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문제 정의
- 다양한 온도 및 농도에서 염기 전처리가 효소당화에 미치는 영향에 대해 연구하였다. 전처리되지 않은 굴참목분에 비해 전처리 후 효소당화가 증가하였으며 이러한 원인이 염기 전처리에 의한 리그닌 및 자이란 제거에 따른 효과라고 판단된다.
- 본 연구에서는 필링 반응이 발생하지 않는 저온 조건에서 전처리 온도 및 수산화나트륨 농도를 달리하여 헤미셀룰로오스와 리그닌의 용해가 어떠한 영향을 받는지 연구하였다. 또한 각기 다른 전처리된 굴참나무 목분의 효소당화를 통해 단당 생산에 대한 영향을 분석하였다.
가설 설정
- 하지만 효소당화에서는 발효저해 물질이 발생하지 않는다. 따라서 본 실험에서는 효소 당화액의 발효가 용이할 것으로 가정하였으며 일부 조건에서 생성된 효소 당화액만을 발효하여 발효 특성을 확인하였다(Fig. 3). 수산화나트륨 수용액 4%와 8%를 온도 90℃에서 전처리한 굴참나무 목분으로부터 얻은 효소 당화액의 발효 특성을 나타냈다.
제안 방법
- 반응이 끝난 후 여과액을 모아서 NMR spectrometer(500H㎐, Bruker)로 분석하였다. Top spin 프로그램을 사용하여 스펙트럼 상에서의 아노머성 수소 피크를 적분하여 단당류를 정량 분석하였다.
- 여과한 효소당화액에 영양분을 첨가하여 멸균 후 당화액의 5%에 해당되는 효모를 접종하였다. YM broth 조성은 glucose 10 g/L, peptone 5 g/L, yeast extract 3 g/L, malt extract 3 g/L 이며 영양분은 각각 yeast extract 5 g/L, peptone 5 g/L, MgSO4 1 g/L, K2HPO4 1 g/L을 첨가하였다. 발효는 30℃, 150 rpm 조건으로 진탕배양기에서 총 72시간 동안 진행하였으며 6, 12, 24, 48, 72 시간 마다 샘플을 채취하여 글루코오스 감소량 및 에탄올 생산량을 분석하였다.
- 굴참목분의 화학적 조성 분석을 위하여 아세톤 추출물 함량 측정(Tappi 204 om-88), 온수 추출물 함량 측정(Tappi 207 om-93), 산 불용성 및 가용성 리그닌 분석(Tappi 222 om-88과 Tappi Useful Method UM 250)을 실시하였다.
- 농도 및 온도에 따른 알칼리 전처리 효과를 확인하기 위해서 알칼리 전처리 전과 후의 굴참나무 목분의 다당류 성분 변화를 1H-NMR 분석을 통해 알아보았다. 굴참나무 목분 40 mg을 24 N 황산(72%) 0.
- 탈지된 굴참나무 목분(전건 기준)과 수산화나트륨 수용액을 1:6(w/v)의 비율로 혼합한 후 일정온도에서 4시간 동안 전처리하였다. 농도에 따른 전처리 효과를 알아보기 위해서 온도는 90℃ 로 일정하게 유지하고 수산화나트륨 수용액 농도는 4, 8, 13, 18%로 두었다.
- 본 연구에서는 필링 반응이 발생하지 않는 저온 조건에서 전처리 온도 및 수산화나트륨 농도를 달리하여 헤미셀룰로오스와 리그닌의 용해가 어떠한 영향을 받는지 연구하였다. 또한 각기 다른 전처리된 굴참나무 목분의 효소당화를 통해 단당 생산에 대한 영향을 분석하였다.
- 0 mL을 넣고 희석하여 100℃, 1시간 동안 실시하였다. 반응이 끝난 후 여과액을 모아서 NMR spectrometer(500H㎐, Bruker)로 분석하였다. Top spin 프로그램을 사용하여 스펙트럼 상에서의 아노머성 수소 피크를 적분하여 단당류를 정량 분석하였다.
- YM broth 조성은 glucose 10 g/L, peptone 5 g/L, yeast extract 3 g/L, malt extract 3 g/L 이며 영양분은 각각 yeast extract 5 g/L, peptone 5 g/L, MgSO4 1 g/L, K2HPO4 1 g/L을 첨가하였다. 발효는 30℃, 150 rpm 조건으로 진탕배양기에서 총 72시간 동안 진행하였으며 6, 12, 24, 48, 72 시간 마다 샘플을 채취하여 글루코오스 감소량 및 에탄올 생산량을 분석하였다.
- 발효 균주로는 Saccharomyces cerevisiae를 사용하였으며 Yeast Mould(YM) broth에서 24시간 배양하여 사용하였다. 여과한 효소당화액에 영양분을 첨가하여 멸균 후 당화액의 5%에 해당되는 효모를 접종하였다. YM broth 조성은 glucose 10 g/L, peptone 5 g/L, yeast extract 3 g/L, malt extract 3 g/L 이며 영양분은 각각 yeast extract 5 g/L, peptone 5 g/L, MgSO4 1 g/L, K2HPO4 1 g/L을 첨가하였다.
- 온도에 따른 전처리 효과는 수산화나트륨 수용액 농도 13%로 일정하게 두고 45, 60, 75, 90℃로 각각 실시하였다. 전처리를 끝낸 후 글라스필터(P4, pore size)로 여과하여 수산화나트륨 수용액의 5배 정도의 증류수를 사용하여 잔류하는 약품을 제거하여 사용하였다.
- 이렇듯 많은 연구를 통해 자이란과 리그닌 제거가 효소당화를 촉진시킬 수 있는 주요 인자임을 알 수 있으며 본 연구에서는 알칼리 농도 및 온도를 변화하여 자이란 및 리그닌 용해 정도에 따른 효소당화 차이를 비교하였다. Fig.
- 전처리 온도에 따른 화학조성의 변화를 확인하기 위하여 수산화나트륨 수용액의 농도를 13%로 고정한 후 온도(45, 60, 75, 90℃)를 변화시켜 전처리를 실시하였다. 전처리 온도가 증가할수록 약간씩 리그닌의 제거량이 상승하였고 이런 경향은 염기의 농도를 달리했을 경우와 비슷하였다(Table 3).
- 전처리된 굴참나무로부터 얻은 효소당화액 중 90℃에서 4, 8% 수산화나트륨 전처리된 굴참나무로부터 얻은 두 가지 효소당화액만을 발효하였다. 발효 균주로는 Saccharomyces cerevisiae를 사용하였으며 Yeast Mould(YM) broth에서 24시간 배양하여 사용하였다.
- 탈지된 굴참나무 목분(전건 기준)과 수산화나트륨 수용액을 1:6(w/v)의 비율로 혼합한 후 일정온도에서 4시간 동안 전처리하였다. 농도에 따른 전처리 효과를 알아보기 위해서 온도는 90℃ 로 일정하게 유지하고 수산화나트륨 수용액 농도는 4, 8, 13, 18%로 두었다.
- 효소당화 및 발효 공정 중 시간에 따라 샘플을 채취하여 HPLC(high performance liquid chromatograph) (Shimadzu, Japan)를 이용해 샘플 내 단당류 또는 에탄올 농도를 측정하였으며 이를 통해 당화율 또는 발효율을 분석하였다. 컬럼(Aminex HPX-87H, 300 mm x 7.
- 5L 첨가량의 1/3 수준으로 사용하였다. 효소당화 중당 농도를 측정하기 위해서 2, 4, 6, 8, 12, 24, 48 시간때 2.0 mL의 샘플을 채취하여 여과하여 사용하였다.
대상 데이터
- 0 mm 이하로 분쇄 후 기건시켜 사용하였다. 가성소다는 93% 순도의 제품(Showa, Japan)을 사용하였다. 효소로는 Celluclast 1.
- 굴참나무(Quercus variabilis)는 충북 제천시 한수면 송계리에 위치한 충북대학교 학술림에서 벌목하여 분쇄기(IKA사의 MF10B)를 이용하여 입자 크기 2.0 mm 이하로 분쇄 후 기건시켜 사용하였다. 가성소다는 93% 순도의 제품(Showa, Japan)을 사용하였다.
- 전처리된 굴참나무로부터 얻은 효소당화액 중 90℃에서 4, 8% 수산화나트륨 전처리된 굴참나무로부터 얻은 두 가지 효소당화액만을 발효하였다. 발효 균주로는 Saccharomyces cerevisiae를 사용하였으며 Yeast Mould(YM) broth에서 24시간 배양하여 사용하였다. 여과한 효소당화액에 영양분을 첨가하여 멸균 후 당화액의 5%에 해당되는 효모를 접종하였다.
- 효소당화 및 발효 공정 중 시간에 따라 샘플을 채취하여 HPLC(high performance liquid chromatograph) (Shimadzu, Japan)를 이용해 샘플 내 단당류 또는 에탄올 농도를 측정하였으며 이를 통해 당화율 또는 발효율을 분석하였다. 컬럼(Aminex HPX-87H, 300 mm x 7.8 mm, Bio-Rad)과 굴절률 검출기(RID-10A, Shimadzu, Japan)를 사용하였다. 이동상으로는 50 mM 황산을 사용하였으며 온도 60℃, 유속 0.
- 가성소다는 93% 순도의 제품(Showa, Japan)을 사용하였다. 효소로는 Celluclast 1.5L과 Novozym 188(Novozyme, Denmark)을 사용하였다.
성능/효과
- 5%)가 주로 일어났으며 이에 따라 효소당화율이 70% 이상에 도달했다.12) 묽은 산 전처리에서는 자이란의 제거가 리그닌의 제거보다 효소당화에 큰영향을 끼치는 것으로 해석될 수 있다.
- 8%의 이론적 발효 수율을 나타냈다.18) 다른 바이오매스와 비교하여 이론적 발효율이 비슷한 정도에 도달하는 것을 확인하였으며 에탄올 생산 원재료로써 가능성을 확인하였다.
- 1) ISO(International Sugar Organization)가 2012년에 발표한 전 세계 에탄올 생산량은 2001년 166억 리터에서 2011년 834억 리터로 급증하였으며 동일년도 전체의 약 87%의 양을 미국과 브라질이 생산하는 것으로 보고하였다.2) 미국과 브라질은 넓은 경작지를 바탕으로 대규모 수확이 가능한 옥수수 및 사탕수수를 바이오매스 작물로 경작하여 바이오에탄올을 생산하고 있다. 옥수수나 사탕수수 등의 전분질계 또는 당질계 원료는 복잡한 구조로 이루어져 있지 않기에 발효에 보다 용이하다는 장점이 있다.
- 암모니아수를 이용한 침지 전처리는 바이오매스 내 존재하는 에스테르 결합을 끊어 리그닌이나 헤미셀룰로오스를 용해시켜 제거한다. 3종류의 초본류(옥수수 줄기, 담배 줄기, 대마 목부)를 암모니아수 침지 처리하여 효소당화한 결과, 자이란 제거와 효소당화율 증가는 상관관계가 낮게 나타났지만 리그닌제거는 상관관계가 크게 나타났다. 리그닌의 용출이 가장 큰 옥수수 줄기가 가장 높은 당화율을 나타냈고 리그닌 용출이 가장 작은 담배 줄기가 가장 낮은 효소당화 정도를 나타냈다.
- 온도와 농도가 증가할수록 효소당화율이 증가하는 경향이 나타났으며 화학적 성분(리그닌, 자이란)의 제거 뿐만 아니라 물리적 요인(결정화도 등)에 영향을 받은 것으로 판단된다. 또한 일부 조건에서 얻은 효소당화액을 효과적으로 발효하여 이론적 발효율이 89% 이상을 얻을 수 있던 것으로 보아 바이오에탄올을 얻기에 적합한 방법으로 생각된다.
- 옥수수 줄기의 묽은 산 전처리 결과, 산농도 및 온도를 증가함에 따라 자이란 분해속도가 증가하였다. 또한 자이란 제거량이 증가할수록 옥수수 줄기의 효소당화율도 향상되었으며 선형에 가까운 상관관계를 나타냈다. 하지만 리그닌의 경우 산농도 및 온도를 증가하여도 20% 이상 제거하는데 한계가 발견되었고 효소당화율과도 낮은 상관관계가 나타났다.
- 전처리 온도가 증가할수록 약간씩 리그닌의 제거량이 상승하였고 이런 경향은 염기의 농도를 달리했을 경우와 비슷하였다(Table 3). 리그닌에서처럼 자이란 또한 전처리 온도가 상승할수록 더 많이 제거되었으며 90℃에서 가장 많이 용해되어 제거된 것으로 나타났다. 글루코오스 및 다른 단당들 또한 전처리 온도 상승에 따라 제거량이 조금씩 상승하는 경향을 나타내었다.
- 3종류의 초본류(옥수수 줄기, 담배 줄기, 대마 목부)를 암모니아수 침지 처리하여 효소당화한 결과, 자이란 제거와 효소당화율 증가는 상관관계가 낮게 나타났지만 리그닌제거는 상관관계가 크게 나타났다. 리그닌의 용출이 가장 큰 옥수수 줄기가 가장 높은 당화율을 나타냈고 리그닌 용출이 가장 작은 담배 줄기가 가장 낮은 효소당화 정도를 나타냈다.13)
- 1은 동일 알칼리 농도(13% NaOH, w/v)에서 온도를 45-90℃까지 변화를 주어 전처리한 굴참목분의 효소당화 나타냈다. 모든 전처리재가 미전 처리재에 비해 높은 당화정도을 나타냈으며 특히 90℃ 전처리온도에서의 굴참목분이 가장 큰 당화정도를 나타냈다(Fig. 1). 이는 90℃에서 효소당화를 억제하는 물리적 요인인 리그닌(24.
- 2에 나타냈다. 수산화나트륨 농도가 증가할수록 효소당화율을 증가하는 것으로 나타났다. 하지만 수산화나트륨 농도에 따른 화학적 성분 제거와 효소당화가 큰 상관관계를 나타내지는 않았다.
- 8% 정도의 리그닌이 제거되었으며 수산화나트륨 4%를 제외하고 농도가 증가함에 따라 리그닌 제거량이 약간 상승하였지만 그 차이는 매우 미비하였다. 수산화나트륨 수용액의 농도가 4%였을 때 자이란의 47.0%가 제거되었으며 8% 이상의 농도에서는 보다 많은 70.0% 이상의 자이란이 제거됨을 확인할 수 있었다. 하지만 8, 13, 18% 농도에서는 자이란 제거의 뚜렷한 차이는 나타나지 않았다.
- 2%(90℃-8% NaOH) 로 나타났다. 수산화칼슘으로 전처리된 옥수수대를 효소 당화 후 발효한 결과, 93.2%의 발효율을 나타냈다.17) 또한 분쇄 전처리된 사탕수수 찌꺼기(sugar cane bagasse)와 밀짚 효소 당화액을 발효하여 89.
- 가장 일반적인 전처리 방법인 묽은 산 전처리는 산 조건에서 쉽게 분해되는 자이란 및 글루코만난 계열의 헤미셀룰로오스를 제거한다. 옥수수 줄기의 묽은 산 전처리 결과, 산농도 및 온도를 증가함에 따라 자이란 분해속도가 증가하였다. 또한 자이란 제거량이 증가할수록 옥수수 줄기의 효소당화율도 향상되었으며 선형에 가까운 상관관계를 나타냈다.
- 전처리되지 않은 굴참목분에 비해 전처리 후 효소당화가 증가하였으며 이러한 원인이 염기 전처리에 의한 리그닌 및 자이란 제거에 따른 효과라고 판단된다. 온도와 농도가 증가할수록 효소당화율이 증가하는 경향이 나타났으며 화학적 성분(리그닌, 자이란)의 제거 뿐만 아니라 물리적 요인(결정화도 등)에 영향을 받은 것으로 판단된다. 또한 일부 조건에서 얻은 효소당화액을 효과적으로 발효하여 이론적 발효율이 89% 이상을 얻을 수 있던 것으로 보아 바이오에탄올을 얻기에 적합한 방법으로 생각된다.
- 각기 다른 조건에서 전처리된 효소당화액은 둘 다 12시간 때 대부분의 글루코오스를 소모하여 에탄올로 전환시켰으며 최대 에탄올 농도를 나타냈다. 이론적 발효율은 12시간 때 각각 90.9%(90℃-4% NaOH)와 89.2%(90℃-8% NaOH) 로 나타났다. 수산화칼슘으로 전처리된 옥수수대를 효소 당화 후 발효한 결과, 93.
- 11) 목질계 바이오매스인 올리브나무에서도 유사한 결과가 나타났다. 저농도(1.4% H2SO4, w/w), 190-210℃ 고온 조건에서 묽은 산 가수분해를 진행한 결과, 목재 내 존재하는 리그닌의 분해보다는 자이란의 분해(86.5%)가 주로 일어났으며 이에 따라 효소당화율이 70% 이상에 도달했다.12) 묽은 산 전처리에서는 자이란의 제거가 리그닌의 제거보다 효소당화에 큰영향을 끼치는 것으로 해석될 수 있다.
- 수산화나트륨 수용액의 농도를 달리한 전처리 전후 굴참나무 목분의 화학조성 및 당조성 변화를 Table 2에 나타내었다. 전처리 후 굴참나무 목분의 리그닌과 자이란이 선택적으로 제거되었으며 특히 자이란의 제거가 뚜렷하게 나타났다(Table 2). 염기 전처리 후 23.
후속연구
- 14-16) 수산화나트륨 수용액 7%에서 전처리 온도를 바꾸어 자작나무의 효소당화를 연구한 결과 온도가 올라갈수록 결정화도가 떨어졌고, 이러한 결정화도 감소가 추후 효소당화를 촉진시키는 주요 인자라고 추정하였다.7) 따라서 본 연구에서도 온도 및 농도에 따른 결정화도와 같은 물리적 요인이 효소당화에 영향을 끼친 것으로 추정되며 추후 연구에서 보다 정확한 분석이 요구된다.
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