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문제 정의
- PCR 진단법에서의 오염문제는 검사시료를 처리하는 과정에서부터 PCR 전 과정에서 발생할 수 있으며, 특히 이전의 PCR을 통하여 증폭된 DNA의 오염 문제가 가장 심각한 것으로 보고되고 있다(Aslanzadeh, 2004; Kwok과 Higuchi, 1989; Persing, 1990). 따라서 이 연구에서는 이전의 PCR에서 기증폭된 DNA의 오염과 이로 인한 오증폭을 방지하기 위하여 UNG 시스템을 도입하였다. UNG는 DNA 염기서열로부터 uracil 염기를 절단하는 가능을 가지고 있으며, RNA나 유리된 nucleotide 상태의 uracil 염기를 절단하지는 않는다(Duncan, 1981).
- 따라서 기존 PCR 진단법의 장점을 유지하면서 오염 가능성을 감소시키기 위하여, PCR 과정의 단순화와 함께 기증폭된 DNA의 오염에 의한 오진을 방지할 수 있는 새로운 방식의 PCR 진단법 개발이 시급한 실정이다. 이 연구에서는 이러한 요구에 부응하여, 돼지집단에서 감시활동 대상이 되는 SIV (H1 및 H3 아형)와 pH1N1을 동시에 감별 진단할 수 있는 one-step Multiplex RT-PCR을 개발하여 실험과정을 단순화하고, 또한 UNG 시스템을 적용하여 기증폭된 DNA의 오염에 의한 오진을 막고자 하였다.
제안 방법
- RT-PCR premix (Inclone, Korea)에 각 인플루엔자 바이러스 아형 특이 primer set를 2∼20 pmol/ul로 농도를 달리하여 첨가한 one-step multiplex RT-PCR premix를 제조하였으며, RT-PCR 증폭효율에 따라 각 primer set의 농도를 적절하게 조정하여 최적의 증폭 조건을 확립하였다.
- 즉, 50℃에서 30분간의 RT 과정을 거친 후, 95℃에서 15분간 처리한 다음, 35 회전의 PCR 과정(denaturation 95℃ 30초, annealing 50℃ 60초, extension 72℃ 90초)를 수행한 다음, 72℃에서 10분간 최종 반응하였다. RT-PCR 증폭산물은 1.5% agarose gel에 전기 영동한 후 UV transilluminator (Bio-Rad, USA)로 확인하였다.
- UNG 시스템 적용 RT-PCR 키트를 개발하기 위하여 우선 UNG-RT-PCR premix (uPremix)를 제조하였다. 즉, uPremix는 시판 RT-PCR premix (Inclone, Korea)의 구성 성분에서 deoxythymidine triphosphate (dTTP)를 2/3 수준(1.
- 1 unit을 첨가하여 제조하였다. UNG 시스템 적용 RT-PCR의 경우 기존의 RT-PCR 조건에 UNG처리과정이 포함되어야 하므로 RT-PCR 과정 이전에 추출된 RNA 시료를 포함한 모든 RT-PCR 성분이 포함된 튜브를 실온(25℃)에서 5분간 정치하였고, UNG 활성을 제거하기 위하여 92℃에서 1분간 반응시켰다. UNG 시스템 적용 시 RT-PCR의 민감도가 영향을 받는지 여부를 확인하기 위하여 공시바이러스를 대상으로 동일한 반응조건으로 UNG 시스템 비적용 RTPCR과 UNG 시스템 적용 RT-PCR을 실시하였다.
- UNG 시스템 적용 RT-PCR의 경우 기존의 RT-PCR 조건에 UNG처리과정이 포함되어야 하므로 RT-PCR 과정 이전에 추출된 RNA 시료를 포함한 모든 RT-PCR 성분이 포함된 튜브를 실온(25℃)에서 5분간 정치하였고, UNG 활성을 제거하기 위하여 92℃에서 1분간 반응시켰다. UNG 시스템 적용 시 RT-PCR의 민감도가 영향을 받는지 여부를 확인하기 위하여 공시바이러스를 대상으로 동일한 반응조건으로 UNG 시스템 비적용 RTPCR과 UNG 시스템 적용 RT-PCR을 실시하였다. 즉, 제조된 기존 RT-PCR premix와 uPremix 20 µL에 HAT 역가 8배로 조정된 4종의 공시 바이러스 배양액을 인산완충액(pH 7.
- 각 바이러스 배양액으로부터 시판 RNA 추출키트(Inclone biotech, Korea)를 이용하여 RNA를 추출한 다음, −20℃ 에 보관하며, RT-PCR에 제공하였다.
- 각 희석액(21 , 2−1 , 2−3 , 2−5 및 2−7 HA unit/25 µL)에서 추출 한 RNA 5 µΛ를 두가지 방식의 RT-PCR premix에 첨가하여 RT-PCR을 실시한 다음, 각 바이러스에 대한 검출한계를 비교하였다.
- 2)으로 4배수 단계 희석하였다. 각 희석액에서 추출된 RNA를 이용하여 RT-PCR을 실시한 후 최종 검출한계를 조사하였다.
- 개발진단법의 특이도를 확인하기 위하여 검출 대상 SIV (H1N1, H1N2, H3N2) 및 pH1N1 바이러스 배양액에서 RNA를 추출한 다음, multiplex RT-PCR을 실시하여 각 바이러스 유전자를 특이적으로 증폭하는지 여부를 확인하였다. 또한 개발진단법의 민감도를 확인하기 위하여 공시 바이러스 H1N1, H1N2, H3N2 및 pH1N1 바이러스의 배양액에 대하여 HAT를 실시하여 바이러스 역가를 8배로 조정하였고, 각 SIV 아형 및 동량의 각 바이러스 혼합액을 인산완충액 (pH 7.
- 개발진단법의 핵산 오염 방지효과를 확인하기 위하여 개발진단법으로 기증폭된 DNA를 20 ng/µL에서 10 pg/µL까지 희석한 다음, UNG 적용 uPremix와 UNG 비적용 RT-PCR premix에 각각 동일한 조건으로 혼입하여 RT-PCR을 실시하였다.
- 제작된 primer set를 혼합하여 multiplex RT-PCR 을 수행할 경우, H1 아형의 SIV는 공통 primer set와 H1 아형 특이 primer set에 의해 242 bp 및 375 bp의 특이 유전자가 증폭되며, H3 아형의 SIV는 공통 primer set와 H3 아형 특이 primer set에 의해 242 bp 및 608 bp의 특이 유전자가 증폭되도록 설계하였다. 그리고 pH1N1 바이러스인 경우에는 공통 primer set와 H1 아형 primer set 및 pH1N1 특이 primer set에 의해 3개의 밴드(242, 375 및 452 bp)가 증폭되도록 설계하였다.
- 따라서 이 연구에서는 배양액 내에서 SIV 존재 여부와 바이러스 아형을 동시에 감별 진단할 수 있으며, 실험실내 핵산의 오염을 사전에 차단할 수 있는 UNG 시스템을 적용한 one-step multiplex RT-PCR기 법을 개발하였고, 기존의 RT-PCR 방법과 진단 효율 및 핵산 오염 방지효과를 비교 평가하였다.
- 개발진단법의 특이도를 확인하기 위하여 검출 대상 SIV (H1N1, H1N2, H3N2) 및 pH1N1 바이러스 배양액에서 RNA를 추출한 다음, multiplex RT-PCR을 실시하여 각 바이러스 유전자를 특이적으로 증폭하는지 여부를 확인하였다. 또한 개발진단법의 민감도를 확인하기 위하여 공시 바이러스 H1N1, H1N2, H3N2 및 pH1N1 바이러스의 배양액에 대하여 HAT를 실시하여 바이러스 역가를 8배로 조정하였고, 각 SIV 아형 및 동량의 각 바이러스 혼합액을 인산완충액 (pH 7.2)으로 4배수 단계 희석하였다. 각 희석액에서 추출된 RNA를 이용하여 RT-PCR을 실시한 후 최종 검출한계를 조사하였다.
- 이 연구를 통하여 돼지 인플루엔자 바이러스(swine influenza virus; SIV)의 주요 아형과 2009 팬데믹 인플루엔자 H1N1 바이러스(pH1N1)을 동시에 신속하게 감별진단 할 수 있는 one step multiplex RT-PCR을 개발하였다. 개발 one step multiplex RT-PCR은 모든 SIV를 검출할 수 있는 공통 프라이머 세트와 SIV의 H1 및 H3 아형, 그리고 pH1N1을 특이적으로 검출할 수 있도록 총 네 쌍의 프라이머 세트를 이용함으로써 각각의 해당 바이러스 단독 시료 또는 여러 아형의 바이러스의 혼합시료로부터 각 바이러스를 동시에 감별진단 할 수 있었다.
- 이전에 실시된 RT-PCR에 의해 증폭된 SIV 유전자 산물이 실험실 내에 오염되어 있음을 전제로 하여 이 연구에서 개발된 UNG 시스템 적용 RT-PCR법이 기 증폭된 핵산의 오염에 의해 영향을 받는지 여부를 확 인하였다. 즉, UNG 시스템 적용 RT-PCR을 통하여 기 증폭된 DNA를 핵산정량기(Thermo Fisher scientific Inc.
- 모든 SIV 아형을 증폭할 수 있는 공통 primer set (ComF-ComR)와 pH1N1 바이러스를 증폭할 수 있는 primer set (NFFNFR)는 Shin 등(2011)이 보고한 primer set를 준용하였다. 제작된 primer set를 혼합하여 multiplex RT-PCR 을 수행할 경우, H1 아형의 SIV는 공통 primer set와 H1 아형 특이 primer set에 의해 242 bp 및 375 bp의 특이 유전자가 증폭되며, H3 아형의 SIV는 공통 primer set와 H3 아형 특이 primer set에 의해 242 bp 및 608 bp의 특이 유전자가 증폭되도록 설계하였다. 그리고 pH1N1 바이러스인 경우에는 공통 primer set와 H1 아형 primer set 및 pH1N1 특이 primer set에 의해 3개의 밴드(242, 375 및 452 bp)가 증폭되도록 설계하였다.
- 제조한 PCR-premix 20 µL에 바이러스 배양액으로부터 추출한 RNA 5 ml를 첨가 혼합한 다음, 핵산증폭기(Genetech, USA)를 이용하여 RT-PCR을 실시하였다.
- 제조한 PCR-premix 20 µL에 바이러스 배양액으로부터 추출한 RNA 5 ml를 첨가 혼합한 다음, 핵산증폭기(Genetech, USA)를 이용하여 RT-PCR을 실시하였다. 즉, 50℃에서 30분간의 RT 과정을 거친 후, 95℃에서 15분간 처리한 다음, 35 회전의 PCR 과정(denaturation 95℃ 30초, annealing 50℃ 60초, extension 72℃ 90초)를 수행한 다음, 72℃에서 10분간 최종 반응하였다. RT-PCR 증폭산물은 1.
- 시험에 사용한 SIV는 농림축산검역본부에서 분양 받았으며, 공시 바이러스를 이용한 실험은 농림축산 검역본부에서 수행하였다. 즉, H1N1 아형(A/Korea/ D180-2/2009), H1N2 아형(A/Korea/103/2009), H3N2 아형(A/Korea/A18/2011) 및 pH1N1 (A/Korea/VD01/ 2009) 바이러스를 세계동물보건기구(OIE)의 표준 방법에 준하여 발육란에 접종하여 배양한 다음, 혈구응 집반응을 실시하여 역가를 측정한 다음, 시험에 공시하였다(Kim 등, 2014; OIE, 2012; WHO, 2010). 각 바이러스 배양액으로부터 시판 RNA 추출키트(Inclone biotech, Korea)를 이용하여 RNA를 추출한 다음, −20℃ 에 보관하며, RT-PCR에 제공하였다.
- 즉, UNG 시스템 적용 RT-PCR을 통하여 기 증폭된 DNA를 핵산정량기(Thermo Fisher scientific Inc., USA)로 정량한 다음, RT-PCR premix와 개발 uPremix에 농도별로 20 ng, 10 ng, 1 ng, 100 pg 및 10 pg을 각각 첨가하여 혼합한 다음, 전술한 방법대로 RT-PCR을 수행하여 증폭산물을 확인하였다.
- UNG 시스템 적용 RT-PCR 키트를 개발하기 위하여 우선 UNG-RT-PCR premix (uPremix)를 제조하였다. 즉, uPremix는 시판 RT-PCR premix (Inclone, Korea)의 구성 성분에서 deoxythymidine triphosphate (dTTP)를 2/3 수준(1.5 mM)으로 줄이고, deoxyuridine triphosphate (dUTP) 1.0 mM 및 UNG 효소(ArcticZymes Inc., USA) 0.1 unit을 첨가하여 제조하였다. UNG 시스템 적용 RT-PCR의 경우 기존의 RT-PCR 조건에 UNG처리과정이 포함되어야 하므로 RT-PCR 과정 이전에 추출된 RNA 시료를 포함한 모든 RT-PCR 성분이 포함된 튜브를 실온(25℃)에서 5분간 정치하였고, UNG 활성을 제거하기 위하여 92℃에서 1분간 반응시켰다.
- SIV H1 및 H3 아형을 특이적으로 증폭할 수 있는 primer set를 선발하기 위하여 2009∼2012년 사이에 Genbank에 등록된 SIV H1 아형의 유전자 염기서열정보 100여 개와 SIV H3 아형의 유전자 염기서열 정보 70여 개를 확보하였다. 확보된 정보를 유전자 염기서열 분석 프로그램인 DNASTARⓇLasergene (DNASTAR, Inc, USA)으로 통합 분석하여, 가장 변이가 적고 안 정적인 유전자 부위를 탐색하여 SIV H1 및 H3 아형을 특이적으로 증폭할 수 있는 primer set (SH1F-SH1R 및 SH3F-SH3R)를 선발하였다(Table 1). 모든 SIV 아형을 증폭할 수 있는 공통 primer set (ComF-ComR)와 pH1N1 바이러스를 증폭할 수 있는 primer set (NFFNFR)는 Shin 등(2011)이 보고한 primer set를 준용하였다.
대상 데이터
- SIV H1 및 H3 아형을 특이적으로 증폭할 수 있는 primer set를 선발하기 위하여 2009∼2012년 사이에 Genbank에 등록된 SIV H1 아형의 유전자 염기서열정보 100여 개와 SIV H3 아형의 유전자 염기서열 정보 70여 개를 확보하였다.
- 시험에 사용한 SIV는 농림축산검역본부에서 분양 받았으며, 공시 바이러스를 이용한 실험은 농림축산 검역본부에서 수행하였다. 즉, H1N1 아형(A/Korea/ D180-2/2009), H1N2 아형(A/Korea/103/2009), H3N2 아형(A/Korea/A18/2011) 및 pH1N1 (A/Korea/VD01/ 2009) 바이러스를 세계동물보건기구(OIE)의 표준 방법에 준하여 발육란에 접종하여 배양한 다음, 혈구응 집반응을 실시하여 역가를 측정한 다음, 시험에 공시하였다(Kim 등, 2014; OIE, 2012; WHO, 2010).
이론/모형
- 확보된 정보를 유전자 염기서열 분석 프로그램인 DNASTARⓇLasergene (DNASTAR, Inc, USA)으로 통합 분석하여, 가장 변이가 적고 안 정적인 유전자 부위를 탐색하여 SIV H1 및 H3 아형을 특이적으로 증폭할 수 있는 primer set (SH1F-SH1R 및 SH3F-SH3R)를 선발하였다(Table 1). 모든 SIV 아형을 증폭할 수 있는 공통 primer set (ComF-ComR)와 pH1N1 바이러스를 증폭할 수 있는 primer set (NFFNFR)는 Shin 등(2011)이 보고한 primer set를 준용하였다. 제작된 primer set를 혼합하여 multiplex RT-PCR 을 수행할 경우, H1 아형의 SIV는 공통 primer set와 H1 아형 특이 primer set에 의해 242 bp 및 375 bp의 특이 유전자가 증폭되며, H3 아형의 SIV는 공통 primer set와 H3 아형 특이 primer set에 의해 242 bp 및 608 bp의 특이 유전자가 증폭되도록 설계하였다.
성능/효과
- SIV H1 및 H3 아형 및 pH1N1 바이러스 진단용 prime set의 작동 여부를 확인하기 위하여 각 primer set 별로 해당 바이러스 아형에 대하여 RT-PCR을 실시한 결과, 해당 primer set가 각 바이러스 아형을 특이적으로 증폭함을 확인할 수 있었다.
- 이 연구를 통하여 돼지 인플루엔자 바이러스(swine influenza virus; SIV)의 주요 아형과 2009 팬데믹 인플루엔자 H1N1 바이러스(pH1N1)을 동시에 신속하게 감별진단 할 수 있는 one step multiplex RT-PCR을 개발하였다. 개발 one step multiplex RT-PCR은 모든 SIV를 검출할 수 있는 공통 프라이머 세트와 SIV의 H1 및 H3 아형, 그리고 pH1N1을 특이적으로 검출할 수 있도록 총 네 쌍의 프라이머 세트를 이용함으로써 각각의 해당 바이러스 단독 시료 또는 여러 아형의 바이러스의 혼합시료로부터 각 바이러스를 동시에 감별진단 할 수 있었다. 개발된 one step multiplex RT-PCR의 검출한계는 2−6 HA/25 µL로 확인되어 일선 진단실에서 충분히 사용 가능한 것으로 평가되었다.
- 개발된 one step multiplex RT-PCR의 검출한계는 2−6 HA/25 µL로 확인되어 일선 진단실에서 충분히 사용 가능한 것으로 평가되었다.
- 결론적으로 이 연구에서는 SIV의 주요 아형(H1, H3 아형)과 pH1N1을 동시에 감별 진단할 수 있는 one-step multiplex RT-PCR을 개발하여 진단경비와 진단시간을 절감할 수 있게 되었다. 또한 개발 진단법에 UNG 시스템을 적용함으로써 이전의 RT-PCR에 의해 기증폭된 DNA의 오염에 따른 오증폭을 방지할 수 있었다.
- 공시 바이러스를 이용하여 개발 진단법의 민감도를 조사한 결과, 개별 바이러스에 대한 single PCR 의 검출한계와 4종 바이러스에 대한 multiplex RT-PCR의 검출한계는 공히 최소 HAT 역가 2−6 /25 µL으로 확인 되었다(Fig. 2).
- 개발진단법의 핵산 오염 방지효과를 확인하기 위하여 개발진단법으로 기증폭된 DNA를 20 ng/µL에서 10 pg/µL까지 희석한 다음, UNG 적용 uPremix와 UNG 비적용 RT-PCR premix에 각각 동일한 조건으로 혼입하여 RT-PCR을 실시하였다. 그 결과, UNG 시스템 비적용 premix로 RT-PCR을 실시한 경우에는 오염된 DNA에 의한 증폭이 일어났지만 UNG 시스템 적용 uPremix으로 RT-PCR을 실시한 경우에는 오염 시킨 DNA의 양에 상관없이 오증폭이 일어나지 않음이 확인되었다(Fig. 4).
- 1 unit 이상의 UNG를 첨가할 경우 반응의 민감도에 영향을 미치는 것으로 나타났다. 따라서 반응의 민감도에는 영향을 미치지 않으면서도 오염 DNA를 제거할 수 있도록 UNG 첨가량을 0.1 unit으로 고정하였고, 또한 PCR 증폭과정에 사용되는 중합효소의 증폭효율이 기존의 dTTP 첨 가할 때보다 dUTP를 첨가할 때 감소된다는 점을 고려하여 본 연구에서 uPremix를 제조할 때 dTTP를 dUTP로 완전 대체하지 않고 부분적으로 대체하여 UNG 시스템 적용에 따른 민감도 감소 문제를 해결하였다(Fig 3). 현재까지 수의학 분야의 유전자 진단에 이러한 UNG 시스템을 적용한 예는 본 연구가 국내에서 최초이며, 향후 이 UNG 시스템은 인플루엔자 바이러스뿐 아니라 다른 바이러스성 질병의 진단에도 폭넓게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
- 또한 UNG 시스템 적용에 따른 민감도 변화를 확인하기 위하여 동일한 민감도 측정 과정으로 공시 바이러스 혼합액의 희석액(21 , 2−1 , 2−3 , 2−5 , 및 2−7 HA unit/25 µL)에 대하여 비교 시험을 실시한 결과, UNG 시스템을 적용한 RT-PCR과 UNG 시스템 비적용 RT-PCR에서 공히 2−7 HA unit/25 µL 희석농도까지 측이 밴드가 확인되어 UNG 적용에 따른 민감도의 차이는 나타나지 않았다 (Fig. 3).
- 또한 개발 진단법에 UNG 시스템을 적용함으로써 이전의 RT-PCR에 의해 기증폭된 DNA의 오염에 따른 오증폭을 방지할 수 있었다.
- 개발된 one step multiplex RT-PCR의 검출한계는 2−6 HA/25 µL로 확인되어 일선 진단실에서 충분히 사용 가능한 것으로 평가되었다. 또한 개발 진단법은uracil DNA glycosylase (UNG) 시스템을 적용하였던 바, 일반 RT-PCR과는 달리 이 전의 PCR을 통하여 기증폭된 DNA의 오염에 의한 오증폭을 방지할 수 있음이 확인되었다. 따라서 이 연구에서 개발된 UNG 시스템 적용 one step multiplex RT-PCR은 임상 실험실에서 SIV의 감별진단법으로 상용화될 수 있을 것으로 기대된다.
- 이 연구에서 개발된 진단법은 이러한 원리를 이용하여 제조된 uPremix를 이용하여 각 아형의 SIV를 RT-PCR로 증폭하였고, 기증폭된 DNA를 의도적으로 오염시켜 신규 RT-PCR을 실시한 결과, UNG 시스템을 적용한 경우에는 PCR 이전 UNG 처리단계에서 오염된 기증폭 DNA가 모두 제거되어 오증폭이 일어나지 않음을 확인하였다(Fig. 4).
- 따라서 돼지에 대한 국가 감시사업에 있어서는 돼지에 주로 감염되는 SIV의 주요 아형(H1 및 H3 아형)과 pH1N1은 물론 다른 아형의 IAV 감염 가능성을 대비하여 모든 IAV 아형을 동시에 감별 진단할 수 있는 RT-PCR법의 개발 및 적용이 필요하다. 이 연구에서는 SIV H1, H3 및 pH1N1 진단용 primer set들과 모든 IAV를 검출할 수 있는 공통 primer set를 이용한 one-step multiplex RT-PCR을 개발하였고, 공시 바이러스에 대하여 특이도를 확인한 결과(Fig. 1) 해당 바이러스들을 모두 특이적으로 진단할 수 있음이 확인되었다. 따라서 이 연구에서 개발된 RT-PCR 진단법을 돼지집단의 SI 감시활동에 매우 유용할 것으로 판단된다.
- 1A). 이어 4종의 primer sets를 H1 및 H3 아형과 pH1N1 바이러스를 동시에 검출할 수 있는 최적 반응조건을 확립하기 위하여 각 primer set 의 농도별 최적 반응 조건을 탐색한 결과, 공통 primer set는 2 pmol, H1 및 H3 아형 검출용 primer set는 각각 20 pmol, 그리고 pH1N1 검출용 primer set는 3 pmol을 혼합하였을 때 최적의 증폭이 일어남을 확인하였다(Fig. 1).
- 이에 대하여 Longo 등(1990)은 UNG 첨가 시 진단의 민감도가 감소된다고 보고한 바 있으며, Pang 등(1992)은 오히려 적당한 UNG 첨가가 민감도를 증가시키는 결과를 가져왔다고 보고하는 등 UNG 첨가에 따른 민감도 저하 부분은 논란의 여지가 있다. 이에 이 연구에서는 UNG 첨가량을 달리하여 사전 시험을 실시한 결과, 0.1 unit 이상의 UNG를 첨가할 경우 반응의 민감도에 영향을 미치는 것으로 나타났다. 따라서 반응의 민감도에는 영향을 미치지 않으면서도 오염 DNA를 제거할 수 있도록 UNG 첨가량을 0.
- 조건이 확립된 one step multiplex RT-PCR의 민감도를 확인하기 위하여 단계희석한 각 아형의 SIV와 pH1N1 바이러스 배양액에서 핵산을 추출한 다음, 4 종의 primer set가 포함된 RT-PCR premix를 이용하여 RT-PCR을 실시하고, 증폭산물을 전기영동 및 염색하여 육안으로 관찰한 결과, 각 바이러스별로는 H1N1 아형은 2−7 HA/25 µL, H1N2 아형은 2−6 HA/25 µL, H3N2 아형은 2−6 HA/25 µL, 그리고 pH1N1 아형은 2−7 HA/25 µL까지 명확하게 관찰이 가능하였으며, 5종의 공시 바이러스 혼합시료인 경우에도 개별 바이러스에 대한 RT-PCR 결과와 별 차이 없이 2−6 HA/25 µL 까지 특이밴드가 확인되었다(Fig. 2).
- SIV H1 및 H3 아형 및 pH1N1 바이러스 진단용 prime set의 작동 여부를 확인하기 위하여 각 primer set 별로 해당 바이러스 아형에 대하여 RT-PCR을 실시한 결과, 해당 primer set가 각 바이러스 아형을 특이적으로 증폭함을 확인할 수 있었다. 즉, SIV 공통 primer set (ComF-comR)로는 공시된 모든 바이러스의 matrix 유전자를 증폭하였고, SIV H1 및 H3 아형 특이 primer set (SH1F-SH1R 및 SH3R-SH3R)는 H1 아형의 SIV (H1N1, H1N2)의 HA 유전자를 증폭하였으며, pH1N1 바이러스 특이 primer set (NFF-NFR)는 pH1N1 바이러스의 특이 matrix 유전자를 특이적으로 증폭함을 확인하였다(Fig. 1A). 이어 4종의 primer sets를 H1 및 H3 아형과 pH1N1 바이러스를 동시에 검출할 수 있는 최적 반응조건을 확립하기 위하여 각 primer set 의 농도별 최적 반응 조건을 탐색한 결과, 공통 primer set는 2 pmol, H1 및 H3 아형 검출용 primer set는 각각 20 pmol, 그리고 pH1N1 검출용 primer set는 3 pmol을 혼합하였을 때 최적의 증폭이 일어남을 확인하였다(Fig.
후속연구
- 현재까지 수의학 분야의 유전자 진단에 이러한 UNG 시스템을 적용한 예는 본 연구가 국내에서 최초이며, 향후 이 UNG 시스템은 인플루엔자 바이러스뿐 아니라 다른 바이러스성 질병의 진단에도 폭넓게 이용될 수 있을 것으로 기대된다. 그러나 인플루엔자바이러스의 경우에는 실험실 내 공기 오염을 통해서도 오진이 발생할 수 있으므로(Li 등, 2012) PCR 증폭산물에 의한 오염뿐만 아니라 실험 실내에서 이루어지는 진단 전과정에 걸쳐서 바이러스 및 핵산 오염과 이로 인한 오진이 발생할 수 있음을 고려하여 향후 더 엄격한 오진 방지대책이 개발되어야 할 것으로 생각된다. 또한 이 연구에서 개발된 진단법은 1차적으로 배양과정을 통하여 바이러스 증식이 확인된 바이러스 배양액을 대상으로 한다는 점에서 향후 야외 검사 시료에 대한 직접적인 진단이 가능한 방식으로 더 개선되어야 할 것으로 생각된다.
- 또한 개발 진단법에 UNG 시스템을 적용함으로써 이전의 RT-PCR에 의해 기증폭된 DNA의 오염에 따른 오증폭을 방지할 수 있었다. 따라서 본 연구에서 개발된 UNG 시스템 적용 one-step multiplex RT-PCR은 SIV를 진단하는 실험실에서 바이러스 배양액을 대상으로 SIV를 확진하는데 있어 기존의 RT-PCR법을 대체하는 상용 진단법으로 널리 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
- 1) 해당 바이러스들을 모두 특이적으로 진단할 수 있음이 확인되었다. 따라서 이 연구에서 개발된 RT-PCR 진단법을 돼지집단의 SI 감시활동에 매우 유용할 것으로 판단된다.
- 또한 개발 진단법은uracil DNA glycosylase (UNG) 시스템을 적용하였던 바, 일반 RT-PCR과는 달리 이 전의 PCR을 통하여 기증폭된 DNA의 오염에 의한 오증폭을 방지할 수 있음이 확인되었다. 따라서 이 연구에서 개발된 UNG 시스템 적용 one step multiplex RT-PCR은 임상 실험실에서 SIV의 감별진단법으로 상용화될 수 있을 것으로 기대된다.
- 그러나 인플루엔자바이러스의 경우에는 실험실 내 공기 오염을 통해서도 오진이 발생할 수 있으므로(Li 등, 2012) PCR 증폭산물에 의한 오염뿐만 아니라 실험 실내에서 이루어지는 진단 전과정에 걸쳐서 바이러스 및 핵산 오염과 이로 인한 오진이 발생할 수 있음을 고려하여 향후 더 엄격한 오진 방지대책이 개발되어야 할 것으로 생각된다. 또한 이 연구에서 개발된 진단법은 1차적으로 배양과정을 통하여 바이러스 증식이 확인된 바이러스 배양액을 대상으로 한다는 점에서 향후 야외 검사 시료에 대한 직접적인 진단이 가능한 방식으로 더 개선되어야 할 것으로 생각된다.
- 1 unit으로 고정하였고, 또한 PCR 증폭과정에 사용되는 중합효소의 증폭효율이 기존의 dTTP 첨 가할 때보다 dUTP를 첨가할 때 감소된다는 점을 고려하여 본 연구에서 uPremix를 제조할 때 dTTP를 dUTP로 완전 대체하지 않고 부분적으로 대체하여 UNG 시스템 적용에 따른 민감도 감소 문제를 해결하였다(Fig 3). 현재까지 수의학 분야의 유전자 진단에 이러한 UNG 시스템을 적용한 예는 본 연구가 국내에서 최초이며, 향후 이 UNG 시스템은 인플루엔자 바이러스뿐 아니라 다른 바이러스성 질병의 진단에도 폭넓게 이용될 수 있을 것으로 기대된다. 그러나 인플루엔자바이러스의 경우에는 실험실 내 공기 오염을 통해서도 오진이 발생할 수 있으므로(Li 등, 2012) PCR 증폭산물에 의한 오염뿐만 아니라 실험 실내에서 이루어지는 진단 전과정에 걸쳐서 바이러스 및 핵산 오염과 이로 인한 오진이 발생할 수 있음을 고려하여 향후 더 엄격한 오진 방지대책이 개발되어야 할 것으로 생각된다.
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