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문제 정의
- Trypsin 처리 casein hydrolysate (CH)은 가수분해정도에 따라 쓴맛이 강한 것으로 알려져 있어(25-28), 쓴맛의 강도가 2% Glyphe과 유사한 trypsin 처리 CH를 제조하여 쓴맛 개선 효과를 검토하기 위한 기질로 사용하고자 하였다. Trypsin을 사용한 쓴맛 CH의 제조는 Nishiwaki 등(19)의 방법을 다소 수정한 Kim 등(17)의 방법에 따라 제조하였다.
- Exopeptidase인 aminopeptidase를 산업적으로 이용하려는 시도로 단백질 가수분해물의 쓴맛 개선에 관한(17-22) 연구가 진행되었다. 본 연구에서는 살 오징어(T. pacificus)의 가공부산물인 간췌장의 효소자원으로서의 이용을 위하여, 쓴맛 개선능이 우수한 endoprotease와 aminopeptidase 획분들을 단백질 성질을 이용한 다양한 분획방법들로 분획한 다음, 이의 산업적 응용을 위하여 쓴맛개선을 위한 적용 조건에 대하여 구명하고자 하였다.
제안 방법
- Aminopeptidase 활성 획분 처리 쓴맛 개선 CH의 관능검사에 의한 쓴맛 개선의 정도는 앞서 서술한 쓴맛 평가 요원을 대상으로 1% Gly-phe 용액의 쓴맛을 기준점으로 하여 이보다 강하다(또는 약하다)고 느끼는 쓴맛 평가 요원의 인원수로 나타내는 방법과, 1% Gly-phe 용액의 쓴맛을 기준점(3점)으로 하고, 활성 획분 처리 가수분해물의 쓴맛이 이보다 약할수록 1-2점으로, 이보다 강할수록 4-5점으로 하는 5점 평점법으로 실시하여 평가하였다. 쓴맛 CH에 대한 활성 획분의 반응시간(0, 8, 16, 및 24 h)별 효소활성은 UV spectrophotometer (UV 2200, Hitachi Co.
- , Tokyo, Japan)의 파장을 214 nm로 하였다. HPLC 분석에 따른 쓴맛 개선의 정도는 가수분해시간과 효소/기질비에 따른 HPLC chromatogram상의 전체 펩타이드 분포 변화와 그 변화가 두드러진 피크의 변화정도(area %)로 검토하였다.
- 국내산 살 오징어 간췌장 조효소를 추출한 다음, 단백질 성질에 기초한 분획방법(용해도, 전기적 성질 및 분자량크기)으로 분획한 endoprotease 및 aminopeptidase 활성 획분들에 대한 분해 활성 비교한 다음, 이들 획분의 반응시간에 따른 쓴맛 casein 가수분해물의 쓴맛 개선 효과를 효소활성, 관능검사 및 HPLC 크로마토그램을 통하여 살펴보았다. 분획방법별 각 획분의 쓴맛 평가에 의한 쓴맛 개선 효과는 겔 여과법에 의하여 분획된 획분(GFI, 30-50 kDa)이 가장 효과적이었다.
- 분획방법별로 분획한 endoprotease와 aminopeptidase 활성 획분 처리 쓴맛 개선 가수분해물은 전체 반응액의 부피를 50 mL로 하여, 각 활성 획분과 쓴맛 CH (pH 7.5)를 1/2,000, 1/1,000 및 1/500(단백질 함량기준 효소와 기질비)의 농도비율로 혼합하고, 50℃에서 0, 8, 16 및 24 시간동안 각각 반응시킨 다음, 실활(100℃, 20 min), 냉각 및 원심분리(1,460×g, 20 min)하여 제조하였다.
- 쓴맛 개선 효과(Table 2)가 가장 우수한 aminopeptidase 활성 획분은 겔 여과법으로 분획한 GF-I 획분(30-50 kDa범위)이었으며, 이러한 결과를 토대로 GF-I 획분의 쓴맛 CH에 대한 가수분해 시간에 따른 효소활성 변화와 이의 쓴맛 변화정도를 농도별 Glyphe 쓴맛 표준용액과 비교하여 Fig. 2에 나타내었다. GF-I 획분과의 반응 4시간까지는 2% Gly-phe 용액에 준하는 쓴맛을 나타내었으나, 반응 8시간 이후부터 0.
- 쓴맛 개선능이 가장 뛰어난 것으로 확인된 aminopeptidase 활성 GF-I 획분에 대하여는 GF-I 획분의 가수분해 시간별(8-24시간) 그리고 기질비(500, 1,000 및 2,000)에 따른 쓴맛 개선 CH를 앞서 언급한 방법에 따라 제조하였다. 이어서 쓴맛 개선 가수분해물의 HPLC의 분석은 Kim 등(17)의 분석조건에 따라 실행하였다.
- 5)를 1/2,000, 1/1,000 및 1/500(단백질 함량기준 효소와 기질비)의 농도비율로 혼합하고, 50℃에서 0, 8, 16 및 24 시간동안 각각 반응시킨 다음, 실활(100℃, 20 min), 냉각 및 원심분리(1,460×g, 20 min)하여 제조하였다. 이들 쓴맛 개선 CH은 활성 획분들의 효소활성, 관능검사 및 high performance liquid chromatography (HPLC) 분석을 위한 시료로 사용하였다.
- 0% Gly-phe)의 농도차이를 인지하는 7인의 쓴맛평가 요원(해양식품 공학 및 식품영양학 전공 대학원생)을 선발하여, 이들 trypsin 처리 쓴맛 CH에 대해 쓴맛 평가를 실시한 결과, 2% Gly-phe에 준하는 쓴맛 CH(쓴맛평가요원 7인 중 6인 이상이 유사하다고 인지한 가수분해물)는 상기 반응조건에서 8시간 가수분해하였을 때이었다. 이를 토대로 살 오징어의 간췌장 CE로부터 여러 가지 분획방법으로 분획한 획분들의 쓴맛 개선 효과를 검토하기 위하여 기질로 사용한 trypsin 처리 쓴맛 CH는 효소(trypsin)와 기질(2% casein)의 비를 1/6,000으로 하고 50℃에서 8시간 반응시켜 조제하여 사용하였다.
- 이후 효소의 실활(100℃, 20 min), 냉각 및 원심분리(1,460×g, 20 min)하여 각각 반응시간 별 쓴맛 CH를 제조하였다.
- Trypsin을 사용한 쓴맛 CH의 제조는 Nishiwaki 등(19)의 방법을 다소 수정한 Kim 등(17)의 방법에 따라 제조하였다. 즉, 0.2% (w/v) trypsin과 2% (w/v) casein용액(0.1 M sodium phosphate buffer, pH 7.5)을 1/6,000(단 백질 함량 기준)의 비율로 효소반응 혼합액을 조제하고, 50oC에서 일정시간(1, 2, 4, 6, 8, 12, 16, 20 및 24 h) 동안 반응시켰다. 이후 효소의 실활(100℃, 20 min), 냉각 및 원심분리(1,460×g, 20 min)하여 각각 반응시간 별 쓴맛 CH를 제조하였다.
- 즉, 10-20 μL의 조효소와 2 mL의 1% azocasein 기질이 용해되어 있는 0.1M sodium phosphate 완충액(pH 6.0)을 혼합, 반응(50℃, 1 h)시키고, 이 반응액에 동량(2 mL)의 5% trichloroacetic acid (TCA) 용액을 가하여 실활 시킨 후, 정치(30 min) 및 원심분리(1,460×g, 20 min)한 다음 흡광도를 측정(410 nm)하여 검토하였다.
- 즉, 10-20 μL의 효소 용액과 1 mL의 0.2 mM 기질이 용해되어 있는 0.1M sodium phosphate 완충액(pH 7.5)을 혼합 및 반응(50oC, 1 h) 시킨 다음, 반응혼액에 0.3 mL의 33% acetic acid를 가하여 실활 시킨 후 정치(30 min) 및 원심분리(1,460×g, 20 min)한 다음, 흡광도를 측정(410 nm)하여 검토하였다.
- 즉, 5C18-AR column (i.d. 4.6×250 mm, 5 μm, Waters Co., Milford, MA, USA)이 장착된 HPLC (L-2000, Hitachi Co., Tokyo, Japan)를 이용하여 이동상을 0.1% (v/v) trifluoroacetic acid (TFA)가 함유된 acetonitrile 용액으로 하고, linear gradient (0-45% 범위)로 실시하였으며, 이 때 유속을 0.7 mL/min, 용출시간을 60 min, UV 검출기(L-2400, Hitachi Co., Tokyo, Japan)의 파장을 214 nm로 하였다.
- 즉, 냉동상태의 간췌장을 부분해동 및 마쇄한 다음, 100 g에 대하여 3배(v/w)의 탈이온수를 가하여 6시간 동안 교반(20℃)하면서 추출하였고, 이어서 0.2배량의 에틸에테르를 사용하여 분액여두를 통해 3회 반복하여 탈지한 다음, 원심분리(Supra 22K, Hanil Science Co., Daejeon, Korea; 12,000×g, 20 min)하여 탈지 CE를 조제하였다.
- 살 오징어 간췌장 100 mL의 CE로부터 endoprotease의 분획은 Kim 등(11)의 방법, 그리고 aminopeptidase의 분획은 Kim 등(12)의 방법에 따라 분획하였다. 즉, 단백질의 용해도 차이에 의한 분획법으로 아세톤(acetone, AC) 및 황산암모늄(ammonium sulfate, AS), 단백질의 하전차이에 따른 분획법으로 음이온 교환 크로마토그래피(anion exchange chromatography, AE) 및 단백질 분자량 차이에 따른 분획법으로 겔 여과 크로마토그래피(gel filtration chromatography, GF)를 각각 이용하여 분획한 endoprotease 활성 획분은 각각 AC 0-30%, AS 70-80% 포화농도, AE-UF (unabsorbed fraction, 비흡착 획분) 및 GF-II 획분(15-24 kDa)으로 선정하였고, aminopeptidase 활성 획분은 AC 40-50%, AS 60-70% 포화농도, AE 0.2M NaCl 및 GF-I 획분(30-50 kDa)으로 선정하여 사용하였다.
대상 데이터
- 효소활성 측정을 위한 기질은 endoprotease의 기질로서 azocasein과 aminopeptidase의 기질로서 L-leucine-p-nitroanilide (LeuPNA), 쓴맛 가수분해물 제조를 위한 trypsin 및 casein, 그리고 쓴맛 표준물질로서 glycylphenylalanine (Gly-phe)는 Sigma-Aldrich Co.(St. Louis, Missouri, USA) 제품을 구입하여 사용하였고, 기타 시약은 분석급으로 구입하여 사용하였다.
- 우리나라 전 해역에서 어획되고 있는 살 오징어(T. pacificus, length: 53.7±6.8 cm, weight: 411.5±28.5 g)로부터 분리한 간췌장(length: 18.5±4.5 cm, weight: 86.8±5.8 g)은 부산광역시 서구 소재의 S수산에서 동결상태로 분양받아 냉동상태(−70℃)로 보관하여 두고 조효소 추출 및 분획시료로서 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 데이터의 통계처리는 SPSS 통계 프로그램(Version 12.0K, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 사용하여 분산분석한 후, Duncan의 다중위 검정으로 5% 유의수준에서 실시하였다.
이론/모형
- Aminopeptidase의 활성은 LeuPNA를 기질로 사용하여 Kim 등 (12)의 방법에 따라 측정하였다. 즉, 10-20 μL의 효소 용액과 1 mL의 0.
- Endoprotease의 활성은 Kim 등(11)의 방법에 따라 azocasein 기질을 사용하여 측정하였다. 즉, 10-20 μL의 조효소와 2 mL의 1% azocasein 기질이 용해되어 있는 0.
- Trypsin 처리 casein hydrolysate (CH)은 가수분해정도에 따라 쓴맛이 강한 것으로 알려져 있어(25-28), 쓴맛의 강도가 2% Glyphe과 유사한 trypsin 처리 CH를 제조하여 쓴맛 개선 효과를 검토하기 위한 기질로 사용하고자 하였다. Trypsin을 사용한 쓴맛 CH의 제조는 Nishiwaki 등(19)의 방법을 다소 수정한 Kim 등(17)의 방법에 따라 제조하였다. 즉, 0.
- 단백질 농도는 Lowry 등(24)의 비색법에 따라 bovine serum albumin을 표준 단백질로 하여 구한 검량곡선으로부터 측정하였다.
- 본 실험에서 사용한 모든 완충액은 Dawson 등(23)의 방법에 따라 조제하여 사용하였다.
- 살 오징어 간췌장 100 mL의 CE로부터 endoprotease의 분획은 Kim 등(11)의 방법, 그리고 aminopeptidase의 분획은 Kim 등(12)의 방법에 따라 분획하였다. 즉, 단백질의 용해도 차이에 의한 분획법으로 아세톤(acetone, AC) 및 황산암모늄(ammonium sulfate, AS), 단백질의 하전차이에 따른 분획법으로 음이온 교환 크로마토그래피(anion exchange chromatography, AE) 및 단백질 분자량 차이에 따른 분획법으로 겔 여과 크로마토그래피(gel filtration chromatography, GF)를 각각 이용하여 분획한 endoprotease 활성 획분은 각각 AC 0-30%, AS 70-80% 포화농도, AE-UF (unabsorbed fraction, 비흡착 획분) 및 GF-II 획분(15-24 kDa)으로 선정하였고, aminopeptidase 활성 획분은 AC 40-50%, AS 60-70% 포화농도, AE 0.
- 살 오징어(T. pacificus)의 간췌장으로부터 crude extract (CE)의 추출은 Kim 등(9)의 방법에 따라 실시하였다. 즉, 냉동상태의 간췌장을 부분해동 및 마쇄한 다음, 100 g에 대하여 3배(v/w)의 탈이온수를 가하여 6시간 동안 교반(20℃)하면서 추출하였고, 이어서 0.
- 쓴맛 개선능이 가장 뛰어난 것으로 확인된 aminopeptidase 활성 GF-I 획분에 대하여는 GF-I 획분의 가수분해 시간별(8-24시간) 그리고 기질비(500, 1,000 및 2,000)에 따른 쓴맛 개선 CH를 앞서 언급한 방법에 따라 제조하였다. 이어서 쓴맛 개선 가수분해물의 HPLC의 분석은 Kim 등(17)의 분석조건에 따라 실행하였다. 즉, 5C18-AR column (i.
성능/효과
- 7%)에 비하여 큰 것으로 나타나 효소와 기질(쓴맛 CH)의 비율은 본 실험조건에서는 1/500으로 처리하는 것이 쓴맛 개선 효과가 있는 것으로 판단되었다. CH10과 CH05 간의 효소농도에 따른 활성변화(Fig. 4)에서는 유의적인 차이가 없는 것으로 나타난 반면, HPLC 크로마토그램의 피크면적의 변화(Table 4)에서는 차이를 나타내어 효소활성의 강도가 쓴맛 개선 효과와 절대적인 상관관계는 없는 것으로 나타났다.
- Endoprotease 활성 획분들의 반응시간이 경과할수록 유의적으로 활성이 증가하는 경향을 나타내었다(p<0.05).
- 1에 나타내었다. Endoprotease 활성 획분의 분해활성은 반응 0시간에서는 분획방법에 관계없이 모두 2.44로 차이가 없었으나, 반응 8-24시간에 걸쳐 AC 0-30% 획분은 3.00-4.08범위의 활성변화를 나타내었으며, AS 70-80% (4.06-5.13), AE-UF (4.39-5.46), 그리고 GF-II 획분이 2.66-4.13 범위의 분해활성을 나타내었으며, AE-UF 획분의 효소활성이 가장 강하였다. Endoprotease 활성 획분들의 반응시간이 경과할수록 유의적으로 활성이 증가하는 경향을 나타내었다(p<0.
- 4에 나타내었다. GF-I 획분 첨가 후, CH05와 CH10는 전 반응시간에 걸쳐 활성이 증가하는 경향을 보였으며, 효소첨가농도에 따른 차이를 나타내지 않았다. 그러나 CH20의 경우에는 반응 16시간 이후에는 활성의 유의적인 증가는 나타나지 않았다(p<0.
- GF-I 획분과의 반응 4시간까지는 2% Gly-phe 용액에 준하는 쓴맛을 나타내었으나, 반응 8시간 이후부터 0.5% Gly-phe 용액에 준하는 쓴맛을 나타내어 쓴맛 개선 효과가 인정되었으며, 반응 18시간 이후에는 미미한 정도의 쓴맛을 지닌 0.2% Gly-phe 용액의 맛에 준하여, 쓴맛 개선 효과가 확연히 인정되었다(p<0.05).
- 분획방법별 각 획분의 쓴맛 평가에 의한 쓴맛 개선 효과는 겔 여과법에 의하여 분획된 획분(GFI, 30-50 kDa)이 가장 효과적이었다. GF-I 획분을 2% Gly-phe에 준하는 쓴맛 casein 가수분해물에 대하여 1/500의 비율로 첨가한 다음, 16시간 이상 반응시킨 가수분해물은 HPLC 크로마토그램 상에서 친수성이 강한 피크면적(피크 1, 2 및 4)은 증가한 반면, 소수성이 상대적으로 강한 피크면적(피크 3, 5 및 6)가 감소하였으며, 쓴맛 평가 결과에서도 쓴맛 개선 효과가 뚜렷하였다. 앞으로의 연구에서는 오징어 간췌장 유래 aminopeptidase의 효율적인 산업적 이용을 위한 단백질 분자량 크기에 따른 연속분획 공정을 통한 대량회수 방법 및 쓴맛 개선 가수분해물로부터 유리된 아미노산분석, 효소안정성, 기질특이성 등에 대하여 진행하고자 한다.
- 3과 Table 3에 나타내었다. GF-I 획분의 반응시간별 총 60분 간의 분석에서 24분대의 피크 1, 27분대의 피크 2, 31분대의 피크 3, 33분대의 피크 4, 44분대의 피크 5 그리고 47분대의 피크 6이 HPLC 크로마토그램상에서 피크면적(%)의 변화가 두드러진 것으로 나타났다. 이들 피크들은 분석시 사용한 칼럼(C18)과 이동상(0-45% acetonitrile)의 특성에 따라 retention time (머무름시간)이 길어질수록 상대적으로 소수성이 강한 펩타이드 획분들이 용출된 것으로 추정되었으며, Nishiwaki 등(19), Bumberger와 Belitz(25), Lin 등(30) 및 Park과 Lee(31)도 aminopeptidase를 이용하여 casein 가수분해물의 쓴맛 개선을 시도하였고, 그 효과를 C18 reverse-phase HPLC로 분석한 결과, 머무름 시간 30분대 이후의소수성이 강한 피크들이 감소한 반면 30분대 이전의 상대적으로 친수성이 강한 피크들이 증가하였다고 보고하여 본 실험 결과와 일치하였다.
- 3에서의 결과에서처럼 피크 1, 2 및 4는 증가하는 경향을 보인 반면, 피크 3, 5 및 6은 첨가 농도에 관계없이 감소하는 경향이었다. 다만 CH05의 피크 1 (31.9%로 증가), 3 (3.0%로 감소) 및 6 (1.9%로 감소)의 증감 폭이 CH20 (10.4, 12.9 및 21.1%) 및 CH10 (11.4, 12.7 및 11.7%)에 비하여 큰 것으로 나타나 효소와 기질(쓴맛 CH)의 비율은 본 실험조건에서는 1/500으로 처리하는 것이 쓴맛 개선 효과가 있는 것으로 판단되었다. CH10과 CH05 간의 효소농도에 따른 활성변화(Fig.
- pacificus)의 간췌장 CE로부터 단백질의 용해도차이에 따른 아세톤과 황산암모늄 분획, 하전(net charge)차이에 따른 음이온 교환 크로마토그래피와 분자량크기에 따른 겔 여과 크로마토그래피로 분획한 endoprotease와 aminopeptidase 활성 획분을 대상으로 이들의 azocasein 및 LeuPNA에 대한 specific activity와 recovery (회수율)에 따른 분획특성을 살펴 본 결과는 Table 1과 같다. 단백질 기질인 azocasein에 대한 endoprotease 활성 획분의 specific activity 및 회수율(%)은 CE (1.8 U/mg 및 100%)에 대하여 AC 0-30% 획분의 경우 각각 32.1 U/mg 및 29.5%, AS 70-80% 포화획분의 경우 각각 15.0 U/mg 및 25.8%, AE-UF의 경우 각각 41.4 U/mg 및 28.5%, 그리고, GF-II 획분의 경우 각각 24.4 U/mg 및 42.0%이었다. 또한 이들 endoprotease 활성 획분들의 aminopeptidase 기질로서 LeuPNA에 대한 specific activity 및 회수율은 CE (7.
- 3점)은 전체 반응시간에 있어 1% Gly-phe(3점)보다 높은 쓴맛 평가를 받아 개선효과를 보이지 않았다. 따라서 aminopeptidase 활성 획분이 endoprotease 활성 획분들에 비하여 쓴맛 CH에 대한 쓴맛 개선 효과가 뚜렷한 유의적인 차이를 나타냄으로서, 산업적 응용이 가능성이 상대적으로 높을 것으로 판단되었다. 이상의 결과로 미루어 보아 살오징어 간췌장 CE로부터 분획한 endoprotease 및 aminopeptidase 활성 획분들 중 쓴맛 개선 효과가 가장 우수한 획분은 겔 여과법의 GF-I 획분(30-50 kDa)이었다.
- 아울러 GF-I 획분 첨가효소 농도 및 시간별 처리 쓴맛 CH의 쓴맛 개선 효과를 7인의 쓴맛 평가 요원이 1% 쓴맛 표준용액(glycylphenylalanine)을 기준으로 평가한 관능검사를 통하여 살펴본 결과(Table 5), 반응 8시간에 첨가농도에 상관없이 개선효과가 인지되었으며, CH20와 CH10은 이후의 반응시간에서도 더 이상의 개선효과가 없는 반면에 CH05의 경우 24시간 처리에서 쓴맛을 아무도 인지하지 못한 것으로 나타났다. 따라서 본 실험 조건에서 국내산 살오징어(T. pacificus) 간췌장 추출물로부터 겔여과 크로마토그래피로 분획한 분자량 크기 30-50 kDa의 aminopeptidase 활성 획분은 쓴맛 casein 가수분해물에 대해 단백질함량 기준으로 1/500비율 첨가하여 16-24시간처리로 효과적인 쓴맛 개선 효과를 얻을 수 있었다.
- 따라서 쓴맛 CH에 대한 endoprotease 활성 획분의 쓴맛의 유의적인 개선효과는 인지되었으나(p<0.05), 이는 쓴맛 강도가 1% Gly-phe(3점)보다 강한 쓴맛으로 인지되어, 이들 효소 획분은 쓴맛 개선제로서의 산업적으로 이용하기에는 적절하지 못할 것으로 판단되었다.
- 1% (CH24)로서 GF-I 획분과의 가수분해 시간의 경과와 더불어 증가하는 경향을 나타내었다. 또한 구성 펩타이드 획분의 소수성이 강할수록 쓴맛이 강하다고 보고(16,30,31)와 이상의 결과로부터 살 오징어 간췌장 유래 GF-I 획분의 적용으로 쓴맛 CH 중의 구성 펩타이드 획분의 소수성은 전반적으로 감소하는 동시에 상대적인 친수성은 증가함을 나타냄으로서 쓴맛 개선 효과가 인정되었다.
- 0%이었다. 또한 이들 endoprotease 활성 획분들의 aminopeptidase 기질로서 LeuPNA에 대한 specific activity 및 회수율은 CE (7.7 U/mg 및 100%)에 대하여 AE-UF 획분이 각각 60.5 U/mg 및 9.9%로 가장 높은 활성을 나타내었으나, 회수율은 AS 70-80% 포화획분(15.7%)이 가장 높았다. 이와 같은 결과로부터 살 오징어 간췌장 CE로부터 endoprotease를 분획 및 정제 소재로 활용하고자 하는 경우 음이온 교환 크로마토그래피의 비흡착 획분(AE-UF)을 이용하는 것이 가장 적절하리라 판단되었다.
- 국내산 살 오징어 간췌장 조효소를 추출한 다음, 단백질 성질에 기초한 분획방법(용해도, 전기적 성질 및 분자량크기)으로 분획한 endoprotease 및 aminopeptidase 활성 획분들에 대한 분해 활성 비교한 다음, 이들 획분의 반응시간에 따른 쓴맛 casein 가수분해물의 쓴맛 개선 효과를 효소활성, 관능검사 및 HPLC 크로마토그램을 통하여 살펴보았다. 분획방법별 각 획분의 쓴맛 평가에 의한 쓴맛 개선 효과는 겔 여과법에 의하여 분획된 획분(GFI, 30-50 kDa)이 가장 효과적이었다. GF-I 획분을 2% Gly-phe에 준하는 쓴맛 casein 가수분해물에 대하여 1/500의 비율로 첨가한 다음, 16시간 이상 반응시킨 가수분해물은 HPLC 크로마토그램 상에서 친수성이 강한 피크면적(피크 1, 2 및 4)은 증가한 반면, 소수성이 상대적으로 강한 피크면적(피크 3, 5 및 6)가 감소하였으며, 쓴맛 평가 결과에서도 쓴맛 개선 효과가 뚜렷하였다.
- 아울러 GF-I 획분 첨가효소 농도 및 시간별 처리 쓴맛 CH의 쓴맛 개선 효과를 7인의 쓴맛 평가 요원이 1% 쓴맛 표준용액(glycylphenylalanine)을 기준으로 평가한 관능검사를 통하여 살펴본 결과(Table 5), 반응 8시간에 첨가농도에 상관없이 개선효과가 인지되었으며, CH20와 CH10은 이후의 반응시간에서도 더 이상의 개선효과가 없는 반면에 CH05의 경우 24시간 처리에서 쓴맛을 아무도 인지하지 못한 것으로 나타났다. 따라서 본 실험 조건에서 국내산 살오징어(T.
- 이들 피크들은 분석시 사용한 칼럼(C18)과 이동상(0-45% acetonitrile)의 특성에 따라 retention time (머무름시간)이 길어질수록 상대적으로 소수성이 강한 펩타이드 획분들이 용출된 것으로 추정되었으며, Nishiwaki 등(19), Bumberger와 Belitz(25), Lin 등(30) 및 Park과 Lee(31)도 aminopeptidase를 이용하여 casein 가수분해물의 쓴맛 개선을 시도하였고, 그 효과를 C18 reverse-phase HPLC로 분석한 결과, 머무름 시간 30분대 이후의소수성이 강한 피크들이 감소한 반면 30분대 이전의 상대적으로 친수성이 강한 피크들이 증가하였다고 보고하여 본 실험 결과와 일치하였다. 아울러 반응시간에 따른 HPLC 크로마토그램상(Fig. 3)의 피크면적(%)의 변화(Table 3)는 6개의 피크들 중에 상대적으로 소수성이 강한 펩타이드로 추정 되는 피크 6 (34.2%, CH)에서 1.9% (CH24)로의 감소가 두드러졌으며, 다음으로 피크 5(20.5%에서 7.5%로) 및 피크 3 (18.5%에서 3.0%로)의 순으로 감소하는 경향을 보인 반면에, 소수성이 상대적으로 약한 펩타이드로 추정되는 피크 1은 23.% (CH)에서 31.9% (CH24)로, 피크 2는 9.0% (CH)에서 15.5% (CH24)로, 그리고 피크 4는 15.6% (CH)에서 40.1% (CH24)로서 GF-I 획분과의 가수분해 시간의 경과와 더불어 증가하는 경향을 나타내었다. 또한 구성 펩타이드 획분의 소수성이 강할수록 쓴맛이 강하다고 보고(16,30,31)와 이상의 결과로부터 살 오징어 간췌장 유래 GF-I 획분의 적용으로 쓴맛 CH 중의 구성 펩타이드 획분의 소수성은 전반적으로 감소하는 동시에 상대적인 친수성은 증가함을 나타냄으로서 쓴맛 개선 효과가 인정되었다.
- 이들 쓴맛 CH는 쓴맛 표준용액(0, 0.1, 0.2, 0.5, 1.0 및 2.0% Gly-phe)의 농도차이를 인지하는 7인의 쓴맛평가 요원(해양식품 공학 및 식품영양학 전공 대학원생)을 선발하여, 이들 trypsin 처리 쓴맛 CH에 대해 쓴맛 평가를 실시한 결과, 2% Gly-phe에 준하는 쓴맛 CH(쓴맛평가요원 7인 중 6인 이상이 유사하다고 인지한 가수분해물)는 상기 반응조건에서 8시간 가수분해하였을 때이었다. 이를 토대로 살 오징어의 간췌장 CE로부터 여러 가지 분획방법으로 분획한 획분들의 쓴맛 개선 효과를 검토하기 위하여 기질로 사용한 trypsin 처리 쓴맛 CH는 효소(trypsin)와 기질(2% casein)의 비를 1/6,000으로 하고 50℃에서 8시간 반응시켜 조제하여 사용하였다.
- 따라서 aminopeptidase 활성 획분이 endoprotease 활성 획분들에 비하여 쓴맛 CH에 대한 쓴맛 개선 효과가 뚜렷한 유의적인 차이를 나타냄으로서, 산업적 응용이 가능성이 상대적으로 높을 것으로 판단되었다. 이상의 결과로 미루어 보아 살오징어 간췌장 CE로부터 분획한 endoprotease 및 aminopeptidase 활성 획분들 중 쓴맛 개선 효과가 가장 우수한 획분은 겔 여과법의 GF-I 획분(30-50 kDa)이었다.
- 이상의 결과에서 쓴맛 CH에 대한 활성 획분들의 분해활성은 aminopeptidase 활성 획분들이 endoprotease 활성 획분들에 비하여 낮은 것으로 나타나 Table 1의 단백질기질인 azocasein에 대한 분해활성 결과와 유사하였으나, 쓴맛 개선 효과(Table 2)에서는 aminopeptidase 활성 획분들이 endoprotease 활성 획분에 비하여 우수한 것으로 나타남으로써 활성 획분들의 가수분해정도가 쓴맛 CH에 대한 쓴맛 개선 효과 간에는 절대적인 상관관계가 없는 것으로 판단되었다.
- 연체류 간췌장 CE로부터 적절히 분획하여 그 획분 자체를 이용하고자 하는 경우, specific activity (U/mg)가 고려된 회수율(%)이 높은 획분을 이용하는 것이 적절하리라 판단되었다(10-13). 이상의 결과와 보고로부터 살 오징어 간췌장 CE로부터 aminopeptidase를 분획하여 쓴맛 개선제와 같이 이용하고자 하는 경우, 겔 여과법에 의하여 30-50 kDa이 주로 함유되어 있는 획분(GF-I)을 분획하는 것이 가장 적절하리라 판단되었고, aminopeptidase계 효소를 정제하기 위하여 음이온 교환 크로마토그래피에 흡착된 시료를 0.2M NaCl로 분획한 specific activity가 높은 획분(AE-II, 102.6 U/mg)을 이용하는 것이 적절하리라 판단되었다.
- Izawa 등(21)은 Aeromonas caviae 유래 amonopeptidase를, Nishiwaki 등(19)은 흰 잎새 버섯(Grifola frondosa) 유래 aminopeptidase를 각각 쓴맛 casein 가수분해물에, Liu와 Yasuda(15)는 Monascus carboxypeptidase를 쓴맛 soybean 가수분해물에 적용한 결과 쓴맛 개선 효과가 인정되었다고 보고한 바 있다. 이상의 결과와 연구보고로부터, aminopeptidase 활성 획분은 쓴맛 단백질(casein 및 soybean) 가수분해물에 대하여 관능평가에 따른 쓴맛 개선 효과가 있는 것으로 판단하였다.
- 7%)이 가장 높았다. 이와 같은 결과로부터 살 오징어 간췌장 CE로부터 endoprotease를 분획 및 정제 소재로 활용하고자 하는 경우 음이온 교환 크로마토그래피의 비흡착 획분(AE-UF)을 이용하는 것이 가장 적절하리라 판단되었다.
- 한편, aminopeptidase 활성 획분들의 azocasein에 대한 specific activity 및 회수율은 CE에 대하여 specific activity는 AE-II (20.2 U/mg)이, 그리고 회수율은 AC 40-50% 획분(28.5%)이 가장 높은 것으로 나타났으며, 다음으로는 GF-I 획분이 27.9%의 회수율을 나타내었다. 반면에 LeuPNA에 대한 specific activity 및 회수율은 AC 40-50% 획분이 각각 29.
- 05). 한편, aminopeptidase 활성 획분들의 효소활성은 반응 8-24시간에서 AE-II 획분이 3.59-4.87범위로 가장 높았으며, AC 40-50% (3.29-4.60), AS 60-70% (2.80-3.10) 및 GF-I 획분은 3.06-4.09 범위의 분해활성을 나타내었다.
후속연구
- GF-I 획분을 2% Gly-phe에 준하는 쓴맛 casein 가수분해물에 대하여 1/500의 비율로 첨가한 다음, 16시간 이상 반응시킨 가수분해물은 HPLC 크로마토그램 상에서 친수성이 강한 피크면적(피크 1, 2 및 4)은 증가한 반면, 소수성이 상대적으로 강한 피크면적(피크 3, 5 및 6)가 감소하였으며, 쓴맛 평가 결과에서도 쓴맛 개선 효과가 뚜렷하였다. 앞으로의 연구에서는 오징어 간췌장 유래 aminopeptidase의 효율적인 산업적 이용을 위한 단백질 분자량 크기에 따른 연속분획 공정을 통한 대량회수 방법 및 쓴맛 개선 가수분해물로부터 유리된 아미노산분석, 효소안정성, 기질특이성 등에 대하여 진행하고자 한다.
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