초록 ▼

Ⅳ. 연구개발결과
1세부: 대장암 항원-항체 재조합 단백질인 GA733-Fc 형질전환 식물의 대량재배를 통한 homozygous line의 seed bank 확보 및 대장암 예방용 수지상세포백신 효능 검증으로 예방용 재조합백신 실용화
- GA733-Fc with KDEL을 발현하는 형질전환 식물의 백신단백질 발현유무 확인. 하우스에서 대량재배한 형질전환 식물을 무작위로 선별하여 유전자 발현 유무를 확인하였음.
- GA733-Fc 백신단백질을 발현하는 식물 중 높은 수준의 발현량을 보이는 형질전환 식물을 대량생산 하기

Ⅳ. 연구개발결과
1세부: 대장암 항원-항체 재조합 단백질인 GA733-Fc 형질전환 식물의 대량재배를 통한 homozygous line의 seed bank 확보 및 대장암 예방용 수지상세포백신 효능 검증으로 예방용 재조합백신 실용화
- GA733-Fc with KDEL을 발현하는 형질전환 식물의 백신단백질 발현유무 확인. 하우스에서 대량재배한 형질전환 식물을 무작위로 선별하여 유전자 발현 유무를 확인하였음.
- GA733-Fc 백신단백질을 발현하는 식물 중 높은 수준의 발현량을 보이는 형질전환 식물을 대량생산 하기 위하여 대형 비닐하우스에 대량 재배하여 실험에 사용할 material 대량 확보하였음.
- 재배된 대장암 백신 단백질 GA733-Fc with KDEL의 형질전환 식물의 대량재배를 통한 homozygous line의 상업화목적의 seed bank 확보함.
- 확보된 material을 이용하여 Protein G affinity column을 이용한 식물유래 대장암 항원-항체 재조합 단백질 GA733-Fc의 정제 확보함.
- MALDI-TOF를 이용하여 정제된 식물유래 대장암 항원-항체 재조합 단백질 GA733-Fc의 당구조 분석 및 백신단백질의 기능성 모색
- PNGase 표를 처리하여 당사슬을 절단한 후 SDS-PAGE를 이용한 protein size변화와 MALDI-TOF을 이용한 당사슬 구조 분석을 수행한 결과 PNGase F를 처리 하였을 때 당사슬이 절단되어 protein의 size가 줄어드는 것을 확인함.
- 당구조 분석을 통한 당단백질의 당사슬 프로파일을 확인한 결과 KDEL retention signal 효과로 인한 ER 상에서 만들어지는 high-mannose type의 당구조를 확인 할 수 있었음.
- 정제 된 식물유래 GA733-Fc with KDEL 백신단백질과 동일한 양의 동물유래 GA733-Fc 를 SDS-PAGE를 통해 비교 분석한 결과, 동물유래의 GA733-Fc와 거의 동일한 순도의 식물 단백질을 정제할 수 있는 정제법 확립 확인.
- 형질전환 식물로부터 정제된 GA733-Fc with KDEL 백신단백질이 항원으로서 기능을 가지는지 확인하기 위해 Surface plasmon resonance assay(SPR)을 통해 항원-항체 binding activity를 수행하였고 그 결과 식물에서 얻은 GA733-Fc with KDEL과 동물유래 GA733 항체가 서로 interaction이 있는 것으로 확인함.
- 또한, 백신단백질이 항원으로서 기능을 가지는지 확인하기 위해 적출한 비장의 수지상세포 (dendritic cell)를 이용하여 germinal center(GC) B cell을 분석하였고 그 결과 대표적인 B cell activation marker Fas와 GL-7인자의 cell population percentage를 분석을 통해 식물 유래 GA733-Fc with KDEL가 동물유래 GA733-Fc 보다 GC B cell이 더 많이 분화되었음을 확인하였음..
- 식물유래 GA733-Fc with KDEL 백신단백질을 주입한 mouse의 비장의 NK cell에서 cytokine factor 분석 결과 Th2 cell의 분화에 관여하는 IL-4와 IL-10 cytokine을 확인하였고, 동물유래 GA733-Fc 보다 더 많은 cytokine을 분비함을 확인하였음.

제1협동: 당쇄화 개선을 통한 GA733-Fc의 치료 효과를 극대화할 수 있는 기반기술 개발 및 독성 평가 검사
- 식물에서 당쇄가 변형된 GA733-Fc 단백질을 생산하기 위한 발현 벡터가 형질전환된 재조합 Agrobacterium을 담배 식물체에 형질전환시킨 후 GA733-Fc 단백질 및 β-1,4-galactosyltransferase(GalT)유전자의 과발현에 의해 당쇄화가 변형된 1단계 당쇄화 개선 GA733-Fc 단백질(GA733-Fc + GalT 단백질)의 발현을 확인하였고 Protein A agarose bead를 이용한 affinity chromatography 방법으로 분리 정제한 후 GA733-Fc 단백질들의 당쇄화 구조를 MALDI-TOF 분석을 통해 확인함.
- GalT 유전자가 과발현된 경우 생성된 1단계 당쇄화 개선 GA733-Fc + GalT 단백질은 담배 식물체에서 생산된 GA733-2-Fc 단백질에 비해 high mannose type의 당쇄를 많이 함유하였음.
- 대장암종 MC38 세포가 이식된 실험동물 C57BL/6 마우스에서 종양의 생성 및 성장을 확인하여 GA733-Fc 단백질의 항암효과를 검증하기 위한 대장암종 동물실험 시스템을 확립하였고 GA733-Fc 단백질 및 1단계 당쇄화 개선된 GA733-Fc + GalT 단백질이 처리된 수지상세포가 대장암종 MC38 세포에 의해 유도되는 종양의 증식에 미치는 영향을 확인함.
- GA733-Fc 단백질이 첨가된 배지에서 배양된 수지상세포가 투여된 경우 종양의 증식은 대조군에 비해 감소하였으며 1단계 당쇄화 개선된 GA733-Fc + GalT 단백질이 처리된 수지상세포가 투여된 경우 종양의 증식은 더욱 감소하는 것으로 확인되었음.
- 또한 1단계 당쇄화 개선된 GA733-Fc + GalT 단백질 투여량의 최적조건 도출과 관련한 in vitro 독성 평가 실험에서 형질전환된 담배에서 분리 정제된 GA733-Fc 단백질은 세포독성을 지니지 않는 것으로 확인됨.
- β-1,2-xylosyltrans&rase(XylT)와 α-1,3-fucosyltransferase(FucT) 유전자가 동시에 knock-down된 식물체에서 2단계 당쇄화 개선 GA733-Fc 단백질(GA733-Fc + XylT/FucT KD 단백질)을 생산하기 위한 pFGC5941/XylT-FucT RNAi 벡터시스템을 구축하고 형질전환된 재조합 Agrobacterium을 확보하였으며 담배 식물체에 형질전환시킨 후 각 유전자의 발현이 억제되는 것을 RT-PCR을 통해 확인함.
- 또한 pFGC5941/XylT-FucT RNAi 벡터가 형질전환된 재조합 Agrobacterium을 담배 잎 절편체에 형질전환시키고 선별 배지에서 재분화를 유도하여 pFGC5941/XylT-FucT RNAi 벡터가 형질전환된 담배 식물체를 확보하였음. XylT와 FucT 유전자의 발현이 억제된 담배 식물체에서 2단계 당쇄화 개선 GA733-Fc + XylT/FucT KD 단백질의 발현을 확인하였고 Protein A agarose bead를 이용한 affinity chromatography 방법으로 분리 정제하고 당쇄화 구조를 MALDI-TOF 분석을 통해 확인함.
- GA733-Fc 및 1, 2단계 당쇄화 개선 GA733-Fc(GA733-Fc + GalT, GA733-Fc + XylT/FucT KD) 단백질을 실험 마우스의 복강에 투여하여 면역반응을 유도하고 혈청에 존재하는 GA733-Fc 특이 IgG 및 IgE 항체의 존재를 효소면역측정법으로 분석하고 실험마우스의 비장세포에서 GA733-Fc 항원에 의한 cytokine IFN-Υ 및 IL-4, IL-5, IL-10의 분비를 효소면역측정법으로 확인함.
- XylT와 FucT 유전자의 발현이 knock-down되고 GalT 유전자가 과발현된 식물체에서 3단계 당쇄화 개선 GA733-Fc(GA733-Fc + GalT + XylT/FucT KD) 단백질을 생산하고 당쇄화 구조를 MALDI-TOF 분석을 통해 확인함.
- 실험동물 마우스에서 추출한 수지상세포에 3단계 당쇄화 개선된 GA733-Fc 단백질을 처리하여 수지상세포의 성숙을 유도하고 대장암세포가 투여된 마우스에 첨가하여 1, 2, 3단계 당쇄화 개선된 GA733-Fc 단백질(GA733-Fc + GalT, GA733-Fc + XylT/FucT KD, GA733-Fc + GalT + XylT/FucT KD 단백질)에 의한 종양의 성장에 미치는 영향을 검증함.
- 당쇄화 변형된 GA733-Fc 단백질이 첨가된 배지에서 성숙이 유도된 수지상세포가 투여된 경우 PBS 대조군 및 정상적인 GA733-Fc 단백질이 처리된 수지상세포 처리군에 비해 종양의 성장이 억제되었음.
- 또한 당쇄화 개선된 GA733-Fc 단백질의 종양성장 억제 효과를 검증하기 위해 GA733-Fc 단백질 및 1, 2, 3단계 당쇄화 변형된 GA733-Fc 단백질을 실험동물 마우스의 복강 면역하여 항체의 생성을 유도하고 대장암 CT-26 세포를 피하 주사를 하여 종양의 성장을 유도하고 GA733-Fc 단백질에 의한 종양 성장 억제 효과를 확인함.
- GA733-Fc 단백질이 면역된 실험동물 마우스에서 대장암 CT-26 세포에 의한 종양 성장은 대조군 PBS에 비해 억제되었고 가장 큰 억제 효과는 GA733-Fc + GalT 단백질이 면역된 실험동물 마우스에서 보였음.
- 당쇄화 개선된 GA733-Fc 단백질의 in vivo 급성 독성 평가를 위한 동물실험에서 GA733-Fc 단백질의 과량 투여에 의한 시각적인 이상 증상, 체중 저하, 장기 이상 등의 증상은 관찰되지 않았음.

제 2협동: 식물유래 암항원을 이용한 대장암 경구백신 실용화기반기술개발 및 대장암 백신생산 형질전환 토마토 품종개발
1. 대장암백신 생산 형질전환 토마토 개발
- 다양한 식물발현벡터들 중에서 GA733단백질이 발현되는 것은 pBINPLUS 와 clean vector였고, ER signal peptide와 ER retention codon이 반드시 있어야 안정적으로 발현되고 또 축적되는 것으로 확인됨.
- Ammonium sulfate를 처리하여 농도별 구간의 단백질을 얻었고, 그 중 가장 많은 해당 단백질이 있는 구간은, GA733 단백질은 50~70%, GA733-Fc는 25~50%, Fc 단백질은 25~70%임.
- pBINPLUS vector backbone으로 하고, 식물 전신 발현 프로모터인 35S 프로모터에 의해 유전자의 발현이 조절되며, ER targeting이 되도록 하는 조건의 식물발현벡터를 제작하여 실험용토마토인 Micro Tom에 형질전환을 하였고, 항생제 배지를 통해 1차선별된 형질전환 토마토의 잎에서 genomic DNA를 추출하여 specific primer를 이용해 PCR을 수행하여 2차선별을 진행한 결과, 35S사A733-Fc 형질전환 Micro Tom은 총 20 line을, 35S/Fc 형질전환 Micro Tom은 총 13 line이 선별됨.
- 35S/GA733-Fc 형질전환 Micro Tom의 잎에서 단백질 발현율을 확인 한 결과, 모든 형질전환 토마토에서 GA733-Fc 단백질이 발현되었음을 알 수 있었고, 그 중 가장 높은 발현율을 보인 TG 13의 GA733-Fc 단백질의 발현율은 43.21 ㎍/fresh weight(g) 임을 확인함.
- 35S/Fc 형질전환 Micro Tom의 잎에서 단백질 발현율을 확인 한 결과, 모든 형질전환 토마토에서 human Fc 단백질이 발현되었음을 알 수 있었고, 그 중 가장 높은 발현율을 보인 TG 5의 human Fc 단백질의 발현율은 5.23 ㎍/fresh weight(g) 임을 확인하였다.
- 2차선별 된 형질전환 토마토 중에서 잎에서의 단백질 발현율이 높고 열매가 충분한 pBINPLUS + 35S/GA733-Fc TG 1-1 과 pBINLUS + 35S/human Fc TG 20의 열매를 수확하여 타겟단백질의 발현율을확인한 결과, pBINPLUS + 35S/GA733-Fc TG 1-1 은 1.25ng/fresh weight(g), pBINLUS + 35S/human Fc TG 20은 0.27 ng/fresh weight(g) 으로 측정됨.
- 실험용 토마토인 Micro Tom, 상용화 품종(고정종) 인 C, M, N line의 bialaphos 농도별 생존율 실험을 수행한 결과, Micro Tom, M line, C line은 2 mg의 농도가, N line은 1 mg의 농도가 가장 적합한 것으로 판단됨.
- 형질전환 식물체의 상용화를 용이하게 하기 위한 Clean vector를 back bone으로 하고, 토마토 열매 특이 발현 프로모터인 S1HD 프로모터에 의해 유전자의 발현이 조절되며, ER targeting이 되도록 하는 조건의 식물발현벡터를 제작하여 식물발현백터를 제작하여 상용화 토마토인 M line에 형질전환을 하였고, 항생제 배지를 통해 1차선별된 형질전환 토마토의 잎에서 genomic DNA를 추출하여 specific primer를 이용해 PCR을 수행하여 2차선별을 진행한 결과, S1HD/GA733-Fc 형질전환 M line은 총 1 line을, S1HD/Fc 형질전환 M line은 총 7 line이 선별됨.
- 최종 선별된 형질전환 토마토의 열매를 수확하여, S1HD/GA733-2 형질전환 M line 1개, 35S/GA733-2 형질전환 Micro Tom 3개, 35S/GA733_Fc 형질전환 Micro Tom 7개, 35S/Fc 형질전환 Micro Tom 1 개의 seed를 확보하였고, 현재 지속적으로 seed 확보중임.
2. 식물유래 암항원을 이용한 대장암 경구용 백신 실용화 기반기술 개발
- 식물유래 GA733, GA733-Fc에 의해 면역세포들의 염증 사이토카인들의 발현이 증가되었으며, 신기능성 수용체단백질들의 발현 변화에 의해 염증 사이토카인들의 유전자 발현이 조절되었음.
- 암세포 killing 능력 또한 식물유래 GA733, GA733-Fc에 의해 증가되었으며, 신기능성 수용체단백질들의 발현 변화에 의해 암세포 killing 능력이 조절되었음. 식물유래 표적단백질들에 의해 면역세포들의 활성이 증진되어 면역세포의 침윤능력 및 항원제시능력 또한 증가되었으며, 신기능성 수용체단백질들의 발현 변화에 의해 조절되었음.
- WT 마우스에 식물유래 GA733 및 GA733-Fc를 투여한 결과, 대장에서 GA733에 특이적인 IgA의 생산능력이 증진되었음. 이를 통해 식물유래 표적단백질들에 의해 면역세포들의 활성이 증진되며, 신기능성 수용체단백질인 Axl 및 TREM2에 의해 그 활성이 조절됨을 알수 있었음.
- 식물유래 GA733, GA733-Fc 및 신기능성 수용체단백질들에 의한 항암효능을 검증하기 위해, 사람 및 마우스 대장암 세포주에 식물유래 표적단백질들을 처리하여 세포성장 및 세포사멸, 세포주기를 조절하는 유전자의 발현을 확인하였음. 그 결과, 식물유래 GA733-Fc를에 의해 세포사멸을 유도하는 유전자들의 발현이 증가되었으며, 세포주기를 증가시키는 유전자의 발현은 감소되었음.
- 이에 유세포 분석기를 이용하여 세포주기 및 세포사멸을 확인한 결과, 식물유래 GA733-Fc에 의해 세포주기가 감소되었으며, 세포사멸이 증가됨을 알 수 있었음. 대장암 세포주들의 암세포 이동 및 전이능력 또한 식물유래 GA733-Fc에 의해 감소되었음. 이를 통해 식물유래 GA733-Fc가 암세포의 증식 및 전이능력을 감소시킴으로써 항암효능을 효과적으로 작용함을 알 수 있었음.
- 식물유래 표적단백질들의 in vivo 투여조건을 확립하기 위해 KFDA 의약품등의 독성시험 기준을 바탕으로 독성 및 안전성 시험을 실시한 결과 500 ㎍/100 신의 농도로 결정하였음.
- IBD 마우스 모델에서 신기능성 수용체단백질들인 TREM2 및 Axl의 항염효능을 확인한 결과, WT 마우스 그룹과 비교하여 TREM2 과발현 마우스 그룹에서 대장조직 및 염중사이토카인들의 발현이 중가됨을 알 수 있었지만 Axl KO 마우스 그룹의 경우 대장조직의 손상 및 염증작용 변화에 큰 영향을 미치지 못함을 알 수 있었음.
- 이 결과를 통해 대장염 및 대장암 마우스 모델에서 식물유래 GA733-Fc 및 신기능성 수용체단백질인 TREM2에 의한 항염/항암 효능을 검증하였음.
- IBD 마우스 모델에서 식물유래 GA733-Fc의해 IBD가 완화되었음. 초기 선천성 면역세포 들의 활성이 증의 생산능력이 증진되었음. 또한 신기능성 수용체단백질인 TREM2의 과발현으로 선천성 면역세포들의 활성이 조절되며, 이후 후천성 면역세포들의 활성 또한 조절되는 결과를 확인함.
- 대장암 마우스 모델에서 식물유래 GA733-Fc 및 TREM2에 의한 항암효능을 확인한 결과, 식물유래 GA733-Fc에 의해 암세포의 volume 및 mass가 감소됨을 알 수 있었으며, 암세포의 세포사멸 및 관련 유전자들의 발현 또한 증가되었음.
- 이를 통해 면역세포들의 활성을 확인한 결과, 면역세포의 항원 제시능력이 증가되었으며, 면역세포의 침윤능력 또한 증가되었음. 유세포 분석기를 이용하여 각 장기별 활성화된 면역세포들의 변화를 확인한 결과, 활성화된 CD4+ 및 CD8+ T cell, NK cell이 증가되었으며, 대장암 조직에서 활성화된 면역세포들이 증가됨을 통해 대장암 조직으로 활성화된 면역세포들이 이동하여 암세포를 killing함으로써 항암효과를 보이는 것으로 생각됨. 이러한 결과는 WT 마우스 그룹과 비교하여 TREM2 TG 마우스 그룹에서 보다 효과적임을 알 수 있었음.
- IBD 마우스 모델에서 식물유래 GA733-Fc, 신기능성 수용체단백질인 TREM2 및 면역보조제에 의한 항염 효능을 확인한 결과, 식물유래 GA733-Fc를 면역보조제를 함께 투여할 시 단독투여에 비해 IBD가 완화되었으며, 염증사이토카인들의 유전자 발현 또한 면역보조제를 함께 투여할 시 감소되었음.
- 각 장기별 면역세포들을 분석한 결과 IBD에 의해 감소된 CD4⁺ T cell, CD8⁺ T cell, CD8 regulatory T cell 및 NK cell뿐만 아니라 과립세포 및 대식세포가 증가되었으며, 면역보조 제에 의해 그 효과가 증진됨을 확인함.
- WT 마우스 그룹과 비교하여 신기능성 수용체단백질인 TREM2 TG 마우스 그룹이 면역 세포들의 활성에 보다 민감하게 작용하며, IBD 유도시 염증질환이 심각하게 발생함을 알수 있었음. TREM2 TG 마우스 그룹 또한 식물유래 GA733-Fc 단독투여에 비해 면역보조제를 함께 투여할 시 IBD가 완화됨을 알 수 있었음.
- 대장암 마우스 모델에서 식물유래 GA733-Fc, 신기능성 수용체단백질 TRME2 및 면역보조제에 의한 항암 효능을 확인한 결과, 식물유래 GA733-Fc 단독투여에 비해 면역보조제를 함께 투여할 시 암세포의 volume 및 mass가 감소됨을 알 수 있었으며, 암세포의 세포사멸 및 관련 유전자들의 발한 또한 증가되었음. 이를 통해 각 장기별 면역세포들의 변화를 확인한 결과, 식물유래 GA733-Fc 및 면역증진 보조제에 의해 CD4⁺ T cell 및 CD8⁺ T cell, NK cell이 증가됨을 알 수 있었음. 이러한 결과는 WT 마우스 그룹과 비교하여 TREM2 TG 마우스 그룹에서 보다 효과적이었으며, 이는 식물유래 GA733-Fc, 면역보조제 및 신기능성 수용체단백질인 TREM2의 상호작용을 통해 항암효능을 더욱 증가시킴을 알 수 있었음.
- 대장암 마우스 모델을 이용하여 GA733-Fc를 발현하는 토마토 열매의 경구투여에 의한 항암효능을 검증하였음. 그 결과, GA733-Fc를 발현하는 토마토 열매의 경구투여에 의해 암조직의 volume 및 mass가 감소되었으며, 암 조직의 세포사멸 및 면역세포의 암세포 killing 능력이 증진되었음. 각 장기별 활성화된 면역세포들의 변화를 확인한 결과, 대장암에 의해 감소된 면역세포들이 GA733-Fc를 발현하는 토마토에 의해 증가되었으며, 이는 GA733-Fc 토마토를 섭취함으로써 대식세포의 활성이 증진되고, 그 결과, T cell 및 NK cell의 활성이 증가된 것으로 생각됨. 또한 활성화된 면역세포들이 암조직으로 이용하여 대장암 조직의 세포사멸을 증가시킴으로써 대장암에 대한 항암효능을 보임을 알 수 있었음.


(출처 : 요약문 4P)

Abstract ▼

IV. Research development results
The 1^st project : Obtaining seed bank of homozygous line through mass cultivation of GA733-Fc transgenic plant for colorectal cancer antigen - antibody recombinant protein and preventive recombinant vaccine commercialization with colorectal cancer preve

IV. Research development results
The 1^st project : Obtaining seed bank of homozygous line through mass cultivation of GA733-Fc transgenic plant for colorectal cancer antigen - antibody recombinant protein and preventive recombinant vaccine commercialization with colorectal cancer preventive dendritic cell vaccine efficacy verification
- Vaccine protein expression was confirmed in transgenic plant that expressed GA733-Fc with KDEL. The gene expression confirmed through random selection of mass cultivated transgenic plant in greenhouse.
- For production of large quantities GA733-Fc and the GA733-Fc with KDEL vaccine protein transgenic plant leaves was harvested from the transgenic plants in green house.
- Construction of seedbank of homozygous transgenic plant line expressing GA733-Fc with KDEL for plant-derived GA733-Fc with KDEL commercialization.
- Plant-derived GA733-Fc with KDEL was successfully purified using Protein G affinity column.
- Glycan structure analysis result of plant-derived GA733-Fc with KDEL has high percentage of high-mannose type glycan structure due to ER retention signal(KDEL) effect.
- We confirmed that purify of plant GA733-Fc with KDEL were similar to the mammalian-derived GA733-Fc using SDS-PAGE
- Result of surface plasmon resonance assay(SPR) of plant-derived GA733-Fc with KDEL confirmed that the plant-derived GA733-Fc with KDEL has antgen-antibody binding activity to anti-GA733 antibodies
- Mice model experiment result of dendritic cell germinal center(GC) B cells analysis in spleen showed that B cell activation marker Fas and GL-7 factors were expressed in mice immunized with plant-derived GA733-Fc with KDEL more than mice immunized with mammalian-derived GA733-Fc.
- Analysis result of cytokine factor amount from mice spleen injected with plant-derived GA733-Fc with KDEL mice confirmed that Th2 cell differentiation mediated IL-4 and IL-10 were highly expressed in mice immunized with plant-derived GA733-Fc with KDEL more than the mammalian-derived GA733-Fc immunized mice.
The 1^st co-project: Technology development and toxicity tests that can maximize the therapeutic effect of GA733-Fc with glycan structure modification.
- In overexpressed GalT gene of GA733-Fc GalT protein tobacco many high mannose type glycan structures, has been observed compared with tobacco plant derived-GA733-2 proteins.
- Dendritic cell treatment in GA733-Fc protein contained culture medium showed the tumor cell growth inhibition and GA733-Fc GalT protein contained culture medium showed more tumor growth inhibition than the GA733-Fc.
- In vitro GA733-Fc protein was purified from transgenic tobacco for toxicity tests with respect to the fact that GA733-FcGalT does not have a cell toxicity.
- β-1,2-xylosyltranshrase (XylT) and α-1,3-ficosyltrms&rase (FucT) gene knock-down in transgenic plants were confirmed by RT-PCR
- pFGC5941/XylT-FucT RNAi expression vector was transferred into the plant using Agrobacterium, and the expression of GA733-Fc XylT/FucT KD protein and purification using Protein A agarose bead-affinity chromatograph were conducted.
- In the XylT and FucT gene knock-down, and GalT gene overexpressed GA733-Fc plants (GA733-Fc GalT XylT / FucT KD), chemical structure of protein production and the sugar MALDI-TOF were confirmed
- The effect of the three-phase glycosylation improved GA733-Fc protein to induce the maturation of dendritic cells was verified on tumor growth in mice where colon cancer cells were added with administation of one, two, three steps glycosylation improved GA733- Fc protein (GA733-Fc GalT, GA733-Fc XylT / FucT KD, GA733-Fc GalT XylT / FucT KD protein)
- In mice treated with glycan modified GA733-Fc protein-induced maturing dendritic cells in medium supplemented PBS, the inhibition of tumor growth was higher compared to the control group and normal GA733-Fc protein-induced dendritic cells
- In addition, the tumor growth inhibitory effect of 1, 2, 3 step glycomodified GA733-Fc protein for the production of antibodies were verified in experimental animals by intraperitoneal immunization mouse with the glycomodified GA733-Fc protein and subcutaneous injected with the CT-26 colon cancer cells inducing tumor growth
- Tumor growth of CT-26 colon cancer cells was inhibited by in GA733-Fc protein immunized animals compared to the control PBS, and the greatest inhibitory effect was observed in GA733-Fc GalT proteins immunized animals
- GA733-Fc protein with improved glycosylation in vivo visual symptoms were not observed by overdose of GA733-Fc protein in animal tests including acute toxicity, decreased weight, negative symptoms, such as organ side effects

The 2^nd co-project: Development of plant-derived edible cancer vaccine candidate commercialization technology and production of colorectal cancer vaccine expressed transgenic tamato plants
1. Production of colorectal cancer vaccine expressing transgenic tamato plants
- Efficient ammonium sulfate concentration for plant-derived GA733 protein precipitation was 50 to 70%, GA733-Fc was 25 to 50% and Fc region protein was 25 to 70%, respectively
- Expression of GA733-Fc protein in transgenic tomato plant was confirmed. The expression of GA733-Fc protein in TG-13 plant showed the highest expression rate, 43.21 ug / fresh weight (g), and human Fc protein in TG-5 expression rate was confirmed that 5.23 ug/fresh weight (g).
- Finally, we harvested the transgenic tomato seeds from one S1HD/GA733-2 M line, three 35S/GA733-2 Micro Tom, seven 35S/GA733-Fc Micro Tom, one 35S/Fc Micro Tom varieties.
2. Development of plant-derived edible cancer vaccine candidate commercialization technology
- Expression of imflammatory cytokines were increased by plant derived GA733 and GA733-Fc，respectively. The expression of imflarnmatory cytokine genes were ragulated by functional receptor proteins.
- Immune cells activity was increased by plant-derived target proteins and Infiltration of immune cells and antigen-presenting ability was also increased.
- In plant-derived GA733 and GA733-Fc immunized mice was increased GA733 specific IgA expression. Immune cells activity was increased by plant-derived target protein. The activity of immune cells regulated by functional receptor protein Axl and TREM2, respectively.
- In mouse experiments for anti cancer activity confirmation, the reduc社on of cell cycle and increases of apoptosis were observed in plant derived GA733, GA733-Fc and functional receptor proteins immunized mouse models.
- Migration and metastasis abilities of colorectal cancer cell line also were reduced by the plant-GA733-Fc. These results confirmed that the plant-GA733-Fc effectively induced the reduction in the growth and metastasis ability of cancer cells.
- The result of anti-imflammatory in TREM2 and Axl over-expressed mice group were confirmed that colon tissue imflammatiy cytokines expression was increased in TREM2 over-expression mice group. However, in Axl KO over-expressed mice group, colon tissue damage and inflammatory activity did not significantly change.
- Imflarnmatory Bowl Disease (IBD) was mitigated by GA733-Fc in IBD mouse model. The activity of early innate immune cells and CD4 T cell growth and subsequent CD8 T cell, NK cell, B cell activity of immune cells, such as increased number of acquired immune cells was promoting the production capacity of IgA. New functional ac社vity of receptors and the regulation of innate immune cells to overexpress a protein TREM2, must confirm regulate the activity of the acquired immune cells.
- Anti-cancer efficacy by the plant-GA733-Fc and TREM2 in mouse models of colon cancer were confirmed. The volume and mass of the tumor was reduced by The plant-derived GA733-Fc, and expression of apoptosis-related genes in cancer cells was increased.
- In IBD mouse model, an anti-inflammatory effect by the TREM2 and the group treated with adjuvant were higher with the plant-derived GA733-Fc with an adjuvant, gene expression of inflammatory cytokines was reduced when administered with an adjuvant.
- Anti-cancer efficacy by plant-derived GA733-Fc，TRME2 and adjuvant colon cancer mouse model TREM2 TG mice group was higher. Plant derived-GA733-Fc increased was also more the anti cancer efficacy through interaction with the adjuvant and TREM2.
- Oral administration of the tomato fruit expressing GA733-Fc reduced the volume and mass of the tumor tissue, thereby increasing the ability of the cancer cell death and apoptosis in cancer tissues.


(출처 : SUMMARY 14P)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제 출 문 ... 2
• 요 약 문 ... 3
• SUMMARY ... 12
• CONTENTS ... 20
• 목차 ... 21
• 제1장 연구개발과제의 개요 ... 22
• 제1절 연구개발의 필요성 ... 22
• 제2장 국내외 기술개발 현황 ... 30
• 제1절 국·내외 기술정보동향 ... 30
• 제3장 연구개발 수행 내용 및 결과 ... 35
• 제1절 연구범위 및 연구수행 방법 ... 35
• 제2절 세부연구수행 결과 ... 52
• 1. 1년차 세부연구수행 결과 ... 52
• 2. 2년차 세부연구수행 결과 ... 84
• 3. 3년차 세부연구수행 결과 ... 133
• 제4장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 172
• 제1절 연구개발의 목표 및 연구개발 수행내용 ... 172
• 제5장 연구개발 성과 및 성과활용 계획 ... 179
• 제1절 연구개발 성과 ... 179
• 제2절 연구개발 성과 활용계획 ... 185
• 끝페이지 ... 187