[논문]베타아밀로이드가 신경세포에 미치는 염증 작용 연구

장선아; 구현정; 강세찬; 손은화; 남궁승

doi:10.7841/ksbbj.2013.28.4.230

베타아밀로이드가 신경세포에 미치는 염증 작용 연구
Effects Amyloid Beta Peptide on the Inflammatory Response in Neuronal Cells 원문보기

KSBB Journal, v.28 no.4, 2013년, pp.230 - 237

장선아 (가천대학교 생명과학과) , 구현정 (가천대학교 생명과학과) , 강세찬 (가천대학교 생명과학과) , 손은화 (강원대학교 생약자원개발학과) , 남궁승 (강원대학교 물리치료학과)

Abstract ▼ AI-Helper

Amyloid ${\beta}$ peptide (A${\beta}$) still best known as a molecule to cause Alzheimer's disease (AD). AD is characterized by the accumulation and deposition of A${\beta}$ within the brain, leading to neuronal cell loss and perturbation of synaptic function by causing free radical formation, inflammation and apoptosis. We investigated the inflammatory action of A${\beta}$ on two types of brain cells, neuronal cells (SH-SY5Y) and neuroglia cells (C6), and its mechanism. We measured the production of NO-iNOS, TNF-${\alpha}$, and ICAM-1 using RT-PCR and Western blot analysis less than the concentration of cytotoxic effects (> 70% survivability). A${\beta}$ had no effect on the production of NO and TNF-${\alpha}$, but significantly increases of iNOS and ICAM-1. Based on this, we suggest that the inflammatory effect of A${\beta}$ results from the action of ICAM-1 in neuronal cells, rather than the release of inflammatory mediators such as NO and TNF-${\alpha}$ in neuroglia cells. In addition, we confirmed whether p53 was related to the action of A${\beta}$ by using SH-SY5Y ($p53^{-/-}$) dominant cells. Neither the expression of p53 nor the cytotoxicity of SH-SY5Y ($p53^{-/-}$) cells were directly affected by A${\beta}$. However, ICAM-1 was not expressed in SH-SY5Y ($p53^{-/-}$) cells. This means that p53- independent pathway exists in the expression of ICAM-1 by A${\beta}$ while p53 plays a role as an on-and-off switch.

주제어

AI 본문요약
AI-Helper

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문제 정의

따라서 본 실험에서는 Aβ가 신경교세포의 활성화와 NO와 iNOS의 생성에 영향을 미치는지 알아보았다.
따라서 본 연구에서는 뇌를 이루는 두 가지 종류의 세포, 즉 신경실질세포주 (neuronal cell) SH-SY5Y와 신경교세포주 (neuroglia cell) C6를 이용하여 Aβ의 침착이 세포사멸을 일으키지 않는 범위에서 신경계 세포에 미치는 영향을 염증반응과 관련된 마커와 작용 기전을 중심으로 이루어졌으며, 향후 Aβ의 침착에 의한 뇌질환 치료에 대하여 선택적인 염증반응 억제제 개발과 기전 규명에 기여하고자 하였다.
본 연구는 세포독성이 크게 나타나지 않는 범위에서의 염증반응을 연구하고자 하였으므로, 향후 염증성 마커의 분비와 발현 및 관련 작용기전의 연구를 Aβ 농도 1, 10 μg/mL에서 진행하였다.
본 연구에서는 Aβ가 신경세포의 손상과 염증을 일으키는 과정에서 나타나는 ICAM-1 단백질의 발현에 p53 유전자의 관련성을 확인하고자 하였다.

제안 방법

1X reaction buffer, 2 mM MgSO4, 0.04 μg/μL template RNA, 0.2 μM primer, 0.5 μL/25 μL RT/platinum Taq mix의 조성으로 25 μL의 volume으로 최적조건을 나타내는 cycle로 반응하였다.
Aβ의 침착이 신경교세포를 직접 활성화하여 TNF-α를 분비하는지 알아보기 위하여 RT-PCR법을 이용하여 TNF-α mRNA 발현량을 측정하였다.
PCR 반응이 종결된 후 product 중 5 μL를 2% agarose gel에서 전기영동하고 band를 확인하였다.
SK-SH5Y 세포를 60 mm 배양접시에 2 × 106 cells/mL의 밀도로 배양하고, DMEM 배양액을 사용하여 control siRNA 또는 siRNA-p53을 각각 FuGENE HD transfection reagent (Promega, Madison, WI)와 1:3 비율로 섞고 상온에서 15분간 두었다가 세포에 24시간 동안 처리하였다.
Trizol reagent (Invitrogen, Grand Island, NY)를 이용하여 kit에서 제공하는 방법에 따라 total RNA를 추출하였다. 이때 추출된 total RNA는 UV spectrophotometer를 이용하여 1 μg/μL의 농도로 정량하고 추출된 total RNA는 Superscript one-step RT-PCR with platinum Taq kit (Invitrogen, Grand Island, NY)을 이용하여 mRNA 발현량을 측정하였다.
이는 신경세포에서 나타난 Aβ에 의한 ICAM-1 단백질의 발현 과정에는 p53-independant 경로가 존재함을 의미한다. p53 유전자 관련성을 확실히 규명하고자 SH-SY5Y (p53^-/-) 돌연변이 세포주를 확립하여 베타아밀로이드에 대한 세포독성을 확인하였으며, ICAM-1 단백질의 발현도를 측정하였다. SH-SY5Y (p53^-/-)는 wild type의 대조군에 비하여 Aβ 처리에 의한 세포독성변화에 영향을 미치지 않았으나 (Fig.
본 실험에서는 합성 Aβ를 염증반응 유발물질로 사용하기 위하여 2가지 타입의 신경계 세포에 적용하기 위한 Aβ의 농도를 설정하였다.
총 25 μg의 단백질을 10% SDS-PAGE gel에 전기영동한 다음 nitrocellulose membrane으로 옮긴 후, membrane을 1시간 동안 상온에서 5% skim milk로 block 처리한 후 primary antibody를 1시간 동안 상온에서 처리하였다. 세척 후 HRP-conjugated secondary antibody를 1시간 동안 상온에서 처리하고 ECL 용액을 가한 후 필름에 노출시켜 확인하였다.
이때 추출된 total RNA는 UV spectrophotometer를 이용하여 1 μg/μL의 농도로 정량하고 추출된 total RNA는 Superscript one-step RT-PCR with platinum Taq kit (Invitrogen, Grand Island, NY)을 이용하여 mRNA 발현량을 측정하였다.

대상 데이터

본 방법은 Hu 등 [24]이 제안한 방법을 참고하여 제조하였고, Aβ (1-42) peptide는 Sigma-Aldrich사 (St. Louis, MO)에서 구입하였다.
사람신경모세포종 (human neuroblastoma)인 SH-SY5Y와 쥐신경교세포 (rat glioma cells)인 C6 세포주는 한국세포주은행 (Korean cell bank, Seoul, Korea)에서 구입하였고, 10% fetal bovine serum, penicillin (50 U/mL), streptomycin (100 ug/mL)이 포함된 Dulbecco's modified eagle medium (DMEM)을 사용하였으며, 5% CO2와 37℃의 배양조건에서 배양하였다.

데이터처리

모든 자료는 mean±S.E.M으로 표시하였고, 각 실험군 간 유의성은 Student's t-test로 검증하여 p-value가 0.05 이하인 경우를 통계적으로 유의한 것으로 판정하였다.

이론/모형

(B) p53 siRNA transfeceted cells were treated with various concentrations of Aβ for 24 h. The cytotoxicity were assessed by MTT assay. Cell density was measured at a wavelength of 540 nm.
세포를 24시간배양한후상층액중의 NO 생성농도를 Ding 등[26]의 방법에 따라 측정하였다. 100 μL 상층액을 취하여 96 well plate에 옮긴 후 각각의 well에 100 μL의 Griess 시약을 가하여 5분간 반응 후 microplate reader로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

성능/효과

Aβ가 신경세포 및 신경교세포에 독성을 일으키지 않는 범위(생존률 > 70%)에서 각 두 가지 타입의 세포에 처리하여 염증 유발 요소들을 측정한 결과 Aβ는 신경교세포를 활성화하여 NO 및 TNF-α를 증가시키기보다는 신경세포를 자극하여 염증관련세포를 염증부위에 모이게 함으로써 염증반응을 확대하는 주요 요인이 되는 세포부착분자 ICAM-1 단백질의 합성을 증가시키는 것으로 생각된다.
따라서 본 연구에 사용된 Aβ가 신경세포의 ICAM-1 단백질의 발현에 영향을 미치는지 확인하였으며, Aβ에 의해 ICAM-1 단백질의 발현이 농도 의존적으로 증가하였으며 유의적인 차이를 보였다 (Fig. 4).
또한, 동맥경화증에 있어서 인간 섬유아세포와 혈관평활근세포에서도 p53을 경유한 ICAM-1의 발현이 나타남을 보고하였다. 본 연구 결과에서도 p53 결핍 SH-SY5Y 신경모세포에 있어서 ICAM-1의 발현이 나타나지 않았으며, 이는 p53 유전자가 ICAM-1의 발현에 필수적인 역할임을 보여준 것이다. 그러나 신경세포의 ICAM-1의 발현에 있어서 p53의 유전자는 on-and-off switch 역할을 하는 필수요소로 생각되지만, Aβ 자극에 의한 ICAM-1 단백질 발현 조절에는 또 다른 p53 비의존적인 경로가 존재한다.
실험 결과, Aβ는 NO의 분비를 증가시키지 않았지만, iNOS의 mRNA 및 단백질 발현량을 유의적으로 증가시켰다 (Fig. 2).

후속연구

이는 Aβ에 의한 ICAM-1 단백질의 발현에는 p53-independent pathway가 존재하는 것을 의미하지만 p53은 ICAM-1 단백질의 발현에 있어서 on-off switch 역할을 하는 결정적인 역할을 하는 것으로 보인다. 본 연구결과는 Aβ 침착에 의한 알츠하이머병의 염증 치료에 있어서 ICAM-1 단백질의 억제적 조절기전을 가진 치료제 개발에 기초자료로 제공될 수 있다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	알츠하이머병이란 무엇인가?	알츠하이머병 (Alzheimer's disease; AD)은 기억과 인지에 손실을 주는 퇴행성 뇌질환 (degenerative disease) 중의 하나이다. 알츠하이머병의 주요한 원인은 베타아밀로이드 (amyloid β; Aβ) 펩타이드 (peptide)의 응집으로 인한 뇌세포의 사멸로 알려져 있다 [1,2].
	AD의 주요 원인은 무엇인가?	정상상태의 뇌에서 astrocyte 및 미세아교세포 등의 신경교세포는 신경세포의 분화에 필요한 영양인자로서 cytokine들을 미량 분비함으로써 뇌의 생체 항상성을 유지하는데 기여하지만, 뇌손상에서 제일 먼저 병변부위에 나타나는 신경계 세포는 미세아교세포로 astrocyte의 주요자극인자인 IL-1, TNF를 생산하여 astrocyte를 활성화시키고 [18,19], 자극된 astrocyte는 IL-6, IL-8, TNF, GMCSF (colony-stimulating factor), IL-5 등의 cytokine을 생성시키고 ROS (reactive oxygen species) 활성요소의 일종인 peroxinitrite 등을 유도함으로써 신경세포의 사망을 유도한다. AD의 주요 원인으로 알려진 노화과정에서도 뇌는 proinflammatory state (전-염증 상태)로의 전환이 보고되고 있으며, 노화 환경에서 TNF-α, IL-1β, IL-6와 같은 염증성 cytokine의 분비와, 신경교세포의 활성화로 인한 매우 독성이 강한 ROS/RNS (reactive nitrogen species) 생성과 단백분해효소, 보체기전 등의 활성이 증가됨으로써 근접해 있는 신경의 손상이나 신경세포 사멸을 일으키게 된다고 설명하고 있다[20,21]. 실제로 Ibuprofen (BRUFEN) 등의 NSAIDs (nonsteroidal anti-inflammatory drugs)의 염증 치료제가 AD의 발병률이나 진행을 감소시킨다고 보고되었으며, 이미 AD 환자에게 장기처방이 이루어지고 있어 임상적으로도 인정되고 있다 [22].
	신경교세포의 활성화로 인하여 생성되는 염증반응은은 어떻게 신경세포를 사멸시키는가?	뇌의 신경교세포의 활성화로 인하여 생성되는 염증반응 cytokine에 의해 신경세포의 사멸이 촉진된다는 것이다. 정상상태의 뇌에서 astrocyte 및 미세아교세포 등의 신경교세포는 신경세포의 분화에 필요한 영양인자로서 cytokine들을 미량 분비함으로써 뇌의 생체 항상성을 유지하는데 기여하지만, 뇌손상에서 제일 먼저 병변부위에 나타나는 신경계 세포는 미세아교세포로 astrocyte의 주요자극인자인 IL-1, TNF를 생산하여 astrocyte를 활성화시키고 [18,19], 자극된 astrocyte는 IL-6, IL-8, TNF, GMCSF (colony-stimulating factor), IL-5 등의 cytokine을 생성시키고 ROS (reactive oxygen species) 활성요소의 일종인 peroxinitrite 등을 유도함으로써 신경세포의 사망을 유도한다. AD의 주요 원인으로 알려진 노화과정에서도 뇌는 proinflammatory state (전-염증 상태)로의 전환이 보고되고 있으며, 노화 환경에서 TNF-α, IL-1β, IL-6와 같은 염증성 cytokine의 분비와, 신경교세포의 활성화로 인한 매우 독성이 강한 ROS/RNS (reactive nitrogen species) 생성과 단백분해효소, 보체기전 등의 활성이 증가됨으로써 근접해 있는 신경의 손상이나 신경세포 사멸을 일으키게 된다고 설명하고 있다[20,21].

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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