RAW264.7 대식세포에서 풀솜대 추출물의 nitric oxide 및 prostaglandin E2생성 저해효과 Inhibitory effects of extracts from Smilacina japonica on lipopolysaccharide induced nitric oxide and prostaglandin E2 production in RAW264.7 macrophages원문보기
본 연구에서는 풀솜대(Smilacina japonica)의 전초를 이용하여 세포독성 및 항염증 활성 효과를 평가하였다. 대식세포인 RAW264.7 cell에서 염증 매개 물질인 lipopo-lysacchride (LPS)로 염증을 유발시켜 nitric oxide (NO)와 prostaglandin$E_2$ ($PGE_2$) 같은 염증 유발인자들의 억제효과를 확인하였다. 풀솜대 chloroform 분획물의 염증 유발인자 억제 시 $IC_{80}$ value를 측정하였을 때 nitric oxide 및 prostaglandin $E_2$ 생성을 농도의존적으로 현저하게 저해하는 농도는 각각 53.3과 $32.5{\mu}g/ml$이었다. 따라서 본 연구 결과는 풀솜대의 chloroform과 같은 비극성용매 분획물들이 유의성 있는 항염증 효과를 나타내었으며, 이러한 효능은 예방의학적 가능성을 충분히 가지고 있기에 염증성질환의 예방을 위한 건강 기능성식품의 개발 가능성을 제시할 수 있을 것으로 기대된다. 또한 염증과 관련된 사이토카인 및 단백질 발현 메커니즘에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 판단된다.
본 연구에서는 풀솜대(Smilacina japonica)의 전초를 이용하여 세포독성 및 항염증 활성 효과를 평가하였다. 대식세포인 RAW264.7 cell에서 염증 매개 물질인 lipopo-lysacchride (LPS)로 염증을 유발시켜 nitric oxide (NO)와 prostaglandin $E_2$ ($PGE_2$) 같은 염증 유발인자들의 억제효과를 확인하였다. 풀솜대 chloroform 분획물의 염증 유발인자 억제 시 $IC_{80}$ value를 측정하였을 때 nitric oxide 및 prostaglandin $E_2$ 생성을 농도의존적으로 현저하게 저해하는 농도는 각각 53.3과 $32.5{\mu}g/ml$이었다. 따라서 본 연구 결과는 풀솜대의 chloroform과 같은 비극성용매 분획물들이 유의성 있는 항염증 효과를 나타내었으며, 이러한 효능은 예방의학적 가능성을 충분히 가지고 있기에 염증성질환의 예방을 위한 건강 기능성식품의 개발 가능성을 제시할 수 있을 것으로 기대된다. 또한 염증과 관련된 사이토카인 및 단백질 발현 메커니즘에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 판단된다.
Smilacina japonica is a localized common rhizomatous flowering plant, This plant is often used in Korean traditional systems of medicine as a remedy for migrain, diplegia, physical impurity, blood circulation, abscess and contusion. Generally drugs that are used for arthritis have antinociceptive an...
Smilacina japonica is a localized common rhizomatous flowering plant, This plant is often used in Korean traditional systems of medicine as a remedy for migrain, diplegia, physical impurity, blood circulation, abscess and contusion. Generally drugs that are used for arthritis have antinociceptive and anti-inflammatory properties. However, validity of the anti-inflammatory activity has not been scientifically investigated so far. Therefore, the aim of this study was to investigate the anti-inflammatory potential of S. japonica using the ethanolic extract and its subfractions. To evaluate the anti-inflammatory effects, we examined the inflammatory mediators such as nitric oxide (NO) and prostaglandin $E_2$ ($PGE_2$) on RAW 264.7 macrophages. Our results indicated that hexane fraction significantly inhibited the LPS induced NO and $PGE_2$ production in the cells. The hexane fractions inhibitory activity for NO tests with $IC_{50}$ values showed in $53.3{\mu}g/ml$ and $PGE_2$ tests with $IC_{50}$ values showed at $32.5{\mu}g/ml$. Theseis result suggest a potential role of hexane fraction from S. japonica as source of anti-inflammatory agent.
Smilacina japonica is a localized common rhizomatous flowering plant, This plant is often used in Korean traditional systems of medicine as a remedy for migrain, diplegia, physical impurity, blood circulation, abscess and contusion. Generally drugs that are used for arthritis have antinociceptive and anti-inflammatory properties. However, validity of the anti-inflammatory activity has not been scientifically investigated so far. Therefore, the aim of this study was to investigate the anti-inflammatory potential of S. japonica using the ethanolic extract and its subfractions. To evaluate the anti-inflammatory effects, we examined the inflammatory mediators such as nitric oxide (NO) and prostaglandin $E_2$ ($PGE_2$) on RAW 264.7 macrophages. Our results indicated that hexane fraction significantly inhibited the LPS induced NO and $PGE_2$ production in the cells. The hexane fractions inhibitory activity for NO tests with $IC_{50}$ values showed in $53.3{\mu}g/ml$ and $PGE_2$ tests with $IC_{50}$ values showed at $32.5{\mu}g/ml$. Theseis result suggest a potential role of hexane fraction from S. japonica as source of anti-inflammatory agent.
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문제 정의
, 1997) 한다. 본 연구는 풀솜대 추출･분획물을 이용하여 LPS 유도를 통한 대식세포주인 RAW 264.7macrophage 세포를 이용한 염증 모델을 사용하여 항염증 효과를 구명하고자 하였다. 풀솜대에서 추출･분획한 총 4개의 농축물을 MTT assay를 실시하여 세포독성을 IC80으로 나타내고 독성이 없는 유효농도 범위를 설정하여 각각의 추출물의 유효농도 범위 내에서 저, 중, 고 상태로 3가지 농도를 설정하였다.
본 연구에서는 풀솜대(Smilacina japonica)의 전초를 이용하여 세포독성 및 항염증 활성 효과를 평가하였다. 대식세포인 RAW264.
생성을 효과적으로 저해하였다. 풀솜대 분획물들을 이용하여 murine macrophage cell인 RAW 264.7 cell에서 LPS에 의해 유도된 염증성 대사산물인 Nitric oxide의 생성과 Prostaglandin E2 생성의 저해 효과를 확인을 통해 추후 항염증 효과 확인 실험에 있어서 가장 유력한 후보물질을 선택하고자 하였다. MTT assay에 의해 설정된 농도에 따라 screening을 진행한 결과 풀솜대 chloroform 분획물이 NO와 PGE2의 생성 저해 실험 시 지용성이 높은 chloroform 분획물이 효과가 크므로, 약효성분에 대한 추후 연구를 진행하는 것이 필요하다고 사료된다.
현재 국내 및 외적으로 천연물로부터 기능성 성분의 소재를 발굴하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있으나, 풀솜대의 생리활성에 관한 연구는 아직까지 미진한 편이며, 따라서 본 연구자들은 lipopolysaccharide (LPS)로 염증 반응이 유도된 RAW 264.7 대식세포에 풀솜대 추출·분획물을 처리하여, 항염증 활성(NO, PGE2) 효과를 평가 후 기능성 소재로서의 가능성을 제시하고자 본 연구를 수행하였다.
제안 방법
Chloroform 분획물이 IC50가 53.3 μg/ml으로 NO 생성을 농도 의존적으로 가장 잘 저해하였으나, 다른 분획물들과 비교 시 유의성 있게 높은 것으로 판단하기 어렵기에 다른 염증성 대사산물들의 저해 효과를 추가적으로 확인하였다.
풀솜대에서 추출･분획한 총 4개의 농축물을 MTT assay를 실시하여 세포독성을 IC80으로 나타내고 독성이 없는 유효농도 범위를 설정하여 각각의 추출물의 유효농도 범위 내에서 저, 중, 고 상태로 3가지 농도를 설정하였다. Endotoxin인 lipopolysacch-aride (LPS)를 처리하여 염증 지표인 Nitric oxide (NO)의 생성을 유도하고 각 추출･분획물을 처리하여 NO 생성 저해효과를 확인함으로써 가장 효과가 좋은 분획물인 풀솜대chloroform 분획물을 선택하였다. 상기의 분획물을 이용하여 Prostaglandin E2 (PGE2) 생성 저해효과를 확인하였다.
Griess reagent [1% (w/v) sulfanilamide in 5%(v/v) phosphoric acid 와 0.1% (w/v) naphtylethylenediamine-HCl]를 이용하여 RAW 264.7 세포로부터 생성된 NO의 양을 세포 배양액 중에 존재하는 NO2-의 형태로서 측정하였다. Griess reagent를 100 μl씩 혼합하여 96 well plate에서 10분 동안 반응시킨 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
MTT assay 수행 결과 세포독성을 나타내지 않는 농도에서 LPS에 의해 활성화된 RAW264.7세포의 배양액 중에 생성된 NO의 양을 Griess reagent를 이용하여 측정하였다. Table 3과 Figure 1에서 볼 수 있듯이 Positive control인 NIL (N6-(1-iminoethy- l)-L-lysine, dihydrochloride : NO 생성 억제제)에 비하여 높은 효과를 나타내는 것은 풀솜대 hexane분획물과 chloroform 분획물이었다.
Nitric oxide screening 실험에서 억제효과를 나타내는 분획물들을 LPS에 의해 유도되는 또 다른 염증성 대사산물인 PGE2의 생성 저해효과를 NS398{N-[2-(Cyclohe-xyl-oxy)-4- nitrophenyl]methanesulfonamide : COX-2 선택적 생성억제 제}이라는 positive control로 사용하여 확인하였다. NO assay 실험에서 NO 생성 저해 효과가 뛰어난 풀솜대의 chloroform 분획물을 이용하여 PGE2생성 저해 효과를 측정하였다. chloroform 분획물의 IC50가 32.
Nitric oxide screening 실험에서 억제효과를 나타내는 분획물들을 LPS에 의해 유도되는 또 다른 염증성 대사산물인 PGE2의 생성 저해효과를 NS398{N-[2-(Cyclohe-xyl-oxy)-4- nitrophenyl]methanesulfonamide : COX-2 선택적 생성억제 제}이라는 positive control로 사용하여 확인하였다. NO assay 실험에서 NO 생성 저해 효과가 뛰어난 풀솜대의 chloroform 분획물을 이용하여 PGE2생성 저해 효과를 측정하였다.
PBS (Bioneer Co., Korea) 완충용액으로 세척한 후 각각의 well에 H2O2 (BBC Biochemical, USA) 100 μl 및 여러 농도의 시료 100 μl를 첨가하여 45분간 배양한 후 상등액을 제거하고 PBS 완충용액으로 2번 세척한 후 배지 200 μl를 주입하여 다시 24시간 배양하였다.
RAW 264.7세포에 시료 용액의 여러 농도(10, 20, 40μM)를 1시간 전 처리한 후 LPS를 처리하고 24시간 배양하였다.
본 연구에서는 풀솜대(Smilacina japonica)의 전초를 이용하여 세포독성 및 항염증 활성 효과를 평가하였다. 대식세포인 RAW264.7 cell에서 염증 매개 물질인 lipopo-lysacchride (LPS)로 염증을 유발시켜 nitric oxide (NO)와 prostaglandinE2 (PGE2) 같은 염증 유발인자들의 억제효과를 확인하였다. 풀솜대 chloroform 분획물의 염증 유발인자 억제 시 IC80 value를 측정하였을 때 nitric oxide 및 prostaglandin E2 생성을 농도의존적으로 현저하게 저해하는 농도는 각각 53.
배양액 속에 5 mg/ml MTT 시약 50μl을 가하여 4시간 배양 후 상등액을 제거하고 DMSO (Sigma Chemical Co., USA) 100 μl를 첨가한 후 540 nm에서 ELISA microplate reader (Bio-Tek Instruments Co., USA)로 흡광도를 측정하여 생존율을 계산하였다.
Endotoxin인 lipopolysacch-aride (LPS)를 처리하여 염증 지표인 Nitric oxide (NO)의 생성을 유도하고 각 추출･분획물을 처리하여 NO 생성 저해효과를 확인함으로써 가장 효과가 좋은 분획물인 풀솜대chloroform 분획물을 선택하였다. 상기의 분획물을 이용하여 Prostaglandin E2 (PGE2) 생성 저해효과를 확인하였다. 풀솜대 chloroform 분획물이 PGE2의 생성을 저해함으로써 유의성 있는 항염증 효과를 보이는 것으로 확인할 수 있었다.
7macrophage 세포를 이용한 염증 모델을 사용하여 항염증 효과를 구명하고자 하였다. 풀솜대에서 추출･분획한 총 4개의 농축물을 MTT assay를 실시하여 세포독성을 IC80으로 나타내고 독성이 없는 유효농도 범위를 설정하여 각각의 추출물의 유효농도 범위 내에서 저, 중, 고 상태로 3가지 농도를 설정하였다. Endotoxin인 lipopolysacch-aride (LPS)를 처리하여 염증 지표인 Nitric oxide (NO)의 생성을 유도하고 각 추출･분획물을 처리하여 NO 생성 저해효과를 확인함으로써 가장 효과가 좋은 분획물인 풀솜대chloroform 분획물을 선택하였다.
대상 데이터
RAW264.7세포를 10% FBS 및 penicillin (100 μg/ml), streptomycin (100 U/ml )이 포함된 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (Gibco, Co.,USA) 배지에서 37℃, 5% CO₂조건을 유지하여 배양하였다.
본 실험에서 사용한 풀솜대는 2013년 7월 강원도 양구군 동면 일대에서 자생하는 전초를 채집하여 상지대학교 제약공학과 박희준 교수에 의뢰하여 감정을 받고 건조한 후 세절하여 사용하였고, 표본은 고령지농업연구센터 유기분석실험실(표본 번호 NIHA-자 02)에 보관되어 있다.
데이터처리
실험치의 값은 3번의 독립된 실험을 시행하여 mean ± S.D.로 나타냈으며 분석은 Student’s t-test로 유의성을 나타내었다.
이론/모형
세포의 독성 정도를 확인하기 위하여 MTT (Sigma Chemical Co., USA) 시험법으로 측정하였다. 96 well plate (Falcon T.
풀솜대 추출·분획물의 항염증 효과를 규명하기에 앞서 RAW264.7세포에 독성을 통한 염증 매개 물질의 저해효과 가능성을 배제하는, 즉 독성이 없는 최적 용량을 설정하기 위하여 MTT assay를 실시하였다.
성능/효과
Viability가 80%가 넘는 농도가 최적 용량이라고 판단하였고 Table 2에서 볼수 있듯이 풀솜대의 hexane 분획물이 50 μg/ml이상 에서 IC80 값을 가졌으며, 다른 추출물 및 분획물들은 100 μg/ml 의 농도에서도 독성을 나타내지 않는 것으로 확인되었다.
chloroform 분획물의 IC50가 32.5 μg/ml으로 LPS 에 의해 유의성 있게 증가한 PGE2생성을 농도 의존적으로 저해하는 것을 확인하였다(Fig. 2).
상기의 분획물을 이용하여 Prostaglandin E2 (PGE2) 생성 저해효과를 확인하였다. 풀솜대 chloroform 분획물이 PGE2의 생성을 저해함으로써 유의성 있는 항염증 효과를 보이는 것으로 확인할 수 있었다.
후속연구
7 cell에서 LPS에 의해 유도된 염증성 대사산물인 Nitric oxide의 생성과 Prostaglandin E2 생성의 저해 효과를 확인을 통해 추후 항염증 효과 확인 실험에 있어서 가장 유력한 후보물질을 선택하고자 하였다. MTT assay에 의해 설정된 농도에 따라 screening을 진행한 결과 풀솜대 chloroform 분획물이 NO와 PGE2의 생성 저해 실험 시 지용성이 높은 chloroform 분획물이 효과가 크므로, 약효성분에 대한 추후 연구를 진행하는 것이 필요하다고 사료된다.
5 μg/ml이었다. 따라서 본 연구 결과는 풀솜대의 chloroform과 같은 비극성용매 분획물들이 유의성 있는 항염증 효과를 나타내었으며, 이러한 효능은 예방의학적 가능성을 충분히 가지고 있기에 염증성질환의 예방을 위한 건강 기능성식품의 개발 가능성을 제시할 수 있을 것으로 기대된다. 또한 염증과 관련된 사이토카인 및 단백질 발현 메커니즘에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 판단된다.
따라서 본 연구 결과는 풀솜대의 chloroform과 같은 비극성용매 분획물들이 유의성 있는 항염증 효과를 나타내었으며, 이러한 효능은 예방의학적 가능성을 충분히 가지고 있기에 염증성질환의 예방을 위한 건강 기능성식품의 개발 가능성을 제시할 수 있을 것으로 기대된다. 또한 염증과 관련된 사이토카인 및 단백질 발현 메커니즘에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 판단된다.
본 연구진은 앞으로 염증 매개 물질의 발현을 조절하는 전사 인자인 iNOS, COX-2, NF-κB 및 cAMP response element (CRE), SRE (serum response element), activator protein-1 (A P-1), mitogenactivated protein kinase (MAPK) 등 (Feldman et al., 1996: Karin and Ben-Neriah 2000)의 다양한 전사 조절인자들의 신호전달 양상을 연구를 함으로써 풀솜대의 비극성용매 분획물들이 어떠한 경로를 통해 항염증 효과를 보이는지 그 기전을 밝히고 추후 in vivo 실험을 바탕으로 향후 염증성질환의 예방을 위한 건강 기능성식품의 개발 가능성을 제시하고자 한다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
염증반응이란 무엇인가?
염증반응은 외부로부터 물리·화학적 자극, 세균, 박테리아 또는 바이러스 같은 유해물질이 체내로 유입되는 경우, 체내 면역세포가 이를 감지하여 다양한 염증매개 물질들을 분비함으로써 손상된 조직을 수복 및 재생하려는 신체보호 기전 중 하나이다. 그러나 이와 같은 염증반응이 멈추지 않고 지속적으로 일어날 때는 염증매개 물질이 과도하게 분비되어 암세포의 성장을 촉진시키고, 인슐린 저항성을 증가시키며 동맥경화를 악화시키는 등 다양한 질병의 매개체로써 중요한 역할을 한다고 보고되고 있다(Nishida et al.
macrophage는 염증반응 시 어떤 역할을 하는가?
2009). 염증반응에 관여하는 주요 세포는 macrophage (대식세포)로 알려져 있으며, 여러 자극이나 면역세포들이 분비하는 사이토카인 등에 의해 활성화되어, 염증성 사이토카인, nitric oxide (NO)와 prostaglandinE2 (PGE2)를 생성함으로써 통증, 부종, 기능장애, 홍반 및 발열 등의 염증반응을 유발하고, 염증유발부위로 면역세포의 이동을 활성화시킨다(Kim et al. 2012).
nitric oxide는 어떻게 생성되며 무엇으로 나뉘는가?
2012). 이 중 NO는 반응성이 높은 물질로 NO synthase (NOS)에 의해 L-arginine으로부터 생성되며 NOS는 항시 적인 NOS와 유도성의 NOS (iNOS)로 나누어진다. 특히 iNOS는 외부자극이나 염증성 사이토카인 등에 의해 자극을 받게 되면 hepatocytes, smooth muscle cells, bone marrow cells, monocytes, macrophages 등 다양한 세포에서 발현되어 다량의 NO를 생산한다고 보고되고 있다.
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