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문제 정의
- 또한 대장균에서 상대적으로 발현이 용이한 GFP와 외래단백질인 AFP를 융합함으로서, AFP의 발현량도 증가시키고자 한다. 그리고 재조합 GFP-AFP chimera (복합체) 발현 후 단백질의 어는점을 분석하여 동결방지특성을 확인하고자 한다.
- 따라서 본 연구에서는 유전자 재조합을 통하여 AFP단백질을 대량 생산할 수 있는 시스템을 개발하며, 특히 AFP유전자와 형광단백질인 green fluorescence protein (GFP)를 결합하여 단백질의 발현을 시각적으로 더 쉽게 확인할 수 있는 시스템을 구축하고자 한다. 또한 대장균에서 상대적으로 발현이 용이한 GFP와 외래단백질인 AFP를 융합함으로서, AFP의 발현량도 증가시키고자 한다.
- 따라서 본 연구에서는 유전자 재조합을 통하여 AFP단백질을 대량 생산할 수 있는 시스템을 개발하며, 특히 AFP유전자와 형광단백질인 green fluorescence protein (GFP)를 결합하여 단백질의 발현을 시각적으로 더 쉽게 확인할 수 있는 시스템을 구축하고자 한다. 또한 대장균에서 상대적으로 발현이 용이한 GFP와 외래단백질인 AFP를 융합함으로서, AFP의 발현량도 증가시키고자 한다. 그리고 재조합 GFP-AFP chimera (복합체) 발현 후 단백질의 어는점을 분석하여 동결방지특성을 확인하고자 한다.
- 재조합 GFP-AFP chimera 단백질의 동결방지 특성을 파악하기 위하여 이의 정제연구를 수행하였다. 효율적인 정제를 위하여 afp 유전자의 말단에 polyhistidine tag를 삽입하였다(Fig.
제안 방법
- Clupea harengus (afp11), Liparis atlanticus (afp15), Myoxocephalus octodecemspinosus (afp16) 유래의 3종의 afp 유전자를 재조합하였으며 사용한 oligonucleotide의 염기서열은 Table 2에 정리하였다. 3종의 afp 유전자와 gfp 유전자는 polymerase chain reaction (PCR)기법을 통하여 확보하였다.
- 본 연구진은 AFP 단백질의 동결방지특성과 GFP 형광단백질의 특성을 이용하여 단백질의 발현을 시각적으로 확인 가능한 GFP-AFP chimera 단백질 생산시스템을 제작하였다. GFP-AFP chimera 단백질 생산시스템을 E. coli에 도입하여 E. coli의 빠른 번식 특성을 이용하여 재조합 단백질을 대량생산하였다. AFP 단백질의 경우 고가이기 때문에 가스 하이드레이트 저해제로써의 산업 적용이 현실적으로 불가능하였다.
- 1 mM 농도의 단백질용액의 어는점을 Differential Scanning Calorimeter (DSC)를 이용하여 측정하였다. GFP-AFP chimera 단백질의 대조군으로 비교하기 위하여 증류수, GFP 단백질의 어는점을 측정하였다.
- 또한 AFP의 단독발현이 아닌 GFP 단백질과의 chimera 발현도 단백질의 발현에 영향을 주었을 것이라 고려된다. M. octodecemspinosus 유래의 GFP-AFP chimera의 발현조건을 최적화하기 위하여 다양한 농도의 doxycycline을 첨가하여 이의 영향을 분석하였다 (Fig. 2). 발현유도제인 doxycycline 을 첨가하지 않은 경우, 2시간 동안 균주농도 (OD600)가 0.
- 3종의 afp 유전자와 gfp 유전자는 polymerase chain reaction (PCR)기법을 통하여 확보하였다. PCR은 Expand High Fidelity PCR System (Roche Molecular Biochemicals, Germany)을 이용하여 MJ mini Personal Thermal Cycler (BioRad Laboratories, USA)에서 수행하였다. KpnI, SalI 제한 효소를 사용하여 gfp 유전자를 pZE21MCS 플라스미드에 삽입하였다.
- KpnI, SalI 제한 효소를 사용하여 gfp 유전자를 pZE21MCS 플라스미드에 삽입하였다. SalI과 HindIII 제한효소를 사용하여 3종의 afp 유전자를 gfp 유전자 다음부분에 도입하여 pZEGfpAFP11 (C. harengus), pZEGfpAFP15 (L. atlanticus), pZEGfpAFP16 (M. octodecemspinosus) 플라스미드를 제작하였다 (Fig. 1). 제작된 플라스미드를 Escherichia coli BL21 (DE3)균주에 형질전환하여 GFP-AFP chimera 단백질 발현 실험을 수행하였다.
- Spectrofluorimeter의 excitation 파장은 490/10 nm, 그리고 emission 파장은 510/10 nm로 작동하였다. Specific fluorescence intensity (SFI)는 각각의 시점에서 측정한 형광도를 그에 상응하는 600 nm에서 측정한 흡광도로 나눈 값으로 각각의 시료로부터 최소한 3개의 측정치를 구하였다.
- 5에 도달할 때까지 37℃에서 배양하였다. 단백질 발현 유도제인 doxycycline을 주입한 후, 균주농도 및 형광도를 측정하였다. 균주의 성장은 spectrophotometer (Shimadzu, Japan)를 이용하여 600 nm에서 흡광도를 측정하는 것을 통해 확인하였다.
- 본 연구진은 AFP 단백질의 동결방지특성과 GFP 형광단백질의 특성을 이용하여 단백질의 발현을 시각적으로 확인 가능한 GFP-AFP chimera 단백질 생산시스템을 제작하였다. GFP-AFP chimera 단백질 생산시스템을 E.
- 1). 재조합 GFP-AFP chimera 단백질을 1 mM의 doxycycline으로 발현시킨 후, Ni-NTA column를 사용하여 정제하였다. SDS-PAGE로 14.
- 정제된 GFP-AFP chimera 단백질의 동결방지 특성을 확인하기 위하여, 0.1 mM 농도의 단백질용액의 어는점을 Differential Scanning Calorimeter (DSC)를 이용하여 측정하였다. GFP-AFP chimera 단백질의 대조군으로 비교하기 위하여 증류수, GFP 단백질의 어는점을 측정하였다.
- 정제된 GFP-AFP chimera 단백질의 동결방지특성을 확인하기 위하여 DSC를 이용하여 어는점 변화를 관찰하였다. GFP-AFP chimera 단백질의 대조군으로 elution buffer와 GFP 단백질이 사용되었다.
- 1). 제작된 플라스미드를 Escherichia coli BL21 (DE3)균주에 형질전환하여 GFP-AFP chimera 단백질 발현 실험을 수행하였다.
- 재조합 GFP-AFP chimera 단백질의 동결방지 특성을 파악하기 위하여 이의 정제연구를 수행하였다. 효율적인 정제를 위하여 afp 유전자의 말단에 polyhistidine tag를 삽입하였다(Fig. 1). 재조합 GFP-AFP chimera 단백질을 1 mM의 doxycycline으로 발현시킨 후, Ni-NTA column를 사용하여 정제하였다.
대상 데이터
- 정제된 GFP-AFP chimera 단백질의 동결방지특성을 확인하기 위하여 DSC를 이용하여 어는점 변화를 관찰하였다. GFP-AFP chimera 단백질의 대조군으로 elution buffer와 GFP 단백질이 사용되었다. DSC는 시료물질을 가열/냉각시킴으로서 시료의 열 출입을 측정하는 기계이며, 이를 통하여 시료의 발열과 흡열특성을 분석하여 어는점, 녹는점 유리전이온도, 결정화온도 등을 확인할 수 있다.
- PCR은 Expand High Fidelity PCR System (Roche Molecular Biochemicals, Germany)을 이용하여 MJ mini Personal Thermal Cycler (BioRad Laboratories, USA)에서 수행하였다. KpnI, SalI 제한 효소를 사용하여 gfp 유전자를 pZE21MCS 플라스미드에 삽입하였다. SalI과 HindIII 제한효소를 사용하여 3종의 afp 유전자를 gfp 유전자 다음부분에 도입하여 pZEGfpAFP11 (C.
- 유전자 재조합과 단백질 발현에 사용된 균주 및 플라스미드는 Table 1에 정리하였다. 균주배양을 위한 배지는 Luria-Bertani (LB) 배지 (10 g/L bacto-tryptone, 5 g/L bacto-yeast extract and 5 g/L NaCl)가 사용되었다. 항생물질로 kanamycin (30 mg/L)을 첨가하였으며, 균주는 37℃, 200 rpm에서 배양되었다.
- 재조합 GFP-AFP chimera 단백질 유전자를 pZE21MCS에 도입하여 pZEGfpAFP11, pZEGfpAFP15, pZEGfpAFP16 plasmid를 제작하였다 (Fig. 1). 재조합 GFP-AFP chimera 단백질의 발현은 tet 프로모터에 의하여 조절되며, 발현유도제인 doxycycline의 도입에 의하여 발현이 유도된다.
이론/모형
- Clupea harengus (afp11), Liparis atlanticus (afp15), Myoxocephalus octodecemspinosus (afp16) 유래의 3종의 afp 유전자를 재조합하였으며 사용한 oligonucleotide의 염기서열은 Table 2에 정리하였다. 3종의 afp 유전자와 gfp 유전자는 polymerase chain reaction (PCR)기법을 통하여 확보하였다. PCR은 Expand High Fidelity PCR System (Roche Molecular Biochemicals, Germany)을 이용하여 MJ mini Personal Thermal Cycler (BioRad Laboratories, USA)에서 수행하였다.
- 균주의 성장은 spectrophotometer (Shimadzu, Japan)를 이용하여 600 nm에서 흡광도를 측정하는 것을 통해 확인하였다. 균주의 GFP 형광발광 정도는 RF-5301PC Spectrofluorimeter (Shimadzu, Japan)를 이용하여 측정되었다. Spectrofluorimeter의 excitation 파장은 490/10 nm, 그리고 emission 파장은 510/10 nm로 작동하였다.
성능/효과
- 본 결과로부터 GFP-AFP chimera의 발현이 균주의 성장에 미치는 부정적인 영향을 다시 확인할 수 있었다. Doxycycline을 첨가한 경우, 상대형광도 (SFI)가 거의 증가하지 않음 반면, doxycycline을 첨가에 의하여 상대형광도가 시간에 따라 증가함을 확인하였다 (Fig. 2(b)).
- GFP, GFP-AFP chimera 단백질 용액은 증류수보다 낮은 어는점을 가지고 있음을 확인할 수 있었으며, GFP와 GFP-AFP chimera 단백질 용액의 어는점을 크게 차이가 나지 않았으며, 이는 다른 논문에서 보고된 것 바와 같이 GFP 단백질만으로도 어느 정도의 동결방지기능을 나타내기 때문으로 고려된다.
- 재조합 GFP-AFP chimera 단백질의 발현은 tet 프로모터에 의하여 조절되며, 발현유도제인 doxycycline의 도입에 의하여 발현이 유도된다. GFP-AFP chimera 단백질의 발현을 확인한 결과 C. harengus와 L. atlanticus 유래의 AFP 단백질을 발현시킨 균주는 성장이 심각하게 저해됨을 확인하였으며, M. octodecemspinosus 유래의 AFP는 상대적으로 양호한 수준의 균주상태를 보여주었다 (data not shown). 이는 C.
- 재조합 GFP-AFP chimera 단백질을 1 mM의 doxycycline으로 발현시킨 후, Ni-NTA column를 사용하여 정제하였다. SDS-PAGE로 14.7 kDa 크기의 재조합 GFP-AFP chimera 단백질이 정제되었음을 확인하였다 (Fig. 3).
- 단백질 발현 유도제인 doxycycline을 주입한 후, 균주농도 및 형광도를 측정하였다. 균주의 성장은 spectrophotometer (Shimadzu, Japan)를 이용하여 600 nm에서 흡광도를 측정하는 것을 통해 확인하였다. 균주의 GFP 형광발광 정도는 RF-5301PC Spectrofluorimeter (Shimadzu, Japan)를 이용하여 측정되었다.
- 67로 약 3배 증가하였다. 그러나 0.1, 0.5, 1 mM의 doxycycline을 첨가하였을 경우, 균주의 성장이 거의 이루어지지 않았음을 확인하였다 (Fig. 2(a)).
- 현재 가스 하이드레이트 매장량은 전 세계에 약 10조 톤에 달하는 것으로 추정되며 이 규모는 메탄 기체 매장량의 약 100 배에 해당하고 석탄, 석유 등 전체 화석연료 매장량의 약 두 배에 달한다. 둘째 이유는 가스 하이드레이트가 이산화탄소의 발생이 매우 적은 친환경 청정에너지라는 점을 들 수 있다. 가스 하이드레이트 연소시 발생되는 이산화탄소의 양은 현재 사용 중인 휘발유에 비하여 0.
- 2(a)). 본 결과로부터 GFP-AFP chimera의 발현이 균주의 성장에 미치는 부정적인 영향을 다시 확인할 수 있었다. Doxycycline을 첨가한 경우, 상대형광도 (SFI)가 거의 증가하지 않음 반면, doxycycline을 첨가에 의하여 상대형광도가 시간에 따라 증가함을 확인하였다 (Fig.
- 2(b)). 이를 통하여 GFP-AFP chimera 단백질이 성공적으로 발현되었음을 확인하였다.
- 4). 이를 통하여 제작된 GFP-AFP chimera 단백질이 동결방지특성을 가지고 있음을 확인하였다.
후속연구
- 본 연구진이 개발한 GFP-AFP chimera 단백질의 대량생산시스템을 활용한다면, 기존의 화학제품기반 저해제보다 친환경적이며 경제적인 가스 하이드레이트 저해제의 생산을 앞당길 수 있으리라 기대된다. 또한, 현재 다양한 AFP가 보고되어져 있으므로, 보다 효율적인 GFP-AFP chimera 단백질의 개발이 가능할 것으로 예상된다.
- AFP 단백질의 경우 고가이기 때문에 가스 하이드레이트 저해제로써의 산업 적용이 현실적으로 불가능하였다. 본 연구진이 개발한 GFP-AFP chimera 단백질의 대량생산시스템을 활용한다면, 기존의 화학제품기반 저해제보다 친환경적이며 경제적인 가스 하이드레이트 저해제의 생산을 앞당길 수 있으리라 기대된다. 또한, 현재 다양한 AFP가 보고되어져 있으므로, 보다 효율적인 GFP-AFP chimera 단백질의 개발이 가능할 것으로 예상된다.
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