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문제 정의
- 이 연구는 제주연안에 서식하는 가시굴의 생활사를 이해하는 기초연구의 일환으로 산란기간 중, 초기 유생발달 과정을 광학 현미경 및 주사전자현미경으로 관찰하여 보고하고자 하였다.
제안 방법
- 가시굴 수정란 초기 발달과정을 관찰하기 위해 광학 현미경과 주사 전자현미경 (SEM) 을 이용하여 정자, 알 및 수정란의배 발생을 관찰하였다. 광학 현미경을 이용한 수정란 발달 관찰은 수정 후, 30분 간격으로 수행하였고, 세포분열이 관찰된 수정난은 SEM 관찰을 위하여 2% glutaraldehyde 고정액에 1시간 동안 전 고정 하였다.
- 채집된 가시굴은 실험실로 옮겨, 암·수 구분을 위해 가시굴 외투막 (mantle) 에 발달된 생식세포를 주사바늘을 이용해 일부를 적출 후 슬라이드에 도말하여 광학현미경 (CH30, Olympus) 하에서 확인하였다. 가시굴의 채란 및 채정을 위해 성숙한 알 또는 정소가 포함된 가시굴 생식소 조직을 가위로 오려낸 후, Petri Dish에 올려놓고 1 mm간격으로 세밀히 절개하여 정자와 알을 수집하였다. 수집된 가시굴 알은 20 μm 망목을 이용해 수세 한 뒤, 여과해수가 채워진 5 L 원형 비이커로 옮겼다.
- 광학 현미경을 이용한 수정란 발달 관찰은 수정 후, 30분 간격으로 수행하였고, 세포분열이 관찰된 수정난은 SEM 관찰을 위하여 2% glutaraldehyde 고정액에 1시간 동안 전 고정 하였다. 고정이 완료된 수정란은 50, 70, 90, 95, 100% 에탄올로 탈수 과정을 거쳤으며 치환을 위해 30, 50, 70, 100% isoamyl acetate 처리하였다. 치환이 완료된 수정란은 진공건조 뒤 gold 입자로 코팅하였으며, 장방출 주사 전자현미경 (JSM-6700F, JEOL Korea Ltd) 을 이용하여 관찰하였다.
- 가시굴 수정란 초기 발달과정을 관찰하기 위해 광학 현미경과 주사 전자현미경 (SEM) 을 이용하여 정자, 알 및 수정란의배 발생을 관찰하였다. 광학 현미경을 이용한 수정란 발달 관찰은 수정 후, 30분 간격으로 수행하였고, 세포분열이 관찰된 수정난은 SEM 관찰을 위하여 2% glutaraldehyde 고정액에 1시간 동안 전 고정 하였다. 고정이 완료된 수정란은 50, 70, 90, 95, 100% 에탄올로 탈수 과정을 거쳤으며 치환을 위해 30, 50, 70, 100% isoamyl acetate 처리하였다.
- 수정란은 1시간 10분 후 2세포기 (2-cell stage) 를 보였으며 (Fig. 2C & 3E), 수정 1시간 40분 후에는 4세포기 (4-cell stage) 에 도달하였으며, 이 시기에 관찰된 세포는 크기가 비슷한 3개의 난할구 (blastomere) 와 세포 크기가 가장 큰 1개의 난할구로 구성되어 있었다 (Fig. 2D &3F).
- 수집된 가시굴 알은 20 μm 망목을 이용해 수세 한 뒤, 여과해수가 채워진 5 L 원형 비이커로 옮겼다. 수정은 가시굴 정자를 알이 들어있는 비이커에 주입시켜 자연수정을 실시하였다. 수정된 가시굴 알은 바닥에 가라앉지 않도록 통기 (aeration) 하였다.
- 이후, 8세포기 (Fig. 2E & 3G), 16세포기 (Fig. 3H) 의배 발생이 관찰되었으며, 수정 3시간 20분 후 세포분열이 절정에 이르러 가시굴의 조직 또는 기관 분화를 위한 상실기 (morula) 로 분화하였다 (Fig. 2F & 3I).
- 채집된 가시굴은 실험실로 옮겨, 암·수 구분을 위해 가시굴 외투막 (mantle) 에 발달된 생식세포를 주사바늘을 이용해 일부를 적출 후 슬라이드에 도말하여 광학현미경 (CH30, Olympus) 하에서 확인하였다.
- 고정이 완료된 수정란은 50, 70, 90, 95, 100% 에탄올로 탈수 과정을 거쳤으며 치환을 위해 30, 50, 70, 100% isoamyl acetate 처리하였다. 치환이 완료된 수정란은 진공건조 뒤 gold 입자로 코팅하였으며, 장방출 주사 전자현미경 (JSM-6700F, JEOL Korea Ltd) 을 이용하여 관찰하였다.
- 활발한 운동성을 갖는 담륜자 유생 (trochophore larvae) 은 수정 9시간 30분 후에 관찰되었으며, 담륜자 유생은 구전섬모환 (prototroch) 과 정단모 (apical tuft)를 이용하여 유영 (swimming) 을 시작하였다 (Fig. 2J & 3L).
대상 데이터
- 2012년 8월 제주 김녕항에서 채집된 성숙한 가시굴의 정자는 짧은 원추형의 두부와 36.9 μm의 긴 편모 (flagellum) 로 구성되었다 (Fig. 3A).
- 가시굴의 수정 및 초기발생을 관찰하기 위하여 각장 4-6 cm 크기의 가시굴 20개체를 2012년 8월 초, 제주시 김녕항 (33°33’N, 126°44’E) 의 암반 조간대에서 채집하였다 (Fig. 1).
- 수집된 가시굴 알은 20 μm 망목을 이용해 수세 한 뒤, 여과해수가 채워진 5 L 원형 비이커로 옮겼다.
성능/효과
- cucullata의 초기 유생발달에 관한 연구에서 수정에서 담륜자유생까지 10-12시간이 소요됨을 보고하고 있다. 따라서 이 연구에서 관찰된 가시굴의 초기 유생발생 소요 시간은 Kakoi et al. (2008) 이 일본에서 관찰한 가시굴의 초기유생발생 및 S. cucullata의 초기 유생발생과정 관찰결과와 일치하는 것으로 사료된다.
- 2A &3C). 또한, 성숙한 가시굴 알은 해수에 가라앉는 침성란 (demersal egg)의 특징을 보였다.
후속연구
- 이와 달리, Saccostrea 속에 속하는 호주굴 (Saccostrea commercialis) 의 정자 형태는 Crassostrea 속과 아주 유사하지만, 첨체의 미세구조에서 Crassostrea 속의 정자 형태와 구별된다 (Healy and Lester, 1991). 따라서 제주도 연안에 서식하는 가시굴 정자의 외부 형태는 굴과 (Ostreidea) 에 속하는 굴류의 정자 형태와 유사하지만, 종 특이적 특징을 결정하는 첨체의 미세구조에 대한 상세한 연구가 필요할 것으로 사료된다.
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