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문제 정의
- 본 연구는 혈당센서에서 사용되는 산화/환원 매개체를 합성하기 위하여 페레이트에 일차아민을 갖는 피리딘을 배위시켜 Fe(CN)5-aminopyridine을 합성하였다. 이물질의 합성여부를 CV과 UV-Vis를 통해 확인하였고 기존의 혈당 센서에서 사용되었던 당 산화 효소의 단점을 보완하기 위해 당 탈 수소 효소를 이용해 ITO 전극 위에 효소 전극을 제작하였다.
제안 방법
- 22) 하지만 이중효소 시스템은 매우 복잡하기 때문에 본 논문에서는 이러한 문제점을 해결 하기 위해 페레이트(ferrate)에 아닐린(aniline)를 배위시켜 1차 아민(primary amine; NH2)기를 갖는 페레이트 화합물 [Fe(CN)5-aminopyridine]을 합성하였다. 합성된 페레이트 화합물은 1차 아민(primary amine; NH2)기의 역할로 전극 표면 위에서 효소와의 화학적 결합으로 고정되기 때문에 효소 근처에서 물리적으로 일어나는 정전기적 반발을 감소시키고, 전극으로의 전자 전달 반응을 증가시켰다.
- 29,30)이 혼합액을 ITO 전극 위에 각각 20 µL 씩 casting하고 24시간 건조하여 포도당 측정을 위한 전극을 제작하였다.
- ITO 전극 위에 Fe(CN)5-aminopyridine와 당 탈 수소 효소, 금 나노 입자를 PEGDGE를 이용하여 고정시킨 후 표면의 특성을 관찰하기 위해 FE-SEM을 측정 하였다(Fig. 3).
- 28) 수득한 금 나노 입자 콜로이드용액을 원심 분리하여 상층 액을 제거하는 과정을 몇 차례 거친 후 100 mM의 cysteamine hydrochloride를 첨가하여 1 시간 동안 초음파 반응기로 반응하였다. 그 후 증류수로 세척을 하여 상층 액을 따라내어 금 나노 입자표면에 cysteamine hydrochloride가 처리된 60 nm 크기의금 나노 입자를 수득 하였다.
- 1(b)) 산화/환원 매개체의 비교 분석을 위해 Fe(CN)5-aminopyridine대신 Fe(CN)6를 동일 농도로 섞어 Fe(CN)6가 고정화된 전극도 제작하였다. 또한 금 나노입자의 효과를 보기 위해 금 나노 입자가 포함되지 않은 전극도 제작하였다. 제작된 ITO전극 표면의 금 나노 입자의 입자 크기와 밀도는 FE-SEM을 통해 확인하였다.
- 이물질의 합성여부를 CV과 UV-Vis를 통해 확인하였고 기존의 혈당 센서에서 사용되었던 당 산화 효소의 단점을 보완하기 위해 당 탈 수소 효소를 이용해 ITO 전극 위에 효소 전극을 제작하였다. 또한 신호의 증폭을 위해금 나노 입자에 1차 아민을 결합시켜 전극 위에 산화/환원 매개체, 효소를 함께 가교제인 PEGDGE를 이용하여 고정화 시켰다. 제작된 효소전극은 포도당의 농도 별산화 촉매 전류가 금 나노 입자가 없을 때보다 2배 이상 증폭됨을 알 수 있었고, 기존의 혈당 센서의 산화/환원 매개체인 Fe(CN)6보다 선택성과 민감성 그리고 안정성이 우수함을 알 수 있었다.
- 본 논문에서는 이러한 점을 착안하여 금 나노 입자에 1차 아민기를 형성하고, 합성된 페레이트 화합물, 당 탈 수소 효소를 가교제(cross-linker)인 PEGDGE (poly(ethylene glycol) diglycidyl ether)를 이용하여 ITO (Indium tin oxide) 전극 위에 상온에서 고정하였다. 제작한 효소전극은 포도당의 농도에 따라 감응하며 높은 전류 밀도와 효소와의 좋은 선택성을 보이고, 높은 안정성을 나타내었다.
- 이 용액을 잘 저어주면서 1 %의 trisodium citrate용액을 서서히 첨가하여준다. 이때 gold chloride trihydrate용액의 색 변화를 관찰하여 붉은색을 나타낼 때 까지 trisodium citrate를 가하여 40 nm크기를 가지는 붉은색 콜로이드 상태의 금 나노 입자를 수득하였다.28) 수득한 금 나노 입자 콜로이드용액을 원심 분리하여 상층 액을 제거하는 과정을 몇 차례 거친 후 100 mM의 cysteamine hydrochloride를 첨가하여 1 시간 동안 초음파 반응기로 반응하였다.
- -aminopyridine을 합성하였다. 이물질의 합성여부를 CV과 UV-Vis를 통해 확인하였고 기존의 혈당 센서에서 사용되었던 당 산화 효소의 단점을 보완하기 위해 당 탈 수소 효소를 이용해 ITO 전극 위에 효소 전극을 제작하였다. 또한 신호의 증폭을 위해금 나노 입자에 1차 아민을 결합시켜 전극 위에 산화/환원 매개체, 효소를 함께 가교제인 PEGDGE를 이용하여 고정화 시켰다.
- 또한 금 나노입자의 효과를 보기 위해 금 나노 입자가 포함되지 않은 전극도 제작하였다. 제작된 ITO전극 표면의 금 나노 입자의 입자 크기와 밀도는 FE-SEM을 통해 확인하였다.
- 제작된 효소 전극 위에 포도당과 당 탈 수소 효소 가 반응하여 나오는 전자를 산화/환원 매개체가 전극에 전자를 전달할 때 발생하는 촉매산화전류를 느린 순환 전압 전류법을 이용하여 포도당 농도 (0.0, 0.1, 0.5, 1.0, 5.0, 10.0 mM)별로 측정하였다. 이 때 가해준 전위의 범위는 0.
- 제작한 전극에 농도가 다른 포도당 용액(0.0, 0.1, 0.5, 1.0, 5.0, 10.0 mM) 40 µL을 올린뒤 30초간 반응한 후 순환전압 전류법을 이용하여 포도당의 농도에 따른 전기적 특성을 관찰하였다.
- 01 V/s 이었다. 촉매전류가 나타나는 전위의 위치 중 전류 값이 일정하게 유지되는 한 지점을 0.4 V (versus Ag/AgCl)로 고정하고 검정곡선을 도시하여 포도당 농도 별로 발생하는 촉매전류의 상관관계를 확인하였다. 본 논문에서 산화/환원 매개체로 사용한 Fe(CN)5 -aminopyridine 물질은 포도당의 농도 (10 mM)에 따른 촉매 전류밀도(current density)가 약 4000 µA/cm2가 나오는 것을 알 수 있었고 (Fig.
대상 데이터
- 실험에 사용된 시약인 Ammonium disodium pentacyanoamminferrate dihydrate는 Fluka의 제품을정제 없이 그대로 사용했으며, Gold chloride trihydrate, 4-Aminopyridine, trisodium citrate, cysteamine hydrochloride, D-(+)-Glucose Anhydrous, ferricyanide, PEGDGE는 Aldrich(Milwaukee, WI)사의제품을 정제 없이 그대로 사용하였다. 용매로 사용된 Ethyl ether는 덕산 약품사의 시약을 정제 없이 그대로 사용하였다.
- 실험에 사용된 시약인 Ammonium disodium pentacyanoamminferrate dihydrate는 Fluka의 제품을정제 없이 그대로 사용했으며, Gold chloride trihydrate, 4-Aminopyridine, trisodium citrate, cysteamine hydrochloride, D-(+)-Glucose Anhydrous, ferricyanide, PEGDGE는 Aldrich(Milwaukee, WI)사의제품을 정제 없이 그대로 사용하였다. 용매로 사용된 Ethyl ether는 덕산 약품사의 시약을 정제 없이 그대로 사용하였다. 위에 사용된 모든 시약은 분석시약 급이었다.
- 위에 사용된 모든 시약은 분석시약 급이었다. 전기화학 실험에서 전해질로는 4.3 mM NaH2PO4, 15.1 mM Na2HPO4, 140 mM NaCl을 포함하는 Phosphate buffered saline(PBS, pH 7.2)을 사용하였고, 효소인 GDH(706 units/mg)는 Toyobo의 제품을 정제 없이 그대로 사용하였다. 모든 용액의 제조와 실험을위하여 3차 증류수 (Millipore, Bedford, MA; 저항 18 M·Ωcm)를 사용하였다.
이론/모형
- 전기화학 실험에서 순환 전압 전류법(Cyc lic Voltammetry; CV)을 측정을 하는데 사용된 기기는 CH Instruments (Austin, TX, USA)의 model 660B Elctrochemical workstation을 사용하였으며 합성한 물질의 분광학적 분석을 하는데 사용한 기기는 Shimadzu (Japan)의 UV-1601PC model을 사용하였다. 또한 전극 표면의 특징을 확인하는데 사용된 기기는 SEM(Scanning Electron Microscopy, TESCAN/USA) 을 사용하였다.
- 전기화학 실험에서 순환 전압 전류법(Cyc lic Voltammetry; CV)을 측정을 하는데 사용된 기기는 CH Instruments (Austin, TX, USA)의 model 660B Elctrochemical workstation을 사용하였으며 합성한 물질의 분광학적 분석을 하는데 사용한 기기는 Shimadzu (Japan)의 UV-1601PC model을 사용하였다. 또한 전극 표면의 특징을 확인하는데 사용된 기기는 SEM(Scanning Electron Microscopy, TESCAN/USA) 을 사용하였다.
성능/효과
- 또한 효소에 활성 부분과의 거리도 멀어지고, 입체적인 구조가 작은 Fe(CN)6가 효소에 접근하지 못하여 전기적인 촉매 반응이 잘 일어나지 못한다.22) 반면에 Fe(CN)5-aminopyridine은 합성된 피리딘기의 1차아민이 PEGDGE의 알데하이드 기와 반응하여 효소와금 나노 입자들과 함께 전극에 단단히 고정되어 물질과 전극간의 전자전달반응이 원활해지며 신호의 세기가 좋아지고 민감도 또한 증가되는 결과를 가져왔다. 또한 포도당의 정량적 측정을 위한 검출 한계(detection limit)는 0.
- 이 결과는 전극 위에서 전자 전달반응이 확산 반응(diffusion reaction)에 의해 조절 되고 있음을 알려주며, 산화/환원 매개체로서의 성능이우수함을 나타내준다.31) UV-Vis 결과에서는 초기물질인 Ammonium disodium pentacyanoamminferrate dihydrate의 흡광도가 400 nm정도에서 나오는 것과 비교하여 합성된 Fe(CN)5-aminopyridine는 150 nm정도 이동한 550 nm에서 흡광도가 나타는 것을 통해 합성이 되었음을 확인 할 수 있었다(Fig. 2(b)).
- 합성된 페레이트 화합물은 1차 아민(primary amine; NH2)기의 역할로 전극 표면 위에서 효소와의 화학적 결합으로 고정되기 때문에 효소 근처에서 물리적으로 일어나는 정전기적 반발을 감소시키고, 전극으로의 전자 전달 반응을 증가시켰다. 또한 기존의 혈당센서에서 산화/환원 매개체로 사용되었던 페리시아나이드 보다 당 탈 수소 효소와의 전자전달 반응이 더욱 더 안정하며, 선택성이 있어 포도당이 산화될 때, 높은 전류 신호를 갖는 결과를 얻었다.
- 2(a)). 또한 주사 속도에 제곱근 (square root)을 취한 값에 비례하여 산화 신호(anodic peaks; (Ip)a)와 환원 신호(cathodic peaks; (Ip)c)가 0.01~0.2 V/s의 범위에서 선형성(linearly)이 나오는 것을 확인 할 수있었다(Fig. 2(a) insert).
- 22) 반면에 Fe(CN)5-aminopyridine은 합성된 피리딘기의 1차아민이 PEGDGE의 알데하이드 기와 반응하여 효소와금 나노 입자들과 함께 전극에 단단히 고정되어 물질과 전극간의 전자전달반응이 원활해지며 신호의 세기가 좋아지고 민감도 또한 증가되는 결과를 가져왔다. 또한 포도당의 정량적 측정을 위한 검출 한계(detection limit)는 0.05 mM 이었고, 이는 다른 전극으로 5회 실험하여 반복적인 재현성(reproducibility )을 얻을 수 있었다(N = 5).
- 먼저 순환 전압 전류법의 결과로 Fe(CN)5-aminopyridine이 Ag/AgCl 기준전극 (0.0 Volt)에 대하여 0.141 V에서 전위 값(E1/2)이 나오게 되고, 주사 속도 (scan-rate)에 따른 순환 전압 전류법의 그래프를 보면 정상 상태(Steady-state)의 산화/환원이 일어남을 확인 할수 있다(Fig. 2(a)).
- 5). 반면에 산화환원 매개체로써 널리 사용되는 Fe(CN)6는 ITO전극 위에 금 나노 입자를 섞지 않고 제작한 전극의 경우 당의 유무에 따라 감응하여 산화촉매전류가 나타나긴 했지만 다소 민감도가 떨어져 농도별로 신호가 증가하는 것을 관찰할 수 없었고, 금 나노입자를 혼합하여 고정시킨 전극의 경우에도 약간의 전류밀도가 증가함은 보였지만 포도당의 농도 별 전류밀도의 재현성이 없어 오히려 금 나노 입자가 제 역할을 제대로 하지 못하는 것으로 보였다(Fig. 5).
- 본 논문에서 산화/환원 매개체로 사용한 Fe(CN)5 -aminopyridine 물질은 포도당의 농도 (10 mM)에 따른 촉매 전류밀도(current density)가 약 4000 µA/cm2가 나오는 것을 알 수 있었고 (Fig. 4), 이는 금 나노 입자가 포함되지 않은 전극에 비 해 약 2배 이상의 높은 전류밀도가 발생함을 알 수 있었다(Fig. 5).
- 또한 신호의 증폭을 위해금 나노 입자에 1차 아민을 결합시켜 전극 위에 산화/환원 매개체, 효소를 함께 가교제인 PEGDGE를 이용하여 고정화 시켰다. 제작된 효소전극은 포도당의 농도 별산화 촉매 전류가 금 나노 입자가 없을 때보다 2배 이상 증폭됨을 알 수 있었고, 기존의 혈당 센서의 산화/환원 매개체인 Fe(CN)6보다 선택성과 민감성 그리고 안정성이 우수함을 알 수 있었다. 이는 고성능의 혈당 센서의 개발에 응용될 수 있을 것이라 예상된다.
- 본 논문에서는 이러한 점을 착안하여 금 나노 입자에 1차 아민기를 형성하고, 합성된 페레이트 화합물, 당 탈 수소 효소를 가교제(cross-linker)인 PEGDGE (poly(ethylene glycol) diglycidyl ether)를 이용하여 ITO (Indium tin oxide) 전극 위에 상온에서 고정하였다. 제작한 효소전극은 포도당의 농도에 따라 감응하며 높은 전류 밀도와 효소와의 좋은 선택성을 보이고, 높은 안정성을 나타내었다. 이를 통해 좀 더 개선된 혈당 센서에 관한 연구 결과를 확인 할 수 있었다.
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