원심분리 후 생식선세포(한 개의 tube 당 3×106에서 5×106)는 SSEA-1 항체를 이용해서, MACS 방법으로 순수 gPGCs를 정제하였다. 닭 생식선 유래 세포 혼합물을 PGC- specific antibody로 알려진 anti-stage specific embryo antigen (anti-SSEA)-1 antibody(Santa Cruz Biotechnology, mouse IgM isotype: SSEA-1, MC-480)를 5% NGS/PBS에 1:200으로 희석하여 실온 20~25℃에서 20분간 반응을 시켰다. PBS에 0.
- 4% Trypan blue 염색액를 이용하여(Freshney, 2005) 효율을 계산하였다. 동결방법은 10% DMSO를 동결보호물질(cyroprotectant: 이하 CPA)로 이용하는 방법(Naito 등, 1994)과 가축배자의 동결보존에 사용 되는 EG를 CPA로 하는 완만동결법(slow freezing, SF) 및 급속동결법(rapid freezing, RF)를 비교 검토했다. 또한 모든 동결 및 융해 실험은 총 8회에 걸친 반복을 실시하였다.
- 동결방법은 10% DMSO를 동결보호물질(cyroprotectant: 이하 CPA)로 이용하는 방법(Naito 등, 1994)과 가축배자의 동결보존에 사용 되는 EG를 CPA로 하는 완만동결법(slow freezing, SF) 및 급속동결법(rapid freezing, RF)를 비교 검토했다. 또한 모든 동결 및 융해 실험은 총 8회에 걸친 반복을 실시하였다.
- 그러나 급속동결용액은 낮은 온도에서 과냉각되기 때문에 동결 및 융해의 과정에서 얼음결정화가 일어나 세포에 손상을 주기 때문에 Rall 등(1987)은 결정화가 일어나지 않도록 투과력이 높은 고농도의 동결보호제를 사용했다. 본 연구에서도 동결 방법에 따라서 완만동결은 2.0 M의 저농도의 동결보호제(Bautista 등, 1998) 를 사용하고, 급속동결에서는 8.0 M EG의 고농도의 동결보호제를 사용했다.
- 5 mL 튜브에 융해된 세포를 옮기고, 240 G에서 6분간 원심분리를 실시하여 상층액과 함께 CPA를 제거하였다. 새로운 D-MEM에 세포괴를 현탁하고, 24 well plate에 옮겨 생존율을 조사했다. 급속동결 한 스트로의 경우에는 배양액과 동결용액을 혼합하고 나서 동일한 처리를 실시했다.
- 실험군은 동결 및 융해 실험에 사용하는 CPA를 다음과 같이 설정하고, 25℃ 혹은 4℃에서 반응시키고, 생존율을 검정했다. 그리고, CPA의 동결과 융해의 기본용액은 0.
- 아래에 침전된 세포괴를 rat anti-mouse IgM microbeads 20 μL가 포함된 100 μL MACS buffer와 천천히 혼합하여 4℃에 15분 간 반응하고, 처리된 세포들은 조심스럽게 500 μ L buffer를 첨가해 동일한 방법으로 세정을 하고 나서, MACS 컬럼을 이용하여 정제하였다(Kim 등, 2004).
- 8℃, 상대습도 60~70%인 부화기에서 배양하였다. 원시생식선으로부터 분리방법은 5.5일(stage 28: (Hamburger와 Hamilton, 1951) 동안 발생한 초기배자를 Mg2+와 Ca2+가 함유 되지 않은 PBS (PBS(－), Sigma, St. Louis, MO, USA)가 담긴 큰 배양접시에 옮긴 후, 실체 현미경(SZH; Tokyo, Japan) 하에서 예리한 핀셋을 이용하여 원시생식선 부분만을 분리한 후, MACS법에 의해 분리 및 순수 정제를 하기 위해, 이를 1.5 mL 튜브에 수집하여 실온에 두었다.
- 원심분리 후 생식선세포(한 개의 tube 당 3×106에서 5×106)는 SSEA-1 항체를 이용해서, MACS 방법으로 순수 gPGCs를 정제하였다.
- 5 mL) 에 의한 SF 보다도 유의적으로 높은 수치를 나타내었다. 이것은 동결용 스트로의 벽이 더 얇기 때문에 온도 변화가 신속하게 전달되며 세포에 대하여 정확한 온도 조절로 부하가 작을 것으로 예상되어 동결용기 cryotube를 이용하는 결과보다 동결 및 융해 후의 닭 PGCs의 생존율이 우수 할 것이라고 추정된 것과 상반되는 결과를 관찰하였다. 이는 오히려, 동결용 스트로 용기의 얇은 벽에 의하여 PGCs의 동결과정과 동결 후 보존과정 및 융해 시의 온도변화에 따른 충격 등과 같은 환경적인 요인으로 인하여 닭 PGCs가 많은 손상을 입었을 가능성도 배제할 수가 없다.
- 큰 세포 다발 그리고 분해되지 않은 조직의 단편들을 제거하기 위해서, 세포 부유액은 20 μm 격자크기의 망 구조 필터(BD falcon, Cell Strainer, USA)를 이용해서 필터를 하고, 200 g에 5분간 원심분리를 했다.
대상 데이터
- 동결 보존 후 원시생식세포의 생존율에 있어서 동결 방법만큼이나 중요한 것은 동결－융해 과정 중 사용되는 동해방지제의 종류, 농도 및 처리 시간이다. 기존에는 독성이 강하고 점성이 높은 침투성의 동해방지제로서 DMSO, glycerol 그리고 propandiol 1.2-PROH)를 사용하였다. 그러나 최근에는 Martino 등(1996)은 소 성숙난자를 ethylene glycol 을 사용하여 높은 배반포율을 보고한 것과 같이 ethylene glycol을 사용하는 빈도가 점차 높아지고 있으며, 비침투성 동해방지제로는 dextran, raffinose, 난황, 혈청 알부민이 있으나 glucose와 sucrose를 가장 많이 사용하고 있다 (Kim 등, 1996; Rayos 등, 1994; Zhu 등, 1993).
- 본 실험에 사용된 공시계(Kim 등, 2011)는 국립축산과학원에서 생산된 종란을 인수하여 부화시킨 한국재래닭 3원 교잡종과 가축유전자원시험장에서 보유하고 있는 44주령의 한국재래닭 오계 (Ogye) 수탉에서 정액을 각각 채취하여, 같은 주령의 암탉에 대하여 인공수정을 실시하여 생산된 수정란을 1일에서 21일까지 10~13℃, 습도 70~85%의 종란 보관용 배양기에서 집란하여 부화기에 입란하고 5.5일령의 발생란을 시료로 사용하였다. 사양관리는 한국가금사양표준의 NRC 사양표준에 준한 시판 종계사료를 무제한 급여하였으며, 기타 관리는 관행에 준하였다.
- 본 실험은 국립축산과학원 가축유전자원 시험장에서 사육중인 실험 축을 사용하여 Hamburger-Hamilton (1951) 의 배 발달 단계에 기초하여, 37.8℃, 상대습도 60~70%인 부화기에서 배양하였다. 원시생식선으로부터 분리방법은 5.
데이터처리
- 본 실험의 통계적 처리는 SAS package program (2000)를 이용 하여 분산 분석을 실시하였으며, 처리 간의 유의성 검정은 Duncan’s multiple range test를 이용하여 실시하였다.
이론/모형
- 각 군의 PGCs 세포 수는 약 200개 정도로 조절하고, 세포의 생존율 측정은 0.4% Trypan blue 염색액를 이용하여(Freshney, 2005) 효율을 계산하였다. 동결방법은 10% DMSO를 동결보호물질(cyroprotectant: 이하 CPA)로 이용하는 방법(Naito 등, 1994)과 가축배자의 동결보존에 사용 되는 EG를 CPA로 하는 완만동결법(slow freezing, SF) 및 급속동결법(rapid freezing, RF)를 비교 검토했다.
- Tajima 등(1998)은 또한, 발생 5일째 배자부터 동결 보존된 닭 원시생식선유래 닭 PGCs를 이용하여 생식선 유래 키메라를 제작하였다. 이러한 연구들 모두는 완만동결(Slow-Freezing)법을 사용하였다(Naito 등, 1994; Tajima 등, 1998).
성능/효과
- 닭 PGCs에 대해서, 4 종류의 방법으로 DMSO와 EG의 독성을 비교 조사한 결과를 Table 1에 나타내었다. 2.0 M EG에 실온과 4℃에서 15분간 처리된 닭 PGCs의 생존율은 각각 81.5% 그리고 81.6% 였다. 그러나 DMSO에 4℃에서 15분간 처리된 결과는 생존율 73.
- 0 M EG + 7% PVP의 반응에 의해서, 이미 세포에 손상이 발생하고 있는 것이 결과적으로 융해 후의 생존율을 저하시키는 원인으로 추측된다. DMSO는 세포 독성을 나타내고 있음에도 불구하고 가장 광범위하게 사용되고 있는 세포 동결보호제로 알려져 있지만 본 연구에서 닭 PGCs의 동결방법에는 동결속도와 동결용기의 선택과 조합에 따라서 DMSO 뿐만 아니라, 동결보호제로써 10% 농도의 EG도 이용할 수 있음을 확인하였다. 이번 실험 결과들로부터 닭 PGCs를 유전자원으로 영구 보존하기 위하여 동결용 스트로와 동결용 Cryotube 모두 이용할 수 있음이 증명 되었으며 자동세포동결기(programmed freezer)와 같은 정확한 온도조절이 가능한 장비의 이용으로 동결용 튜브에 의한 동결보존의 효율성은 더욱 증진될 것으로 추정된다.
- Naito 등은 40 μL의 CPA에 대해서 PGCs를 약 3,000개 라고 하는 고밀도에서 동결보존을 실시하였기 때문에 세밀한 비교는 할 수 없었을 것으로 추정되며 본 연구에서 이용된 PGCs의 SF에 관한 결과는 비록 통계적인 유의성은 보이지 않았으나 EG가 일반적으로 일반세포주의 동결에 CPA로써 많이 이용되어 왔던 DMSO 보다 동결 및 융해 후의 세포생존율이 높은 경향을 확인했다.
- 그러나 DMSO에 4℃에서 15분간 처리된 결과는 생존율 73.3%이고, 2.0 M EG 처리구와 비교하면 생존율이 유의적(P<0.05)으로 낮음을 확인하였다.
- 또한, 각각의 동결보존법에 의해서 세포를 동결 및 융해 후의 생존율을 조사한 결과는 Table 2에서 살펴볼 수 있다. 닭 PGCs의 동결보존실험에서는 2.0 M EG 를 CPA로써 세포동결용 Cryotube에 의한 SF가 80.5%로 가장 높은 생존율을 나타내었지만, 가장 널리 이용되는 동결보존법인 10% DMSO를 CPA로 이용한 세포동결용 Cryotube에 의한 SF 처리구에서는 생존율이 78.1%로 관찰되었으나, 양쪽 처리구 간 유의적인 차이는 관찰되지 않았다. 또한, 2.
- 또한, 2.0 M EG를 이용한 동결용 플라스틱 스트로(0.5 mL) 처리구에 의한 SF의 생존율은, 76.4%이고, 10% DMSO와의 사이에 유의적인 차이는 보이지 않았지만, 2.0 M EG의 동결용 Cryotube에 의한 SF 와의 사이에서는 유의적인 차이가 보였다(P<0.05).
- 닭 PGCs의 동결보존은 형질전환 닭의 생산에 있어서 닭 PGCs 의 유전자도입 실험의 설계를 용이하게 계획하기 위하여 필수적인 기술로 추정되고, 기존의 생산된 형질전환 닭의 유전자원 보존을 위하여 형질전환개체의 후대 종란의 PGCs를 보존하는 방안에서도 이용될 가능성이 높다. 본 연구에서 Naito 등(1994)의 연구에 이용되었던 DMSO에 대해서, EG를 비교검토 한 결과, 동결용기 (cryotube)에 의한 SF에서는 생존율에 유의적인 차이는 없었다. Naito 등은 40 μL의 CPA에 대해서 PGCs를 약 3,000개 라고 하는 고밀도에서 동결보존을 실시하였기 때문에 세밀한 비교는 할 수 없었을 것으로 추정되며 본 연구에서 이용된 PGCs의 SF에 관한 결과는 비록 통계적인 유의성은 보이지 않았으나 EG가 일반적으로 일반세포주의 동결에 CPA로써 많이 이용되어 왔던 DMSO 보다 동결 및 융해 후의 세포생존율이 높은 경향을 확인했다.
- 이는 오히려, 동결용 스트로 용기의 얇은 벽에 의하여 PGCs의 동결과정과 동결 후 보존과정 및 융해 시의 온도변화에 따른 충격 등과 같은 환경적인 요인으로 인하여 닭 PGCs가 많은 손상을 입었을 가능성도 배제할 수가 없다. 본 연구에서 RF의 낮은 생존율은 동결 전의 8.0 M EG + 7% PVP의 반응에 의해서, 이미 세포에 손상이 발생하고 있는 것이 결과적으로 융해 후의 생존율을 저하시키는 원인으로 추측된다. DMSO는 세포 독성을 나타내고 있음에도 불구하고 가장 광범위하게 사용되고 있는 세포 동결보호제로 알려져 있지만 본 연구에서 닭 PGCs의 동결방법에는 동결속도와 동결용기의 선택과 조합에 따라서 DMSO 뿐만 아니라, 동결보호제로써 10% 농도의 EG도 이용할 수 있음을 확인하였다.
- DMSO의 경우는 세포 내로의 침투속도가 약 20~30분이며, glycerol은 거의 60분 이상으로 매우 느린 것에 반해서 특히, 분자량이 비교적 작고 세포막 투과성이 다른 동결보호제에 비해 뛰어난 특성 있는 EG를 기본으로 만든 동결액의 경우는 세포 내로의 침투속도가 5~7분으로 매우 빠르다(Friedler 등, 1988). 본 연구에서도 10% DMSO 및 8.0 M EG + 7% PVP 처리군 보다 2.0 M EG를 동결보호제로 사용한 군에서 동결 및 융해 후의 닭 PGCs의 생존율이 유의적으로 높은 것을 확인하였다. Friedler 등 (1988)의 보고를 고려해 볼 때, 빠르게 침투하여 삼투압의 평형에 도달한 결과, 삼투압의 충격이 거의 없고, 처리시간이 짧아짐으로써 닭 PGCs에 미치는 영향을 최소화 할 가능성이 존재한다.
- 닭 PGCs의 형태학적인 특징 중의 하나인 일반 세포에 비해 부피가 크고 더불어 수분함유량이 비교적 많아 이를 효과적으로 동결보존하기 위해서는 특히, 얼음결정의 형성을 근본적으로 피할 수 있는 급속동결법을 검토하였다. 완만동결법에 비해 동결 및 융해 후의 닭 PGCs의 생존율은 유의적인 차이는 없었지만, 동결보호제와 보관용기의 조합에 따라 융해 후의 닭 PGCs의 생존율에 차이가 있는 것을 확인했다. 이와 같은 급속동결은 조작이 간단하고, 고가의 장비가 필요 없기 때문에 경제적으로 유익하다는 점이며, 앞에서 언급한 것과 같이 얼음결정이 원천적으로 형성되지 않아 상해를 최소화 할 수 있다는 장점이 있다.
- DMSO는 세포 독성을 나타내고 있음에도 불구하고 가장 광범위하게 사용되고 있는 세포 동결보호제로 알려져 있지만 본 연구에서 닭 PGCs의 동결방법에는 동결속도와 동결용기의 선택과 조합에 따라서 DMSO 뿐만 아니라, 동결보호제로써 10% 농도의 EG도 이용할 수 있음을 확인하였다. 이번 실험 결과들로부터 닭 PGCs를 유전자원으로 영구 보존하기 위하여 동결용 스트로와 동결용 Cryotube 모두 이용할 수 있음이 증명 되었으며 자동세포동결기(programmed freezer)와 같은 정확한 온도조절이 가능한 장비의 이용으로 동결용 튜브에 의한 동결보존의 효율성은 더욱 증진될 것으로 추정된다. 닭 PGCs의 동결 및 융해 기술은 멸종위기의 야생조류와 희귀조류와 같은 경제적 가치가 큰 동물의 생식세포를 장기간 보존할 수 있다는 점에서 그 의의가 매우 크다.
- 0 M 이라고 하는 고장액에 의해서, 닭 PGCs에 어떠한 형태로든 손상이 주어졌다고 생각되어진다. 이상의 결과로부터, 닭 PGCs의 동결 및 융해 후, 생존율이 가장 높은 동결방법은 2.0 M EG를 항동해제로 이용하는 방법임을 확인하였다. 또한, 각각의 동결보존법에 의해서 세포를 동결 및 융해 후의 생존율을 조사한 결과는 Table 2에서 살펴볼 수 있다.
- 한편, RF의 CPA인 8.0 M EG + 7% PVP에 4℃로 반응한 결과, 생존율은 69.7%였고, 다른 처리구와 비교해서 유의적으로 가장 낮음을 알 수가 있었다(P<0.05).
후속연구
- 닭 PGCs의 동결 및 융해 기술은 멸종위기의 야생조류와 희귀조류와 같은 경제적 가치가 큰 동물의 생식세포를 장기간 보존할 수 있다는 점에서 그 의의가 매우 크다. 그러므로 조류 PGCs의 대량확보 수단으로서의 닭 PGCs 동결보존기술 개발이 우선 요구되고 있는 실정이며, 본 연구에서 제안하는 닭 PGCs의 동결방법은 하나의 대안으로 활용 가치가 높다고 추정된다.
- 0 M EG)의 동결보호제 처리로 인한 독성 혹은 삼투압으로 인한 닭 PGCs의 손상을 초래했을 가능성이 존재한다. 차후에 닭 PGCs 동결보호제의 종류와 처리시간을 조절 하여 세포독성을 줄이는 방법의 확립과 이를 통해 닭 PGCs내 투과 속도가 높고 독성이 적은 동결보호제를 도입 하거나, 투과성과 비 투과성 동결보호제를 조합하여 상재적인 농도변화 없이 절대적인 농도를 낮추는 방법을 통해서 최종적으로 닭 PGCs에 미치는 독성을 감소시켜 유리화 동결 및 융해 후, 효율을 증진시키는 방법 개발 등에 관해서 좀 더 구체적으로 검토 해야 할 필요성이 있다. 이외에도 용액이 노출되는 온도 및 보관용기의 열전도율, 동결용액의 양, 연구자의 숙련도와 배아 발달시기 및 질 등이 급속동결의 결과에 미치는 영향이 생식세포 및 배아 등에서 많이 연구되고 있다(Kuleshova 등, 1999; Lee 등, 2009; Saha 등, 1996).
- 일반적으로 닭 PGCs의 정제방법과 이식 방법에 의한 생식 계열 키메라 제작에 관한 연구결과를 많은 연구자들이 보고(Natio 등, 1994; Han 등, 2002; Kino 등, 1997; Naito 등, 2003; Petitte 등, 2006)하고 있으나 닭 PGCs의 동결방법에 관한 직접적인 비교 및 검토는 미진하다고 판단되었기에 본 연구에서 닭 PGCs의 동결 효율성을 증진 시키는 방법에 관한 연구를 실시하였다. 특히, 닭 PGCs의 급속동결방법과 완만동결의 비교 검토로 동결보존기술이 증진된다면, 조류의 유전자원보존의 복원과 함께 형질전환 닭의 보존 방법에 관한 효율성이 증진 될 것으로 판단된다. 우선, 본 연구에서는 동결보존 기술의 개선에 의한 한국 재래닭 오계 PGCs의 동결 및 융해 후의 생존율을 높이기 위해서, 오계 PGCs의 동결 및 융해 후의 생존율을 검토하였으며 동결방법의 개선을 목적으로 완만동결법과 급속동결법을 비교 및 검토하였다.
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