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문제 정의
- 본 연구에서는 암모니아 노출에 따른 조피볼락의 생리학적 반응을 조사하고자 아가미 Na+/K+-ATPase (NKA) 활성을 비롯한 혈장 parameters를 분석하였다. 실험구의 암모니아 농도는 대조구(자연해수), 1, 2, 4, 8 mg L-1였으며, 조피볼락을 각각의 실험구에 3시간동안 노출한 다음 혈액 및 아가미 조직을 샘플링하였다.
- 본 연구에서는 우리나라에서 주요 양식대상종인 조피볼락을 대상으로 HEA에 급성 노출시켰을 때, 그 생리학적 반응으로 아가미 Na+/K+-ATPase 활성, 호르몬적 변화 등을 조사하고자 하였다.
제안 방법
- 10% 중성포르말린에 고정된 아가미 조직은 상법에 따라 파라핀으로 포매하여 5 μm 두께로 절편한 후, haematoxylin-eosin으로 염색하여 광학현미경(Axioskop 2 plus: Carl Zeiss, Jena, Germany)과 화상분석시스템(AxioVision Rel., ver 4.6, Germany)으로 관찰하였다.
- NKA 측정을 위한 모든 시약은 Sigma (USA) 제품을 사용하였다. Ouabain 유무에 따른 무기인함량은 Phosphate Colorimetric Assay Kit (BioVision, USA) 를 사용하여 650 nm에서 측정하였으며, 조직내 단백질함량은 Pierce BCA Protein kit (Thermo, USA)로 측정하였다. 최종 NKA 활성은 μmol Pi mg-1 protein h-1로 나타내었다.
- -ATPase (NKA) 활성을 비롯한 혈장 parameters를 분석하였다. 실험구의 암모니아 농도는 대조구(자연해수), 1, 2, 4, 8 mg L-1였으며, 조피볼락을 각각의 실험구에 3시간동안 노출한 다음 혈액 및 아가미 조직을 샘플링하였다. 실험구의 암모니아 농도가 높아질수록 혈장 암모니아 농도가 증가하였으며, 아가미 NKA 활성 또한 증가하는 경향을 보였다.
- 실험어의 암모니아 노출은 3시간으로 하였으며, DO는 6 mg L-1 이상이 유지되도록 에어레이션을 해 주었다. 실험기간 동안 모든 실험어는 생존하였다.
- 아가미 NKA 활성은 Hwang et al. (1989)의 방법을 변형하여 측정하였다. 냉동된 새변 절편(약 20~25 mg)을 SEI 용액(200 mM Sucrose, 5 mM Na2 EDTA, 100 mM Imidazole-Hcl buffer, pH 7.
- 암모니아에 대한 생리학적 반응을 조사하기 위하여, 실험어가 수용된 각 수조를 지수상태로 전환시킨 다음, NH4Cl (Junsei, Japan)을 첨가하여 총 질소의 양이 각각 0, 5, 20, 50, 100 mg L-1이 되도록 하였다. 이 후 각 수조의 pH 및 NH4+를 측정하여 이온화 되지 않은 상태인 NH3를 아래 식으로 계산하였으며, 계산된 NH3 농도를 바탕으로 총 5개의 실험구(대조구, 1, 2, 4, 8 mg L-1구)를 설정하였다(Table 1).
- 이 되도록 하였다. 이 후 각 수조의 pH 및 NH4+를 측정하여 이온화 되지 않은 상태인 NH3를 아래 식으로 계산하였으며, 계산된 NH3 농도를 바탕으로 총 5개의 실험구(대조구, 1, 2, 4, 8 mg L-1구)를 설정하였다(Table 1).
- 혈장 코티졸은 cortisol EIA kit (Oxford, USA)를 사용하여 효소면역분석 (enzyme immunoassay, EIA)로 측정하였으며, 간략히 설명하자면 다음과 같다: ethyl ether를 사용하여 혈장 100 μL로부터 cortisol을 추출한 후, 유기상(organic phase)을 분리 하여 이를 N2 가스로 증발시켰다.
- 혈장의 암모니아, 글루코스, Na+, Cl-은 생화학자동분석기(Dry-chem 4000i, Fujifilm, Japan)로, 삼투질농도는 삼투압측정기(Vapro 5520, WESCOR, USA)로 측정하였다.
대상 데이터
- 국립수산과학원(부산시 기장군) 15톤 콘크리트 사각수조에서 사육중인 조피볼락(평균 전장 26.9±0.3 cm, 체중 301.1±8.0 g) 중 40마리를 무작위로 잡아 5개의 유수식 FRP 수조(수용적 300 L)에 각각 8마리씩을 수용하여 7일간 적응시켰다.
- 암모니아 노출에 따른 혈액 및 조직 샘플링은 각 실험구의 모든 실험어를 대상으로 실시하였다. 실험어를 150 ppm의 tricaine methanesulphanate (MS-222, Sigma, USA)로 마취한 다음, heparin sodium 처리된 주사기 (3 mL)로 실험어의 미부혈관으로부터 혈액을 채취하여 일부는 Ht 측정에 사용하였으며, 나머지는 원심분리(4℃, 10000 rpm, 15분)후 혈장을 분리하여 분석전까지 -80℃의 초저온 냉동고에 보관하였다.
데이터처리
- 실험결과의 자료값은 평균±표준오차로 나타내었으며, SPSS 통계프로그램(ver. 17.0)을 사용하여 one way ANOVA 및 Duncan’s multiple range test로 유의성을 검정하였다(P<0.05).
성능/효과
- 암모니아 노출에 따른 조피볼락의 혈장 코티졸은 암모니아 농도와 선형 관계를 보였으며, 혈장 글루코스 또한 코티졸과 동반상승하는 것으로 나타났다. 1, 2 mg L-1구의 hematocrit는 대조구와 차이를 보이지 않았으나, 4, 8 mg L-1구는 나머지 실험구보다 유의하게 높았다. 암모니아 농도가 높을수록 아가미 조직 손상은 심하였으며, 특히 4, 8 mg L-1구에서는 상피세포의 과증식, 분리, 괴사 및 2차새변의 곤봉화(club-shaped lamella) 현상이 관찰되었다.
- 혈중 암모니아의 증가는 외부에서 유입되는 암모니아 양이 능동 수송으로 배출하는 양보다 많기 때문인 것으로 보인다. 본 연구에서 암모니아의 능동 배출은 NKA 활성을 통해 알 수 있는데, NKA 활성 증가는 체내의 암모니아 농도가 대조구의 수준을 넘어서는 시점부터 나타난 것으로 보여 지며, 체내의 암모니아 농도가 높아질수록 NKA 활성의 증가가 높아지는 것은 체내의 암모니아 농도를 감소시키기 위한 생리적 반응으로 보인다. 이처럼 외부의 암모니아가 높을수록 NKA 활성의 증가는 여러 경골어류에서 보고되고 있다(Alam and Frankel 2006; Chew et al.
- Ht는 혈중의 적혈구 용적을 나타내며 어종에 따라 매우 다르게 나타난다. 본 연구에서는 암모니아 노출시 혈장 코티졸 및 글루코스의 상승을 고려해볼 때, Ht의 상승 또한 예상해 볼 수 있었으나, 4 및 8 mg L-1구에서만 상승이 나타났다. 대서양 연어에서도 암모니아 노출시 Ht의 상승이 나타나고 있지만(Fivelstad et al.
- 어류는 이러한 메커니즘을 통해 체내의 암모니아를 배출하는데, 외부 환경의 암모니아 농도가 어체보다 높을 경우, 수중의 암모니아가 확산으로 인해 체내로 유입되어 체내의 암모니아 배출은 능동적인 수송에 의존할 수밖에 없는 상태가 된다. 본 연구에서는 외부의 암모니아 농도가 높아질수록 실험어의 혈중 암모니아는 증가하는 것으로 나타났다. 그러나 4 및 8 mg L-1구의 혈중 암모니아 농도가 각각 1950 μg dL-1 , 2140 μg dL-1로 큰 차이가 없었는데, 이는 혈액내 암모니아가 수용될 수 있는 양(대략 2000 μg dL-1 )이 정해져 있음을 알 수 있다.
- 실험구의 암모니아 농도는 대조구(자연해수), 1, 2, 4, 8 mg L-1였으며, 조피볼락을 각각의 실험구에 3시간동안 노출한 다음 혈액 및 아가미 조직을 샘플링하였다. 실험구의 암모니아 농도가 높아질수록 혈장 암모니아 농도가 증가하였으며, 아가미 NKA 활성 또한 증가하는 경향을 보였다. 혈장 Cl를 제외한 외부의 암모니아 영향을 받지 않았 으나, 4, 8 mg L-1구의 Na+, K+ 및 삼투질농도는 대조구및 1, 2 mg L-1구보다 유의하게 높았다.
- 혈장 Cl를 제외한 외부의 암모니아 영향을 받지 않았 으나, 4, 8 mg L-1구의 Na+, K+ 및 삼투질농도는 대조구및 1, 2 mg L-1구보다 유의하게 높았다. 암모니아 노출에 따른 조피볼락의 혈장 코티졸은 암모니아 농도와 선형 관계를 보였으며, 혈장 글루코스 또한 코티졸과 동반상승하는 것으로 나타났다. 1, 2 mg L-1구의 hematocrit는 대조구와 차이를 보이지 않았으나, 4, 8 mg L-1구는 나머지 실험구보다 유의하게 높았다.
- 1, 2 mg L-1구의 hematocrit는 대조구와 차이를 보이지 않았으나, 4, 8 mg L-1구는 나머지 실험구보다 유의하게 높았다. 암모니아 농도가 높을수록 아가미 조직 손상은 심하였으며, 특히 4, 8 mg L-1구에서는 상피세포의 과증식, 분리, 괴사 및 2차새변의 곤봉화(club-shaped lamella) 현상이 관찰되었다.
- 본 연구와는 반대로 터봇을 고농도 암모니아에 노출하였을 때 혈장 Na+가 오히려 감소하는 결과가 나타났으며, 이에 대하여 저자 들은 외부에 고농도의 NH4+가 존재할 때 Na+/NH4+-교환체가 Na+를 유입하지 못하고 다시 NH4+ 유입되기 때문이라고 설명하고 있다(Person-Le Ruyet 2003). 이러한 가능성들을 고려해 보면, 본 연구에서는 모든 실험구에서 암모니아 노출 3시간 이전에 이미 Na+의 감소가 나타났으며, 이후에 고농도일수록 아가미 손상이 빠르게 진행되어 삼투압 장애가 일어났을 가능성도 배제할 수는 없다. 혈장 K+의 경우 4 및 8 mg L-1구가 1 및 2 mg L-1구보다 농도가 높은 이유는 체내의 NH4+를 배출하기 위하여 4 및 8 mg L-1구에서 아가미 NKA의 활성이 더 높아져 이로 인해 혈액의 K+ 대신 NH4+를 상피세포로 유입시켜 혈액내 K+가 상대적으로 많아졌기 때문인 것으로 해석해 볼 수 있다.
- 이상의 결과를 종합해 보면, 수중의 고농도 암모니아는 확산에 의해 단시간내에 어체로 유입되며, 체내의 암모니아 농도가 높아질수록 어체는 아가미 NKA 활성을 높여 암모니아를 수중으로 배출하는 것으로 나타났다. 그러나 외부의 고농도 암모니아가 지속될 경우, 유입되는 암모니아 양이 배출되는 암모니아 보다 많아지게 되어 최종적으로 체내의 암모니아 축적이 발생되며, 이는 어체의 스트레스를 유발하는 요인으로 추정된다.
- 조피볼락 NKA 활성은 모든 실험구가 대조구보다 유의하게 높았으며, 실험구의 암노니아 농도가 높아질수록 아가미 NKA 활성 또한 증가하는 경향을 보였다. 특히 4 및 8 mg L-1구의 NKA 활성은 대조구보다 약 50% 높았다(Fig.
- 조피볼락의 Ht는 대조구 및 1, 2 mg L-1구에서는 32.8±28~34.8±1.3%로 서로간 유의한 차이가 없었으나, 4, 8 mg L-1구에서는 각각 42.3±1.2%, 43.0±1.0%로 나머지 실험구보다 유의하게 높았다(Fig. 4).
- 조피볼락의 혈장 암모니아 농도는 외부의 암모니아가 증가함에 따라 높아지는 것으로 나타났으나, 4 mg L-1구와 8 mg L-1구에서는 유의한 차이가 없었다(Fig. 1).
- Microplate를 세척한 후, 150 μL TMB 기질을 각 well에 넣은 후 30분 동안 반응시켜, microplate reader (ThermoScientific MultiskanSpectrum, Thermo, Finlan)로 650 nm에서 값을 측정하였다. 코티졸의 분석시 Inter-assay coefficients of variation (CV) 및 Intra-assay CV는 각각 12.1% 및 7.2%이었다.
- 조피볼락 NKA 활성은 모든 실험구가 대조구보다 유의하게 높았으며, 실험구의 암노니아 농도가 높아질수록 아가미 NKA 활성 또한 증가하는 경향을 보였다. 특히 4 및 8 mg L-1구의 NKA 활성은 대조구보다 약 50% 높았다(Fig. 2).
- 실험구의 암모니아 농도가 높아질수록 혈장 암모니아 농도가 증가하였으며, 아가미 NKA 활성 또한 증가하는 경향을 보였다. 혈장 Cl를 제외한 외부의 암모니아 영향을 받지 않았 으나, 4, 8 mg L-1구의 Na+, K+ 및 삼투질농도는 대조구및 1, 2 mg L-1구보다 유의하게 높았다. 암모니아 노출에 따른 조피볼락의 혈장 코티졸은 암모니아 농도와 선형 관계를 보였으며, 혈장 글루코스 또한 코티졸과 동반상승하는 것으로 나타났다.
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