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문제 정의
- 국내에서는 2014년 근채류인 마늘, 양파를 대상으로 사용등록을 추진함에 따라, 각 작물의 섭취량 및 아클로니펜의 인체 위해도를 고려하여 잔류허용기준 설정을 추진하고 있다. 따라서 본 연구에서는 국내에 유통되는 농산물에 잔류할 수 있는 아클로니펜에 대한 안전관리를 위하여 잔류허용기준 초과유무를 확인할 수 있는 분석법을 확립하고자 하였다.
- 본 연구에서는 고추, 감귤, 아몬드 중 아클로니펜의 최적 추출용매를 선정하기 위해서 식품 및 농산물 검체의 잔류농약 추출에 주로 사용되는 수용성 유기용매인 아세톤, 아세토니트릴, 메탄올의 추출 효율을 비교하였다. 세 용매 모두 90% 이상의 우수한 추출효율을 보였으나, 아세톤으로 추출 시 효율이 가장 높았고 아클로니펜의 머무름 시간대에 간섭물질이 존재하지 않아 이를 추출용매로 선정하였다.
- 이 연구는 농산물 중 아클로니펜의 안전관리를 위한 공정분석법을 확립하기 위하여 수행하였으며 분석법의 선택성, 검출한계 및 정량한계, 회수율에 대한 검증을 통하여 아클로니펜의 공정시험법으로의 유효성을 확인하였다. 아클로니펜의 이화학적 특징에 따라 분석기기는 GC-ECD를 사용하였고, 아세톤 추출 후 실리카 카트리지를 이용하여 정제하였다.
제안 방법
- 8%이었고, 분석오차는 8% 미만으로 잔류물 분석에 관한 CODEX 가이드라인(Codex Alimentarius Commission, CAC/GL 40)의 잔류농약 분석 기준에 적합함을 확인할 수 있었다(Table 4). GC-ECD를 이용하여 분석한 고추, 감귤, 아몬드 중 아클로니펜 회수율 크로마토그램을 Fig. 2에 제시하였다.
- 개발한 아클로니펜 분석법의 직선성(linearity), 검출한계(limit of detection, LOD) 및 정량한계(limit of quantification,LOQ), 회수율(recovery), 재현성(reproducibility)에 대해 유효성을 검증하였다. 직선성의 확인을 위하여 아클로니펜 표준용액 0.
- 검체 중 아클로니펜의 재확인을 위해 분자량 범위 50-500 m/z의 스캔모드에서 표준용액을 주입하여 총이온크로마토그램과 질량 스펙트럼을 확인하였다(Fig. 3). 아클로니펜의 분자량은 264.
- 7%가 회수되어 헥산/디클로로메탄을 용매로 사용하는 것이 보다 효과적임을 확인할 수 있었다(Table 3). 따라서 실리카 카트리지를 본 실험의 정제 카트리지로 헥산/디클로로메탄을 정제용매로 선택하였으며, 정제조건의 최적화를 위해 용매의 극성도를 순차적으로 조절하여 정제 실험을 추가로 실시하였다. 헥산/디클로로메탄 (80/20, v/v), 헥산/디클로로메탄 (75/25, v/v), 헥산/디클로로메탄 (65/35, v/v), 헥산/디클로로메탄 (60/40, v/v), 헥산/디클로로메탄 (55/45, v/v)으로 세분화하여 각 용매 조성에 대해 5 mL 씩 4개의 분획을 받아 정제 테스트를 진행한 결과 헥산/디클로로메탄 (55/45 v/v) 10 mL에서 가장 높은 회수율을 보였고, 헥산/디클로로메탄 (80/20, v/v) 10 mL로 용출해 주었을 때 다양한 간섭물질로부터 아클로니펜을 효과적으로 정제할 수 있었다.
- 8%였으며, 분석오차는 8% 이하로 코덱스 가이드라인 (CAC/GL 40)에 적합하였다. 또한 GC-MS를 이용한 재확인 과정을 통해 분석법의 신뢰성을 확보하였다. 따라서 본 분석법의 정확성 및 재현성이 입증되어 농산물 중 아클로니펜의 잔류분석에 적용할 수 있을 것으로 판단된다.
-
GC-MS 분석조건
분석법의 신뢰성 확보를 위해 기체크로마토그래프-질량분석기(GC-MS, Agilent Technologies 5793MSD, Agilent, CA, USA)를 이용하여 재확인 과정을 수행하였다. 분석용 칼럼은 DB-5MS capillary column (0.
- 또한, 검출한계와 정량한계는 크로마토그램상에서 신호 대 잡음비 (S/N ratio) 각각 3, 10 이상으로 하였다. 분석법의 정확성 및 재현성을 평가하기 위하여 각 식품군별 대표작물인 고추, 감귤, 아몬드의 무처리 시료에 아클로니펜 표준용액을 첨가한 후 분석하여 회수율을 구하였다. 처리농도는 정량한계, 정량한계의 10배, 정량한계의 50배에 해당하는 농도로 수행하였으며 각각의 농도 및 시료에 대하여 5반복으로 수행하여 평균과 상대표준편차(relative standard deviation, RSD)를 계산하였다.
- 분석법의 정확성과 재현성 및 효율성을 평가하기 위하여 정량한계, 정량한계의 10배, 정량한계의 50배 수준인 0.005, 0.05와 0.25 mg/kg의 처리농도로 회수율 실험을 5반복 수행하였다. 평균 회수율은 고추에서 92.
- 분석용 칼럼은 DB-5MS capillary column (0.25 mm i.d. ×30 m, 0.25 μm; Agilent Technologies CA, USA), 이동상가스(He) 유량은 1 mL/min, 주입량은 1 μL로 splitless mode를 이용하여 분석하였다.
- 37인 비극성 화합물로 분자 구조상 ECD에 선택적으로 감응하는 할로겐 원소와(염소,chlorine) 질산기(nitrate)를 포함하고 있어 GC-ECD를 분석기기로 선정하였다(Table 2). 분석용 칼럼은 여러 종류의 물질에 광범위하게 사용 가능한 비극성 칼럼인 DB-5를 사용하였으며, 아클로니펜의 기기상 감도를 높이고 시료에 존재하는 간섭물질로부터 선택적으로 분리하기 위하여 칼럼의 승온 온도를 조절하여 최적의 기기분석 조건을 확립하였다. 이때 아클로니펜의 머무름 시간은 11분대로 확인하였다(Fig.
- 아클로니펜 표준품 20.8 mg을 아세톤 20 mL에 용해하여 1,000 μg/mL의 표준원액을 제조하고, 이를 아세톤으로 희석하여 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 2.0 및 5.0 μg/mL의 표준용액을 제조하였다.
- 아클로니펜은 분자량이 264.7이고 증기압이 1.6 x 10-2mPa (20℃)이며 옥탄올/물 분배계수(Log Pow)가 4.37인 비극성 화합물로 분자 구조상 ECD에 선택적으로 감응하는 할로겐 원소와(염소,chlorine) 질산기(nitrate)를 포함하고 있어 GC-ECD를 분석기기로 선정하였다(Table 2). 분석용 칼럼은 여러 종류의 물질에 광범위하게 사용 가능한 비극성 칼럼인 DB-5를 사용하였으며, 아클로니펜의 기기상 감도를 높이고 시료에 존재하는 간섭물질로부터 선택적으로 분리하기 위하여 칼럼의 승온 온도를 조절하여 최적의 기기분석 조건을 확립하였다.
- 아클로니펜의 분석은 기체크로마토그래프-전자포획검출기(GC-ECD, Agilent GC model 6890A, Agilent, CA, USA)를 사용하였고, 분석용 칼럼은 DB-5(0.25 mm i.d. ×30 m, 0.25 μm; Agilent Technologies CA, USA), 이동상가스(N2) 유량은 1 mL/min, 주입량은 1 μL로 split mode (50:1)를 이용하여 분석하였다.
- 아클로니펜의 선택성(Selectivity)은 표준용액, 무처리 시료, 표준용액을 첨가한 회수율 시료의 크로마토그램을 서로 비교하여 평가하였다. 무처리 시료와 표준용액을 첨가한 시료를 확립된 시험방법에 따라 분석한 결과, 무처리 시료 중 아클로니펜과 같은 머무름 시간을 갖는 어떠한 간섭물질도 검출되지 않아 검체 중 아클로니펜 분석을 위해 확립된 본 분석법의 높은 분리능과 선택성을 확인할 수 있었다.
- 이 연구는 농산물 중 아클로니펜의 안전관리를 위한 공정분석법을 확립하기 위하여 수행하였으며 분석법의 선택성, 검출한계 및 정량한계, 회수율에 대한 검증을 통하여 아클로니펜의 공정시험법으로의 유효성을 확인하였다. 아클로니펜의 이화학적 특징에 따라 분석기기는 GC-ECD를 사용하였고, 아세톤 추출 후 실리카 카트리지를 이용하여 정제하였다. 개발된 분석법의 회수율은 고추에서 92.
- 식품공전에서는 아세톤 및 아세토니트릴을 추출용매로 사용하여 비페녹스, 포메사펜, 아시풀루오르펜을 추출하고 비극성 용매인 디클로로메탄을 이용하여 액-액 분배를 한 후, 플로리실(florisil)을 흡착제로 하는 흡착크로마토그래피를 통한 정제과정을 거쳐 GC-ECD 또는 HPLC-UVD로 기기분석을 하도록 제시하고 있다(MFDS, 2014). 이 원리를 적용하여 분석법을 설계하였으며, 분석 대상작물로는 근채류가 포함된 식품분류인 채소류 중 고추를 대표농산물로 선정하였고, 추가적으로 유럽연합의 기준에 설정되어있는 과일류 및 견과종실류를 대표하는 농산물인 감귤과 아몬드를 선정하여 분석법을 확립하였다.
- 7이나 이는 분자 내의 염소원자의 두 개의 안정한 동위원소(35Cl, 37Cl)가 존재하는 비율을 고려하여 계산한 평균분자량이며, 실제로는 분자량이 264와 266인 아클로니펜이 각각 76%, 24%의 비율로 존재한다. 이 중 자연계에 많이 존재하는 35Cl을 포함한 264 m/z을 선택하여 검출하였으며 동시에 37Cl로 인하여 발생하는 266 m/z 이온의 존재와 264 m/z와의 비율도 확인하였다. Fig.
- 그러나 1차 정제과정을 거친 후의 추출액은 여전히 검체의 일부 불순물을 포함하고 있으며, 기기분석 시 많은 간섭물질이 존재하므로 SPE 카트리지를 이용한 2차 정제과정이 요구되었다. 정제과정 확립을 위해 플로리실과 실리카 카트리지의 회수율을 비교 실험하였는데 실리카 카트리지에서 더 높은 회수율을 보였고 플로리실 카트리지의 아클로니펜에 대한 흡착성이 상대적으로 약한 것으로 보여 실리카 카트리지를 2차 정제에 사용하였다. 효과적인 정제를 위해 헥산/아세톤, 헥산/에틸 아세테이트, 헥산/디클로로메탄 90/10 (v/v), 70/30 (v/v) 각각의 용매 조성으로 정제효율을 비교하였다.
- 주입구 온도는 260℃, interface 온도는 260℃이었으며, 오븐온도는 100℃에서 검체를 주입하고 10℃씩 270℃까지 승온한 후 10분간 유지하였다. 질량분석기 조건은 EI(electron impact ionization, 70 eV)를 이용하여 분자량 범위 50-500 m/z의 스캔 모드에서 총이온크로마토그램과 질량 스펙트럼을 확인하고 최적의 특성이온을 선정하였고, 선정된 이온만을 분석하는 SIM(selected ion monitoring) 모드로 재확인하였다.
- 세 용매 모두 90% 이상의 우수한 추출효율을 보였으나, 아세톤으로 추출 시 효율이 가장 높았고 아클로니펜의 머무름 시간대에 간섭물질이 존재하지 않아 이를 추출용매로 선정하였다. 추출 후 검체추출액은 1차적으로 불순물 제거를 위해 디클로로메탄을 이용한 액-액 분배법을 적용하였으며, 포화식염수를 첨가하여 염석효과를 통해 분배효율을 향상시켰다. 또한 50% 이상의 유지성분을 함유하고 있는 지방성 식품인 아몬드의 경우 아세톤으로 추출 시 다량의 유지성분이 동시에 추출되어 농축 후에서 잔여물이 남게 되는데 이와 같은 유지 및 비극성 성분의 정제를 위해 추가적으로 헥산/아세토니트릴 분배법을 적용하였다.
- 정제과정 확립을 위해 플로리실과 실리카 카트리지의 회수율을 비교 실험하였는데 실리카 카트리지에서 더 높은 회수율을 보였고 플로리실 카트리지의 아클로니펜에 대한 흡착성이 상대적으로 약한 것으로 보여 실리카 카트리지를 2차 정제에 사용하였다. 효과적인 정제를 위해 헥산/아세톤, 헥산/에틸 아세테이트, 헥산/디클로로메탄 90/10 (v/v), 70/30 (v/v) 각각의 용매 조성으로 정제효율을 비교하였다. 헥산/아세톤, 헥산/에틸 아세테이트의 경우 90/10 (v/v), 70/30 (v/v)의 각 조성으로 정제 실험을 한 결과 카트리지에 아클로니펜이 흡착된 후 바로 용출되어 정제 용매로 사용하기 어려웠지만, 헥산/디클로로메탄의 경우 70/30 (v/v)의 용매조성에서 시료 로딩 후 15 mL를 가했을 때 초기 5 mL에서는 아클로니펜이 용출되지 않고, 10∼15 mL에서 아클로니펜 105.
대상 데이터
- 또한 염화나트륨(sodiumchloride)과 무수 황산나트륨(sodium sulfate anhydrous)은 Wako(Osaka, Japan)로부터, 실리카 SPE 카트리지(silica SPE cartridge)는 Waters(Milford, MA, USA)로부터 구입하였다. 검체는 국내 사용기준 설정을 위한 고추(채소류)와 그 외의 농산물인 감귤(과일류), 아몬드(견과종실류) 모두 시중에 유통 중인 무농약 농산물을 구입하여 균질화한 후 밀봉된 용기에 담아 -50℃에 보관하고 실험에 사용하였다.
- Ehrenstofer GmbH(Augsburg, Germany)사 에서 구입하여 분석물질로 사용하였고, 전처리용 시약으로 사용된 아세톤(acetone), 디클로로메탄(dichloromethane), 아세토니트릴(acetonitrile), 헥산(n-hexane) 등은 HPLC 등급으로써 Merck(Darmstadt,Germany)에서 구입하여 사용하였다. 또한 염화나트륨(sodiumchloride)과 무수 황산나트륨(sodium sulfate anhydrous)은 Wako(Osaka, Japan)로부터, 실리카 SPE 카트리지(silica SPE cartridge)는 Waters(Milford, MA, USA)로부터 구입하였다. 검체는 국내 사용기준 설정을 위한 고추(채소류)와 그 외의 농산물인 감귤(과일류), 아몬드(견과종실류) 모두 시중에 유통 중인 무농약 농산물을 구입하여 균질화한 후 밀봉된 용기에 담아 -50℃에 보관하고 실험에 사용하였다.
- 본 연구에서는 고추, 감귤, 아몬드 중 아클로니펜의 최적 추출용매를 선정하기 위해서 식품 및 농산물 검체의 잔류농약 추출에 주로 사용되는 수용성 유기용매인 아세톤, 아세토니트릴, 메탄올의 추출 효율을 비교하였다. 세 용매 모두 90% 이상의 우수한 추출효율을 보였으나, 아세톤으로 추출 시 효율이 가장 높았고 아클로니펜의 머무름 시간대에 간섭물질이 존재하지 않아 이를 추출용매로 선정하였다. 추출 후 검체추출액은 1차적으로 불순물 제거를 위해 디클로로메탄을 이용한 액-액 분배법을 적용하였으며, 포화식염수를 첨가하여 염석효과를 통해 분배효율을 향상시켰다.
- 아클로니펜(Table 1) 표준품(99.6%)은 Dr. Ehrenstofer GmbH(Augsburg, Germany)사 에서 구입하여 분석물질로 사용하였고, 전처리용 시약으로 사용된 아세톤(acetone), 디클로로메탄(dichloromethane), 아세토니트릴(acetonitrile), 헥산(n-hexane) 등은 HPLC 등급으로써 Merck(Darmstadt,Germany)에서 구입하여 사용하였다. 또한 염화나트륨(sodiumchloride)과 무수 황산나트륨(sodium sulfate anhydrous)은 Wako(Osaka, Japan)로부터, 실리카 SPE 카트리지(silica SPE cartridge)는 Waters(Milford, MA, USA)로부터 구입하였다.
데이터처리
- 직선성의 확인을 위하여 아클로니펜 표준용액 0.05-5 μg/mL의 농도 범위에 대한 각각의 피크 면적을 이용하여 검량선을 작성하였고, 검량선의 상관계수(coefficient of correlation, r2)를 구하였다.
- 분석법의 정확성 및 재현성을 평가하기 위하여 각 식품군별 대표작물인 고추, 감귤, 아몬드의 무처리 시료에 아클로니펜 표준용액을 첨가한 후 분석하여 회수율을 구하였다. 처리농도는 정량한계, 정량한계의 10배, 정량한계의 50배에 해당하는 농도로 수행하였으며 각각의 농도 및 시료에 대하여 5반복으로 수행하여 평균과 상대표준편차(relative standard deviation, RSD)를 계산하였다.
이론/모형
- This study was carried out with the support of “afetyEvaluation and Analysis Method on Pesticide Residues in Foods-2014(14161MFDS009)”fromMinistry of Food and Drug Safety, Republic of Korea in 2014.
- 추출 후 검체추출액은 1차적으로 불순물 제거를 위해 디클로로메탄을 이용한 액-액 분배법을 적용하였으며, 포화식염수를 첨가하여 염석효과를 통해 분배효율을 향상시켰다. 또한 50% 이상의 유지성분을 함유하고 있는 지방성 식품인 아몬드의 경우 아세톤으로 추출 시 다량의 유지성분이 동시에 추출되어 농축 후에서 잔여물이 남게 되는데 이와 같은 유지 및 비극성 성분의 정제를 위해 추가적으로 헥산/아세토니트릴 분배법을 적용하였다. 그러나 1차 정제과정을 거친 후의 추출액은 여전히 검체의 일부 불순물을 포함하고 있으며, 기기분석 시 많은 간섭물질이 존재하므로 SPE 카트리지를 이용한 2차 정제과정이 요구되었다.
성능/효과
- 아클로니펜의 이화학적 특징에 따라 분석기기는 GC-ECD를 사용하였고, 아세톤 추출 후 실리카 카트리지를 이용하여 정제하였다. 개발된 분석법의 회수율은 고추에서 92.3-95.0%, 감귤에서 74.3-90.4%, 아몬드에서 76.7-89.8%였으며, 분석오차는 8% 이하로 코덱스 가이드라인 (CAC/GL 40)에 적합하였다. 또한 GC-MS를 이용한 재확인 과정을 통해 분석법의 신뢰성을 확보하였다.
- 아클로니펜의 선택성(Selectivity)은 표준용액, 무처리 시료, 표준용액을 첨가한 회수율 시료의 크로마토그램을 서로 비교하여 평가하였다. 무처리 시료와 표준용액을 첨가한 시료를 확립된 시험방법에 따라 분석한 결과, 무처리 시료 중 아클로니펜과 같은 머무름 시간을 갖는 어떠한 간섭물질도 검출되지 않아 검체 중 아클로니펜 분석을 위해 확립된 본 분석법의 높은 분리능과 선택성을 확인할 수 있었다. 아클로니펜의 직선성(linearity)을 확인하기 위하여 0.
- 005 mg/kg이다. 본 분석법의 정량한계는 EU에 설정되어있는 최저 잔류허용기준인 0.05 mg/kg의 절반 미만으로 본 분석법의 정량한계로 적합한 수준이었다(Table 4).
- 아클로니펜의 검출한계는 기기 크로마토그램 상에서 신호 대 잡음비(S/N ratio) 3이상으로 결정하여 분석기기의 최소검출량이 0.01 ng에 따른 검출한계는 0.001 mg/kg이었고, 정량한계는 신호 대 잡음비(S/N ratio) 10 이상으로 결정하여 0.005 mg/kg이다. 본 분석법의 정량한계는 EU에 설정되어있는 최저 잔류허용기준인 0.
- 아클로니펜의 직선성(linearity)을 확인하기 위하여 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 2.0 그리고 5 μg/mL 1 μL를 주입하여 분석한 결과 상관계수(r2)가 0.999 이상으로 높은 직선성을 보였다(Table 4, Fig. 1).
- 25 mg/kg의 처리농도로 회수율 실험을 5반복 수행하였다. 평균 회수율은 고추에서 92.3-95.0%, 감귤에서 74.3-90.4%, 아몬드에서 76.9-89.8%이었고, 분석오차는 8% 미만으로 잔류물 분석에 관한 CODEX 가이드라인(Codex Alimentarius Commission, CAC/GL 40)의 잔류농약 분석 기준에 적합함을 확인할 수 있었다(Table 4). GC-ECD를 이용하여 분석한 고추, 감귤, 아몬드 중 아클로니펜 회수율 크로마토그램을 Fig.
- 따라서 실리카 카트리지를 본 실험의 정제 카트리지로 헥산/디클로로메탄을 정제용매로 선택하였으며, 정제조건의 최적화를 위해 용매의 극성도를 순차적으로 조절하여 정제 실험을 추가로 실시하였다. 헥산/디클로로메탄 (80/20, v/v), 헥산/디클로로메탄 (75/25, v/v), 헥산/디클로로메탄 (65/35, v/v), 헥산/디클로로메탄 (60/40, v/v), 헥산/디클로로메탄 (55/45, v/v)으로 세분화하여 각 용매 조성에 대해 5 mL 씩 4개의 분획을 받아 정제 테스트를 진행한 결과 헥산/디클로로메탄 (55/45 v/v) 10 mL에서 가장 높은 회수율을 보였고, 헥산/디클로로메탄 (80/20, v/v) 10 mL로 용출해 주었을 때 다양한 간섭물질로부터 아클로니펜을 효과적으로 정제할 수 있었다.
- 헥산/아세톤, 헥산/에틸 아세테이트의 경우 90/10 (v/v), 70/30 (v/v)의 각 조성으로 정제 실험을 한 결과 카트리지에 아클로니펜이 흡착된 후 바로 용출되어 정제 용매로 사용하기 어려웠지만, 헥산/디클로로메탄의 경우 70/30 (v/v)의 용매조성에서 시료 로딩 후 15 mL를 가했을 때 초기 5 mL에서는 아클로니펜이 용출되지 않고, 10∼15 mL에서 아클로니펜 105.7%가 회수되어 헥산/디클로로메탄을 용매로 사용하는 것이 보다 효과적임을 확인할 수 있었다(Table 3).
후속연구
- 또한 GC-MS를 이용한 재확인 과정을 통해 분석법의 신뢰성을 확보하였다. 따라서 본 분석법의 정확성 및 재현성이 입증되어 농산물 중 아클로니펜의 잔류분석에 적용할 수 있을 것으로 판단된다.
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