선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 대황(Rheum undulatum)은 전통적으로 한국과 중국에서 하제나 소염제로 사용되는 약용 식물이다. 본 연구의 목적은 R. undulatum이 캔디다증 환자로부터 분리한 C. albicans 바이오필름 형성 균주에 대한 바이오필름 형성 억제효과와 이에 대한 항진균 활성 기작을 알아보는 것이다. R.
제안 방법
- 2 ml의 YNB/Glucose를 각 well에 넣어 37℃에서 배양하였다. 24시간 후 부유세포를 조심스럽게 제거하고 0.1 ml PBS로 헹군 후 폴리스티렌 바닥에 부착된 C. albicans를 위상차 현미경(Olympus CKX41, Japan)을 통해 분석하였다(Kim, 2013).
- albicans의 세포 용해를 야기함을 관찰할 수 있었다. Crystal violet 흡수율 실험으로 R. undulatum에 의한 세포막 투과성의 변화를 관찰하였다. 따라서 R.
- PBS (50 μl)로 세포 침전물을 현탁하고 같은 양의 5 mg/ml neutral red를 넣어 10분 후 위상차 현미경(Olympus IX51)으로 관찰하였다.
- R. undulatum에 의한 세포막의 손상 효과를 propidium iodide로 염색한 후 공초점 레이저 현미경으로 관찰하였고, amphotericin B에 의한 세포막 손상효과와 비교하였다. Fig.
- R. undulatum에 의해 야기되는 C. albicans의 용해가 세포막의 투과성 변화와 관련이 있는지 알아보기 위해 0.5x MIC, 1x MIC, 2x MIC의 R. undulatum에 7시간 동안 노출된 C. albicans를 0.5% NaCl로 완충액을 바꾼 후 막의 투과성에 대한 변화를 crystal violet의 흡수율로 비교하였다. Fig.
- R. undulatum이 C. albicans 세포에 미치는 효과를 관찰하기 위해 3시간 동안 R. undulatum에 노출된 C. albicans를 CFDA, AM과 propidium iodide를 동시에 염색시켜 triple-band pass filter가 장착된 형광현미경을 통해 관찰하였다. CFDA, AM은 세포막의 완전성(integrity)에 대한 지표(indicator)로서 세포막을 통과할 수 있는 esterase의 기질이다.
- R. undulatum이 C. albicans의 폴리스티렌 표면 부착에 미치는 영향을 알아보기 위해 3시간 동안 형성된 C. albicans 바이오필름에 0.098 mg/ml R. undulatum을 처리한지 24시간 후에 폴리스티렌 표면에 부착된 C. albicans 세포들의 양상을 위상차 현미경을 통해 분석하였다(Fig. 1). Fig.
- Time-Kill assay는 Klepser (1998)의 방법을 변형하여 사용하였다. 대수기의 C.
- 습도가 유지되는 조건에서 24시간 동안 37°C에서 배양한 후 바이오필름의 생존력을 XTT 환원분석법에 따라 측정하였다. XTT로 분석하기 전 부유세포를 PBS로 헹구어 부착된 biofilm에 대한 생존력을 분석하였으며, 모든 실험은 6개씩 2회 분석하였다. 데이터는 2회 실험 중의 하나를 나타낸다.
- 1 ml의 배양액을 새 튜브에 옮긴 후 30초 동안 교반하여 출아 직후의 결합된 효모를 분리하였다. 각 시간별로 A600을 측정하여 세포의 수를 추정한 후 증류수로 적당히 희석하였다. 희석액 0.
- 막투과성 변화에 대한 분석은 Vaara의 방법(1981)을 변형하여 분석하였다. C.
- 바이오필름 활성은 XTT [2,3-Bis-(2-Methoxy-4-Nitro-5-Sulfophenyl)-2H-Tetrazolium-5-Carboxanilide] 환원분석법(Ramage et al., 2001)을 변형하여 측정하였다. 캔디다증 환자에서 분리한 12 C.
- , 2001). 본 실험의 바이오필름에 사용된 C. albicans 임상균주는 캔디다증 환자로부터 분리된 바이오필름을 형성하는 비율이 높은 고바이오필름 균주로서, 이들에 의해 형성된 초기단계 바이오필름에 R. undulatum을 처리한 후 이들이 24시간 동안 형성하는 바이오필름의 양을 대조군과 비교하여 XTT 환원분석법으로 측정하였다. XTT 환원분석법은 살아있는 세포의 미토콘드리아의 탈수소효소가 XTT tetrazolium을 주황색의 환원형 formazan으로 변환시키는 양을 490 nm에서의 흡광도(A490)로 측정하는 방법이다(Hawser, 1996).
- albicans가 바이오필름을 형성하게 하였다. 부유 상태의 C. albicans를 제거하고 0.1 ml의 PBS (Phosphate Buffered Saline)와 0.1 ml YNB/Glucose로 각각 1회씩 헹구었다. 음성 대조군을 포함하여 0.
- 세포 침전물을 50 μl PBS로 녹인 후 10 mg/ml CFDA, AM (Molecular probes, USA)과 10 mg/ml propidium iodide (Sigma)를 각각 1 μl씩 넣어 상온의 어두운 곳에서 30분간 염색한 후 triple pass filter가 장착된 형광현미경(Olympus IX51, Japan)을 통해 관찰하였다.
- 세포 침전물을 50 μl PBS로 현탁한 후 1 μl의 10 mg/ml propidium iodide를 넣어 10분간 염색한 후 공초점 레이저 현미경(Olympus FluoView 1000, Japan)을 사용하여 형광 이미지와 DIC (Differential interference contrast) 이미지를 얻었다.
- 1 ml YNB/Glucose로 각각 1회씩 헹구었다. 음성 대조군을 포함하여 0.098 또는 0.196 mg/ml의 R. undulatum이 포함된 0.2 ml의 YNB/Glucose를 각 well에 넣어 초기단계 바이오필름에 대한 R. undulatum 추출물의 저해효과를 조사하였다. 습도가 유지되는 조건에서 24시간 동안 37°C에서 배양한 후 바이오필름의 생존력을 XTT 환원분석법에 따라 측정하였다.
대상 데이터
- Candida albicans (KCCM 50235, ATCC 18804), C. glabrata(KCCM 50044, ATCC 2001), C. tropicalis (KCCM 50075, ATCC 750), C. krusei (KCCM 11426, ATCC 32196)는 한국미생물 보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에서 분양받아 사용하였다. 캔디다증 환자로부터 분리된 12 C.
- 경북 봉화군에서 자생하는 대황(R. undulatum Linne)의 건조된 뿌리줄기를 jchanbang.com (Korea)에서 구매하였다. 30 g의 대황을 600 ml의 95% 에탄올에 담가 24시간 동안 실온에서 추출한 후 2,000 × g로 20분간 원심분리하여 얻은 상등액을 진공 농축기로 감압, 농축시키고(EYELA, Japan) 동결건조하여 5.
- 최근 미생물과 관련된 질환의 보편적인 치료를 보완할 대체요법으로 천연물에서 기반한 화합물이 사람들의 이목을 끌고 있는데, 그 이유는 이들 화합물들이 질병과 감염에 대한 치료 및 예방을 위해 오랜 역사 동안 민간 요법으로 널리 사용되어 안전하다고 여겨지기 때문이다(Guarrera, 2005). 본 연구에서는 한방에서 기원전부터 하제와 소염제로 쓰고 있으며 여러 가지 처방에 배합하여 사용하고 있는 대황을 연구재료로 사용하였다(Yu et al., 2008). 한국과 중국에서 자생하는 대황(Rheum undulatum Linne)은 마디풀과(Polygonaceae)에 속하는 다년생 초본으로 산골짜기의 습지에서 자라며 6–7년 자란 굵은 황색의 원뿌리에서 껍질을 제거하여 말린 것을 약용으로 사용하고 있다.
- MIC는 3회의 분석 중 최소한 2회 일치하거나 3회 중 가장 높은 값을 채택하였다. 양성 대조군으로 amphotericin B (Sigma, USA)를 포함시켰다.
- krusei (KCCM 11426, ATCC 32196)는 한국미생물 보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에서 분양받아 사용하였다. 캔디다증 환자로부터 분리된 12 C. albicans 균주를 바이오필름 실험에 사용하였으며(Park et al., 2009), 바이오필름 실험을 제외한 모든 실험에 C. albicans ATCC 18804 사용하였다. 모든 균주는 -70℃에 보관하였고 필요시 YM agar 또는 YM 액체배지에서 계대배양 후 사용하였다.
데이터처리
- Crystal violet 용액의 A590을 100%로 간주하여 세포의 crystal violet에 대한 흡수율(%)을 (A590 of the sample/A590 of crystal violet solution)×100의 공식에 따라 계산하였다. 데이터는 3회 실험중의 하나이며 각 측정치는 duplicate로 측정한 값의 평균값을 나타낸다.
- 모든 실험은 2회 또는 3회 반복하였으며 통계분석은 t-test로, 두 그룹간의 차이는 Paired t-test로 Sigma Plot 10.0을 이용하여 분석하였다. P값이 0.
이론/모형
- C. albicans cells (2 × 104 CFU/ml) were incubated with shaking at 35℃ in the absence and the presence of 0.098 mg/ml R. undulatum, and a colony count assay was used to determine the relative viability of C. albicans.
- Crystal violet 용액의 A590을 100%로 간주하여 세포의 crystal violet에 대한 흡수율(%)을 (A590 of the sample/A590 of crystal violet solution)×100의 공식에 따라 계산하였다.
- R. undulatum을 넣고 배양한 C. albicans의 시간대별로 생존한 개체를 colony count법으로 분석하였다(Fig. 2). 9시간 동안 R.
- 습도가 유지되는 조건에서 24시간 동안 37°C에서 배양한 후 바이오필름의 생존력을 XTT 환원분석법에 따라 측정하였다.
- 캔디다증의 대표적인 원인이 되는 4가지 Candida 종에 대한 R. undulatum 에탄올 추출물의 항진균 활성을 CLSI M27-A3 미량희석법에 따라 분석하였다(Table 1). R.
- 항진균 감수성 검사는 CLSI M27-A3 미량희석법(2008)에 따라 수행하였으며 MIC는 성장이 현저히 감소되는 가장 낮은 농도로 결정하였다. MIC는 3회의 분석 중 최소한 2회 일치하거나 3회 중 가장 높은 값을 채택하였다.
성능/효과
- 12종의 C. albicans 바이오필름 형성 균주들이 3시간 동안 형성한 바이오필름에 0.098 mg/ml과 0.196 mg/ml R. undulatum에 24시간 노출시킨 후 부착된 C. albicans 바이오필름의 대사활성도를 측정해보니 각각 평균 49.4 ± 6.0%와 63.2 ± 6.5%의 대사활성도가 감소되었고, Paired t-test로 분석한 대조군과의 차이는 모든 균주에서 95% 또는 99% 수준에서 유의성을 나타냈다(Table 2).
- albicans의 세포벽이나 세포막에 결합하였기 때문일 것으로 보여진다. 2x MIC R. undultum을 처리한 경우 37%의 crystal violet에 대한 흡수율을 나타내면서 대조군과 비교할 때 약 14%의 차이를 관찰할 수 있었고 3회의 실험에서 일관성 있는 결과를 나타냈다. 이는 R.
- 098 mg/ml를 나타냈다. C. tropicalis ATCC 32196에 대한 R. undulatum의 MIC는 다른 Candida 종에 비해 높은 0.196 mg/ml를 나타냈다. 정제된 Amphotericin B의 MIC와 비교한다면 R.
- albicans의 폴리스티렌 표면으로의 부착을 억제시켰다. CFDA, AM과 propidium iodide로 이 중 염색한 결과 R. undulatum은 C. albicans의 세포막을 손상시켰으며 propidium iodide와 neutral red로 염색하여 공초점 레이저 현미경과 위상차 현미경으로 관찰한 결과 C. albicans의 세포 용해를 야기함을 관찰할 수 있었다. Crystal violet 흡수율 실험으로 R.
- R. undulatum (0.098 mg/ml)은 12종의 바이오필름 형성 임상균주의 캔디다 바이오필름을 49.4 ± 6.0% 감소시켰고 C. albicans의 폴리스티렌 표면으로의 부착을 억제시켰다.
- albicans 세포막의 손상으로 세포내의 어떤 성분의 유출되어 esterase가 활동하는 세포내 환경의 변화로 인해 esterase의 활성이 최대로 나타나지 못했거나, 세포막이 부분적 또는 완전한 용해(lysis)로 esterase가 세포밖으로 유출되어 CFDA, AM이 CF로 변환되는 양이 감소하였기 때문으로 생각된다. R. undulatum을 4시간 처리한 실험군의 경우 붉은 색을 띠며 죽은 C. albicans의 비율이 오히려 감소한 것처럼 나타났고, propidium idodide로 염색된 붉은 색의 cell debris가 응집된 것처럼 보이는 큰 덩어리가 화살표로 표시한 것처럼 군데 군데 관찰되었다(Fig. 3C). 이는 세포막에 손상을 입어 세포 내의 propidium iodide로 염색된 DNA나 RNA가 세포의 용해를 동반한 세포의 죽음으로 유출되어 관찰되는 현상으로 여겨진다.
- undulatum 에탄올 추출물의 항진균 활성을 CLSI M27-A3 미량희석법에 따라 분석하였다(Table 1). R. undulatum의 C. albicans ATCC 18804에 대한 MIC는 0.098 mg/ml이었고, 분석에 이용한 표준 균주 C. glabrata ATCC 2001, C. kruse ATCC 750에 대한 MIC도 0.098 mg/ml를 나타냈다. C.
- 5%의 대사활성도가 감소되었고, Paired t-test로 분석한 대조군과의 차이는 모든 균주에서 95% 또는 99% 수준에서 유의성을 나타냈다(Table 2). 따라서 R. undulatum은 C. albicans의 바이오필름 형성을 상당히 억제하는 물질을 포함하고 있음을 알 수 있다.
- undulatum에 의한 세포막 투과성의 변화를 관찰하였다. 따라서 R. undulatum은 세포막의 손상과 세포막의 투과성 변화로 야기된 세포의 용해와 관련된 항진균 활성이 C. albicans의 바이오필름 형성을 억제하는 것으로 보여진다. 본 연구의 결과는 R.
- 096 mg/ml)에서 세포막의 투과성 변화를 동반한 세포막의 손상과 세포의 용해로 바이오필름 형성을 억제하는 유효 성분을 함유하고 있음을 보여준다. 따라서 R. undulatum은 천연물에 기반한 새로운 항진균제 개발에 대한 좋은 후보물질임을 나타낸다.
- 본 논문은 R. undulatum의 에탄올 추출물이 캔디다증 환자들로부터 분리된 바이오필름 형성 Candida 균주에 대해 우수한 항바이오필름 능력을 나타내며, CFDA, AM (5-carboxyfluorescein diacetate, acetoxymethyl ester)과 propidium iodide 이중 염색, neutral red와 propidium iodide으로 각각 염색한 후의 이미지 분석을 통해 R. undulatum이 C. albicans 세포막을 손상시키고 세포의 용해를 유발함을 보여주었다. 더불어 R.
- 그러므로 제한된 항진균제를 사용하는 현 시점에서 바이오필름을 제거할 수 있는 효과적인 항진균제의 개발이 절실하게 필요한 실정이다. 본 실험의 결과에서 R. undulatum은 비교적 낮은 농도(0.096 mg/ml)에서 세포막의 투과성 변화를 동반한 세포막의 손상과 세포의 용해로 바이오필름 형성을 억제하는 유효 성분을 함유하고 있음을 보여준다. 따라서 R.
- 정제된 Amphotericin B의 MIC와 비교한다면 R. undulatum 에탄올 추출물의 Candida 종에 대한 MIC는 약 400배 높은 값을 나타냈으나, 8종류 식물에서 추출한 물질의 C. albicans와 Aspergillus niger에 대한 MIC가 0.5–0.9 mg/ml (Mathur et al., 2011)이고, 23종류 약초의 C. albicans, C. glabrata, C. guilliermondii, C. krusei, C. parapsilosis, C. tropicalis에 대한 MIC가 0.1–0.5 mg/ml (Rukayadi et al., 2008)인 것과 비교한다면, R. undulatum은 상당히 우수한 항진균 활성을 가지는 것으로 판단된다.
후속연구
- albicans는 crystal violet에 대한 흡수율이 증가되었다. 따라서 본 연구의 결과는 R. undulatum의 항바이오필름 활성이 C. albicans의 막투과성 변화로 인한 생리적 변화 그리고 세포 용해와 관련이 있으며 R. undulatum이 새로운 항진균제 개발에 대한 훌륭한 후보물질의 가능성을 가짐을 시사한다.
- albicans의 바이오필름 형성을 억제하는 것으로 보여진다. 본 연구의 결과는 R. undulatum이 바이오필름과 관련된 캔디다의 감염을 치료하고 제거하기 위한 천연물 기반 항진균제 개발에 대한 좋은 후보물질임을 보여준다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.