파프리카에 발생하는 주요 병원균에 대한 길항미생물, Serratia marcescens-YJK1, 분리와 특성 The Isolation and Characterization of the Antagonistic Microorganisms, Serratia marcescens-YJK1, for Major Pathogens on Paprika원문보기
파프리카에 발생하는 병들을 방제하기 위하여 합성농약이 광범위하게 사용되어왔지만 최근에 수많은 농약사용의 부작용에 대한 관심이 증가 하고 있다. 파프리카 주요병인 잿빛곰팡이병, 줄기 및 과실썩음병, 역병, 균핵병, 시들음병을 방제하기 위한 미생물을 분리하고 특성을 파악하기 위하여 본 연구를 실시하였다. 지방산분석과 16S rDNA 염기배열은 이 연구에서 분리한 YKJ1가 Serratia marcescens 그룹에 속하는 것을 밝혔다. 특히, YKJ1의 16S rDNA 염기배열은 S. marcescens의 염기서열과 99% 상동성을 보였다. 광학현미경을 통해 YKJ1처리에 의해 병원균의 포자 발아 및 균사 생장이 저해됨을 확인 하였다. YKJ1처리는 팽윤균사와 같은 현저한 형태적 변화와 세포벽의 분해를 유발하였다. 역병균의 경우 유주자낭의 형성이 억제되었다. 본 연구에서 동정한 S. marcescens는 S. marcescens-YKJ1으로 부르고자 한다. 포장실험등과 같은 시험이 차후 더 요구되어지나 파프리카의 주요 병관리를 위한 생물적 방제제의 하나로 가치가 있을 것으로 생각된다.
파프리카에 발생하는 병들을 방제하기 위하여 합성농약이 광범위하게 사용되어왔지만 최근에 수많은 농약사용의 부작용에 대한 관심이 증가 하고 있다. 파프리카 주요병인 잿빛곰팡이병, 줄기 및 과실썩음병, 역병, 균핵병, 시들음병을 방제하기 위한 미생물을 분리하고 특성을 파악하기 위하여 본 연구를 실시하였다. 지방산분석과 16S rDNA 염기배열은 이 연구에서 분리한 YKJ1가 Serratia marcescens 그룹에 속하는 것을 밝혔다. 특히, YKJ1의 16S rDNA 염기배열은 S. marcescens의 염기서열과 99% 상동성을 보였다. 광학현미경을 통해 YKJ1처리에 의해 병원균의 포자 발아 및 균사 생장이 저해됨을 확인 하였다. YKJ1처리는 팽윤균사와 같은 현저한 형태적 변화와 세포벽의 분해를 유발하였다. 역병균의 경우 유주자낭의 형성이 억제되었다. 본 연구에서 동정한 S. marcescens는 S. marcescens-YKJ1으로 부르고자 한다. 포장실험등과 같은 시험이 차후 더 요구되어지나 파프리카의 주요 병관리를 위한 생물적 방제제의 하나로 가치가 있을 것으로 생각된다.
Synthetic agro-chemicals have been widely used to control diseases on paprika but these days negative attention has been increasing to use of them because of several adverse effects. This research was conducted to isolate and to characterize the antagonistic microorganism to control major paprika di...
Synthetic agro-chemicals have been widely used to control diseases on paprika but these days negative attention has been increasing to use of them because of several adverse effects. This research was conducted to isolate and to characterize the antagonistic microorganism to control major paprika diseases, gray mold rot, fruit and stem rot, phytophthora blight, sclerotium rot, and wilt disease. Analysis of the fatty acid and analysis of the 16S rDNA gene sequence revealed that YKJ1 isolated in this research belongs to a group of Serratia marcescens. Specially, 16S rDNA gene sequence of YKJ1 showed 99% of sequence similarity with S. marcescens. Observation through the optical microscope revealed that YKJ1 suppressed the spore germination and the hyphal growth of pathogens. YKJ1 treatment on pathogens induced marked morphological changes like hyphal swelling and degradation of cell wall. In the case of phytophthora blight, the zoosporangium formation was restrained. S. marcescens found in this study call as S. marcescens-YKJ1 and it may be valuable as one of biological control agents against major diseases of paprika in the future even though it is require to be tested with more study on field test.
Synthetic agro-chemicals have been widely used to control diseases on paprika but these days negative attention has been increasing to use of them because of several adverse effects. This research was conducted to isolate and to characterize the antagonistic microorganism to control major paprika diseases, gray mold rot, fruit and stem rot, phytophthora blight, sclerotium rot, and wilt disease. Analysis of the fatty acid and analysis of the 16S rDNA gene sequence revealed that YKJ1 isolated in this research belongs to a group of Serratia marcescens. Specially, 16S rDNA gene sequence of YKJ1 showed 99% of sequence similarity with S. marcescens. Observation through the optical microscope revealed that YKJ1 suppressed the spore germination and the hyphal growth of pathogens. YKJ1 treatment on pathogens induced marked morphological changes like hyphal swelling and degradation of cell wall. In the case of phytophthora blight, the zoosporangium formation was restrained. S. marcescens found in this study call as S. marcescens-YKJ1 and it may be valuable as one of biological control agents against major diseases of paprika in the future even though it is require to be tested with more study on field test.
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문제 정의
아직 선진국에 비해 많은 연구가 실용화 되어 있지 않지만 길항미생물의 제제화와 근권정착력 대량 생산 기술 개발 등 수행해야 할 일들이 많으며, 기술적 한계로 인하여 생물농약의 단점인 불안정하고 불충분한 약효에 대한 연구가 지속적으로 필요하다(이 등, 2008). 이에 본 연구는 파프리카에서 발생하는 주요 균류병에 대한 길항미생물을 탐색하여 그 특성에 대한 연구를 실시하여 고품질 파프리카 생산을 위해 친환경적 방제의 기반에 기여하고자 한다.
파프리카에 발생하는 병들을 방제하기 위하여 합성농약이 광범위하게 사용되어왔지만 최근에 수많은 농약사용의 부작용에 대한 관심이 증가 하고 있다. 파프리카 주요병인 잿빛곰팡이병, 줄기 및 과실썩음병, 역병, 균핵병, 시들음병을 방제하기 위한 미생물을 분리하고 특성을 파악하기 위하여 본 연구를 실시하였다. 지방산분석과 16S rDNA 염기배열은 이 연구에서 분리한 YKJ1가 Serratia marcescens 그룹에 속하는 것을 밝혔다.
제안 방법
MIDI를 이용한 지방산 분석시험은 Yang 등(1993)의 방법을 변형하여 실시하였으며, 선별된 균주를 1.5% tryptic soy agar(TSA, Difco, USA, 0.17% tryptose, 0.3% soytone, 0.25% glucose, 0.5% sodium chloride, 0.25% dipotassium phosphate, 0.15% agar)배지에 streak한 후, 28℃에서 24시간 동안 배양하였고, 40~60 ㎎의 colony를 시험관에 옮겼다. 15%의 NaOH를 첨가한 50% methanol 용액 1 mL을 가하고, 10초 동안 vortexing하였으며, 100℃에서 25분 동안 열을 가하고, 1분 동안 식혀주었다.
1 Kit(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)와 Capillary electrophoresis system의 ABI 3730xl Genetic Analyzer를 사용하였으며, 2종의 프라이머 27F(5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’), 1492R (5’-TACGGYTACCTTGTTACG ACT T-3’)를 사용하였다(Reysenbach 등, 1992). National Center for Biotechnology Information(NCBI)의 BLAST 검색프로그램을 통해 염기서열의 유사도를 분석하였다. MEGA v4.
잿빛곰팡이병균과 시들음병원균, 줄기 및 과실썩음병원균의 분생포자발아에 대한 길항균 배양여액의 효과를 조사하기 위해 이(1994)의 방법을 변형하여 실험하였다. Test tube에 potato dextrose broth(PDB, 0.4% potato starch, 2.0% dextrose)(Difco, USA) 2.7 mL와 0.3 mL의 길항균 배양여액을 9:1로 혼합한 후 0.1 mL의 포자현탁액(109 cell/mL)을 접종 후 24시간, 48시간, 72시간에 정치 배양하여, 광학현미경(Leica, ICC50)을 사용하여 400배에서 포자발아율을 조사하였다.
marcescens strain YKJ1”으로 명명하기를 제안한다.
길항균 선발방법은 PDA 배지에 곰팡이 접종 후 4일간 배양하여 길항균을 접종하고 7일 정도 배양시켜 저지대를 형성하는 균주를 길항균으로 선발하였다. 생장저지율은 PDA평판 배지에서 병원균과 7일간 대치배양하면서 병원균 균총의 직경을 측정하여 무처리구와 비교하여 백분율로 나타내었다.
길항력 실험은 PDA 배지로 채워진 페트리디쉬를 이용하였으며, 배양기내의 배양온도는 25℃로 곰팡이의 생장에 양호한 온도로 배양하여 병원성 사상균의 생육에 적합한 환경조건에서 병원균에 대한 길항력이 우수한 세균성 균주를 분리하였다.
25% dextrose)(Difco, USA)에 접종 후 24시간 동안 진탕배양 하였다. 배양한 길항균을 각각 0.2 mL씩 취한다음, 배양중인 병원균(1.8 mL)에 접종하여, 다시 48시간 동안 진탕배양 후 광학 현미경을 사용하여 400배에서 균사의 생장상태를 조사하였다.
본 실험에 사용한 착색단고추에서 발생하는 5가지 병원균 중 분생포자를 형성하는 잿빛 곰팡이병과 시들음병, 줄기 및 과실썩음병의 병원균에 대하여 YKJ1의 배양여액을 이용해 병원균의 포자발아에 미치는 영향에 대하여 조사하였다. 역병균의 경우 분생포자를 형성하지 않고 유주자, 유주자낭을 형성하며, 균핵병균은 포자를 형성하지 않기 때문에 본 실험에서 제외시켰다.
선별 균주의 16S rDNA 염기서열 분석은 ABI사의 BigDye® Terminators v3.1 Kit(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)와 Capillary electrophoresis system의 ABI 3730xl Genetic Analyzer를 사용하였으며, 2종의 프라이머 27F(5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’), 1492R (5’-TACGGYTACCTTGTTACG ACT T-3’)를 사용하였다(Reysenbach 등, 1992).
이(1994)의 방법을 변형하여 길항균이 잿빛곰팡이병균과 시들음병균, 줄기 및 과실썩음 병균, 역병균, 균핵병균의 균사생장에 미치는 영향을 조사하기 위하여 다섯 가지 병원균과 길항균을 각각 tryptic soybean broth (TSB, 1.7% tryptone, 0.3% soytone, 0.5% sodium chloride, 0.25% dipotassium phosphate, 0.25% dextrose)(Difco, USA)에 접종 후 24시간 동안 진탕배양 하였다. 배양한 길항균을 각각 0.
5% agar)배지에 접종, 도말하여 28℃에서 3일간 배양하였다. 이후 colony의 형태와 크기 등이 특이하거나 plate 상에서 우점양상을 보이는 균주들을 대상으로 순수분리를 실시하였다.
잿빛곰팡이병균과 시들음병원균, 줄기 및 과실썩음병원균의 분생포자발아에 대한 길항균 배양여액의 효과를 조사하기 위해 이(1994)의 방법을 변형하여 실험하였다. Test tube에 potato dextrose broth(PDB, 0.
착색단고추 재배 농가 포장에서 채취한 토양 시료로부터 B. cinerea, F. oxysporum, F. solani, P. capsici, S. sclerotiorum의 5가지 주요 병원균과 길항미생물들을 분리하였다. 분리된 길항미생물들을 5가지 병원균과 대치배양하여 병원균의 생장억제율이 40% 이상인 균주를 분리하여 YKJ1라 하고 실험에 이용하였다(Fig.
세균의 동정으로는 MIDI(지방산분석), BIOLOG 및 API 등이 이용되고 있으며, 최근에는 16S rDNA 유전자 분석에 크게 의존하고 있다(Adhikari 등, 2001; Mehnaz 등, 2001; Sacchi 등, 2002; 이 2004). 착색단고추에서 발생하는 병원균에 대하여 길항력이 우수한 균주를 동정하기 위해 MIDI를 이용 지방산 분석시험과 16S rDNA 염기서열 분석을 실시하였다.
채집된 이병주에서 이병부와 건전부 사이의 조직을 5×5 ㎜ 크기로 잘라서 1% 차아염소산나트륨(NaOCl)용액에 1분간 표면 살균한 다음 멸균수로 3회 세척하여 Filter paper로 흡수하여 PDA(potato dextrose agar, 0.4% potato starch, 2.0% dextrose, 1.5% agar)배지에 치상하고, 28℃ 암상태로 배양한 후 단포자를 다시 PDA 배지에 이식, 배양하여 균을 순수분리하였다.
채취한 토양시료를 각각 1 g씩 정량하여 9 mL의 멸균생리식염수(0.85% NaCl)가 들어있는 시험관에 넣고 vortex를 사용하여 충분히 진탕하면서 연속희석법으로 10-4, 10-5, 10-6까지 희석한 후, 희석액 0.1 mL씩을 NA(nutrient agar, 0.5% peptone, 0.3% beef extract, 1.5% agar)배지에 접종, 도말하여 28℃에서 3일간 배양하였다.
대상 데이터
sclerotiorum의 5가지 주요 병원균과 길항미생물들을 분리하였다. 분리된 길항미생물들을 5가지 병원균과 대치배양하여 병원균의 생장억제율이 40% 이상인 균주를 분리하여 YKJ1라 하고 실험에 이용하였다(Fig. 1과 Table 1).
실험에 사용된 토양시료는 전북 남원, 장수, 전주, 진주등지의 파프리카 재배포장을 대상으로 2010년 6월 8월 10월에 걸쳐 채취하였으며, 파프리카 재배포장의 상토를 걷어 낸 후 파프리카 뿌리와 근접한 지하 10~15㎝ 지점의 토양을 각 지점별로 3곳의 토양을 채취 후, 혼합하여 사용하였다. 채취한 토양시료를 각각 1 g씩 정량하여 9 mL의 멸균생리식염수(0.
데이터처리
8 g NaOH/900 mL 증류수)를 첨가하고 5분 동안 섞 어주고, saturated NaCl을 몇 방울 떨어 뜨려, 불순물을 가라앉히고, 지방산이 추출된 상층액의 2/3를 GC vial로 옮겨주었다. GC 분석은 gas chromatography를 이용하였으며, 분석은 MIDI (MIDI Inc., Newark, DE, Sherlock database TSBA40, version 4.1, USA)으로 실시하였고 지방산조성은 MIS Library entry에서의 similarity index로 나타내었다(Osterhout 등, 1991).
실험의 결과에 대한 통계처리는 Statistical Analysis System(SAS version 9.1, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)프로그램에 의해 분석하여 유의성을 검정하였으며, p＜0.05 이하의 유의수준에서 평균값을 최소유의차(LSD) 검정에 의해 처리간의 결과를 비교하였다.
이론/모형
MEGA v4.0 program(Tamura 등, 2007)의 neighbor joining method Saitou과 (Nei, 1987)를 이용하여 phylogenetic tree를 작성하였으며, sequence distance는 Kimura 2- parameter method(Kimura, 1980)로 계산하여 bootstrap analysis (Felsenstein, 1985) 1,000반복으로 수행하였다.
성능/효과
YKJ1의 처리가 잿빛곰팡이병균, 시들음병, 줄기 및 과실썩음병, 역병, 균핵병균의 균사생장에 미치는 영향을 알아보기 위하여 YKJ1처리 후 각각 병원균의 균사 선단부를 현미경으로 관찰하였을 때 세포벽 용해, 균사의 팽윤, 균사 말단의 생육저해 등의 다양한 식물병원균의 억제기작을 고루 가지고 있음을 확인할 수 있었다(Fig. 3).
marcescens의 염기서열과 99% 상동성을 보였다. 광학현미경을 통해 YKJ1처리에 의해 병원균의 포자 발아 및 균사 생장이 저해됨을 확인 하였다. YKJ1처리 는 팽윤균사와 같은 현저한 형태적 변화와 세포벽의 분해를 유발하였다.
균사생장억제율(Table 1)은 B. cinerea, F. oxysporum, F. solani, P. capsici, S. sclerotiorum에서 각각 51.82%, 44.36%, 46.67%, 43.59%, 44.10%로 나타났고 대치배양시에 inhibition-zone과 B. cinerea가 맞닿는 부분에서 포자 형성이 많이 되었다. Fig.
capsici과 대치배양을 통하여 Pseudomonas putida strain P84(정, 2011)를 선발하여 길항 미생물에 의한 파프리카 주요 병원균의 친환경적 제제선발의 가능성을 보고 하였고, 김과 김(1997)은 벼도열병 방제를 위해 균사 생육을 30% 억제하는 Bacillus sp.를 분리하여 사용한 것으로 보았을 때, 본 실험에서 분리한 YKJ1 균주는 40% 이상의 억제율을 보였으므로, 착색단고추에 발생하는 주요 병원균의 생물학적에 우수한 균으로 예상된다.
marcescens로 판단이 된다. 분리한 길항미생물 YKJ1균주의 GC(gas chromatography) 분석 결과 주로 iso-와 cyclo fatty acid로 구성되어 있었으며, C16 fatty acid가 41.34%, C17 fatty acid 20.62%, 그리고 C18 fatty acid가 10.74%로 다른 S. marcescens strain(Li 등, 2011)의 주요 지방산 성분과 유사한 경향을 보였다(Table 2).
지방산분석과 16S rDNA 염기배열은 이 연구에서 분리한 YKJ1가 Serratia marcescens 그룹에 속하는 것을 밝혔다. 특히, YKJ1의 16S rDNA 염기배열은 S. marcescens의 염기서열과 99% 상동성을 보였다. 광학현미경을 통해 YKJ1처리에 의해 병원균의 포자 발아 및 균사 생장이 저해됨을 확인 하였다.
파프리카 주요병원균에 대하여 길항능력이 있는 YJK1의 분자생물학적 동정을 위하여 YKJ1균주의 genomic DNA로부터 16S rDNA의 ITS영역을 증폭하여 염기서열(932 bp)을 NCBI의 BLSATN을 이용하여 분석한 결과 NCBI GenBank 데이터베이스에 등록된 S. marcescens (accession no. KM018333)와 99%의 상동성을 확인하였으며, 또한 YKJ1과 S. marcescens로 분류된 분류군과의 관계를 조사하기 위하여 MEGA 4.0 프로그램 내 neighbor-joining 방법(Tamura 등, 2007)을 이용하여 유연관계를 분석한 결과 YKJ1는 S. marcescens로와 같은 군에 속하는 것으로 나타났다(Fig. 2). 따라서 분리된 YKJ1는 “S.
후속연구
solani의 발아억제에 관여함을 보고하는 등 많은 미생물들의 배양과정 중에 포자발아 억제 물질을 분비함을 시사한 바 있다. 본 실험에서도 유사한 앞서 발표한 연구들과 유사한 결과를 얻었는데, 이는 앞서 발표한 연구 결과와 마찬가지로 YKJ1의배양과정에서 B. cinerea, F. oxysporum, F. solani의 분생포자 발아억제에 효과적인 물질이 분비 되었기 때문이라고 생각되며 추후에 YKJ1이 배양과정에서 분비하는 대사산물에 대한 연구가 필요하겠다.
marcescens-YKJ1으로 부르고자 한다. 포장실험등과 같은 시험이 차후 더 요구되어지나 파프리카의 주요 병관리를 위한 생물적 방제제의 하나로 가치가 있을 것으로 생각된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
파프리카에 발생하는 주요 병해는?
파프리카는 가지과(Solanaceae) 고추속(Capsicum) 고추종(Annuum) 단고추 아종에 속하며, 발생하는 병해의 종류는 일반고추와 비슷하지만, 일반고추에 비하여 병해에 대한 감수성이 높고, 재배환경에 대해서도 훨씬 민감하다(지 등, 2005). 파프리카에 발생하는 주요병해로 바이러스병(Kim 등, 2002; Mun 등, 2008), 시들음병 (Cha, 2009), 역병(조, 2010), 잿빛곰팡이 병(Yoon 등, 2008), 줄기 및 과실썩음병(Jee 등, 2005), 균핵병(Jeon 등, 2006) 등의 병해를 비롯하여 여러 요인에 기인하는 여러 종류의 병해가 있다. 이러한 병해 방제를 위해서 경종적, 물리적방제 등 여러 가지 방제법이 있는데 대부분이 다수의 농약을 사용하는 화학적 방제에 의존하는 경향이 있다(농촌진흥청, 2002).
파프리카의 병해를 방제하기 위한 방법은 무엇이 있으며, 대부분 어떤 방법을 사용하나?
파프리카에 발생하는 주요병해로 바이러스병(Kim 등, 2002; Mun 등, 2008), 시들음병 (Cha, 2009), 역병(조, 2010), 잿빛곰팡이 병(Yoon 등, 2008), 줄기 및 과실썩음병(Jee 등, 2005), 균핵병(Jeon 등, 2006) 등의 병해를 비롯하여 여러 요인에 기인하는 여러 종류의 병해가 있다. 이러한 병해 방제를 위해서 경종적, 물리적방제 등 여러 가지 방제법이 있는데 대부분이 다수의 농약을 사용하는 화학적 방제에 의존하는 경향이 있다(농촌진흥청, 2002). 화학비료 및 유기합성농약의 과다사용으로 토양의 염류 집적, 양분 불균형 초래, 토양 미생물 및 천적 감소 등의 생태계 교란, 수질 오염, 농산물의 안전성 문제 등을 야기하고 있으며, 이와 같은 환경문제로 인하여 전 세계적으로 지속 가능한 농업을 위해 친환경적 농업을 장려하고 있다.
화학비료 및 유기합성농약의 과다 사용 시 발생하는 문제점은?
이러한 병해 방제를 위해서 경종적, 물리적방제 등 여러 가지 방제법이 있는데 대부분이 다수의 농약을 사용하는 화학적 방제에 의존하는 경향이 있다(농촌진흥청, 2002). 화학비료 및 유기합성농약의 과다사용으로 토양의 염류 집적, 양분 불균형 초래, 토양 미생물 및 천적 감소 등의 생태계 교란, 수질 오염, 농산물의 안전성 문제 등을 야기하고 있으며, 이와 같은 환경문제로 인하여 전 세계적으로 지속 가능한 농업을 위해 친환경적 농업을 장려하고 있다. 따라서 작물의 병해방제법도 화학농약 대신 토양 내 서식하는 길항 미생물이나 친환경제재를 이용하는 방제법으로 바뀌고 있으며, 이를 위한 방제연구가 많아지고 있다.
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