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문제 정의
- 그러나 소화효소 능력이 곤충 자체에서 유래되었는지 아니면 공생 미생물에 의존적인지에 대해서는 불분명하다. 본 연구는 아메리카동애등에의 세 종류 장내세균을 동정하고, 이들의 소화효소 활성을 각각 분석하였다. 더욱이 이들의 상대 빈도를 분석하였기에 이들의 동애등에 소화력에 미치는 영향을 이해할 수 있게 되었다.
- 장내 세균의 동정은 소화관 즙액을 추출하고, 이를 16S rDNA 서열 기반 메타게놈 방식으로 진행하되 다시 동일한 소화관 추출액을 영양배지에 도말하여 상이한 균총을 얻고 이를 탄소원 이용원 차이에 기반을 둔 미생물동정장치로 동정하였다. 본 연구는 아메리카동애등에의 소화관에서 상이한 3종의 세균을 보고하고 이들에 대해서 소화효소 활성 및 항생 능력을 비교 분석하였다.
- 특별히 이들 유전자의 발현과 동애등에의 발육은 관련성이 높은 것으로 나타내고 있다. 여기에 본 연구는 동애등에의 장내 서식하는 세균류를 분석하여 동애등에의 소화능력에 대한 이해를 넓히고자 수행되었다. 장내 세균의 동정은 소화관 즙액을 추출하고, 이를 16S rDNA 서열 기반 메타게놈 방식으로 진행하되 다시 동일한 소화관 추출액을 영양배지에 도말하여 상이한 균총을 얻고 이를 탄소원 이용원 차이에 기반을 둔 미생물동정장치로 동정하였다.
제안 방법
- (1989)의 게놈 DNA 추출법을 이용하였다. 16S rDNA 부위는 27F (AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)와 1492R (GGTTACCTTGTTACGACTT)의 두 프라이머 (Yeom et al., 2012)를 이용하여 증폭하였다. PCR 조건은 35 회 증폭 주기로 실시되었으며, 각 주기는 94℃ 변성, 55℃ 재생 및 72℃ 사슬연장의 반응 순서로 구성되었다.
- 항생제 내성 분석은 Ji and Kim (2004)의 방법을 변형한 방법으로 장내세균증식 억제유무에 따라 결정하였다. 4 종류의 항생제(ampicillin, kanamycin, tetracycline, streptomycin sulfate (Sigma-Aldrich, 미국내 도시 등)를 멸균수를 이용하여 각각 1, 10, 102, 103, 105, 107 ppm 농도로 조제하여 직경 6 mm의 멸균한 원형 여과지에 20 ㎕씩 분주하였다. 처리된 여과지를 동애등에 장내 세균(2 × 106 cfu/plate)이 각각 도말된 NA 배지에 올린 후 48 시간 동안 28℃에서 배양한 후 여과지 주변의 세균 성 장 억제 유무를 관찰하였다.
- coli 성장을 이용하였고, 이 세균의 성장은 37℃에서 동일한 방법으로 조사하였다. 각 처리 농도는 3 반복으로 실시하였다.
- NA 배지에서 자란 균총들 가운데 형태가 상이한 3종류의 세균을 대상으로 Bensen (1990)의 방법으로 그람염색을 하였다. 그램 염색후 균의 종 동정을 위해 각각의 단일 균총의 균을 멸균된 면봉을 이용하여 현탁액을 만들어 탁도계(Biolog, Hayward, CA, USA)를 사용하여 농도를 측정하였으며, 그 농도는 그람 음성균인 I, II 균은 탁도의 범위가 50~60, 그람음성균인 III 균은 탁도의 범위가 20~30 사이였다. 농도가 측정된 현탁액 중그람양성 균은 GP microplate, 그람음성균은 GN microplate 에 각각 접종하여 30℃에 20 시간 배양시킨 후 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 그램 염색후 균의 종 동정을 위해 각각의 단일 균총의 균을 멸균된 면봉을 이용하여 현탁액을 만들어 탁도계(Biolog, Hayward, CA, USA)를 사용하여 농도를 측정하였으며, 그 농도는 그람 음성균인 I, II 균은 탁도의 범위가 50~60, 그람음성균인 III 균은 탁도의 범위가 20~30 사이였다. 농도가 측정된 현탁액 중그람양성 균은 GP microplate, 그람음성균은 GN microplate 에 각각 접종하여 30℃에 20 시간 배양시킨 후 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 얻어진 흡광도 자료는 MicroLog 4.
- 다른 방법으로 장내세균을 포괄적으로 동정하기 위해서 16S rDNA 염기서열을 바탕으로 장내세균을 동정하였다. 이 방법은 메타게놈 방식을 취하여 장내세균 전체를 대상으로 16S rDNA를 증폭시켰다.
- 5% agar로 구성되었다. 동애등에 장내세균을 각 검정배지에 접종하고 28℃에서 24시간동안 배양한 다음 단백질 분해효소 유무는 투명대를 나타내는지 확인하고, 섬유소 분해효소 분비/생산 유무는 0.1% Congo red로 염색시킨 다음 1 M NaCl로 세척 후 균총 주변의 감귤색 halo를 나타내는지 확인하였고, 아밀레이즈 분해효소 유무는 2% Lugol 용액을 뿌린 후 곧바로 균총 주변의 투명대를 형성하는지 확인하였다. 지질 분해효소 생산 유무는 불용성 침전물이 생기는 지를 확인하였다.
-
아메리카동애등에 장내세균 동정
동애등에에 존재하는 장내세균은 두 가지 방법으로 세균 동정을 실시하였다. 첫째로 미생물동정장치인 Biolog를 이용하여 생화학적 특성에 바탕을 둔 동정을 실시하였다.
- 동정된 세 장내세균에 대해서 항생제 내성 및 항균활성 분석이 실시되었다. 세 세균 모두는 분석된 모든 항생제에 대해서 높은 내성을 보였다.
- 미생물동정장치로 동정된 세 종의 세균에 대해서 항생제 내성 분석이 실시되었다. 세 세균 모두는 분석된 4 가지 항생제에 대해서 내성을 나타냈다(Table 3).
- 형질전환된 균총 가운데 임의로 20개를 선발하여 바이오니어 사(Daejon, Korea)의 제한효소인 Alu I과 Msp I으로 절편 다형을 보이는 균주를 선발하였다. 선발된 상이한 균주의 16S rDNA 염기서열은 마크로젠(Seoul, Korea)에 의뢰하여 DNA 서열을 분석하였다. 세균의 동정은 벡터 서열을 제거한 16S rDNA 서열로 정리한 후 GenBank (www.
- 세 종류의 동애등에 세균에 대해서 동식물 병원미생물에 대한 항균 활성을 분석하였다(Table 4). 이들 세 종류 중 P, rettgeri는 그람양성균인 P.
- 선발된 상이한 균주의 16S rDNA 염기서열은 마크로젠(Seoul, Korea)에 의뢰하여 DNA 서열을 분석하였다. 세균의 동정은 벡터 서열을 제거한 16S rDNA 서열로 정리한 후 GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov)의 BlastN 검색엔진의 유사도 분석을 통해 수행하였다.
- 4)에서 소화관을 분리하였다. 소화관은 전체, 전장+중장 및 후장으로 나누어 길이를 측정하였다. 후장의 시작은 말피기관의 기부로 판정하였다.
- 우선 동애등에 세균(5 × 108 cfu/mL)을 직경 6 mm의 멸균된 원형 여과지에 20 ㎕씩 분주하고 28℃에서 48 시간동안 NA 배지 상에서 배양시켰다. 여과지에 자란 세균을 chloroform으로 1시간 동안 훈증시켜 살균하여 이 세균이 분비한 항생물질의 항균력 효과만 분석하게 하였다. 억제 대상 세균 3 종(Ralstonia solanacearum, Serratia marscens, Paenibacillus polymixa)의 세균현탁액(3 × 108 cfu/mL) 0.
- 이 방법은 메타게놈 방식을 취하여 장내세균 전체를 대상으로 16S rDNA를 증폭시켰다. 이 PCR 결과 얻은 16S rDNA를 제한효소로 잘라 단편 다형을 기준으로 상이한 16S rDNA를 선발하고, 이들을 염기서열 분석하였다(Table 2). 이 결과 5 가지 서로 다른 세균(Proteus mirabilis, Morganella morganii, Providencia rettgeri, Providencia alcalifaciens, Providencia sp.
- 처리된 여과지를 동애등에 장내 세균(2 × 106 cfu/plate)이 각각 도말된 NA 배지에 올린 후 48 시간 동안 28℃에서 배양한 후 여과지 주변의 세균 성 장 억제 유무를 관찰하였다. 이때 항생제의 억제 능력을 판별하기 위한 대조 세균으로 E. coli 성장을 이용하였고, 이 세균의 성장은 37℃에서 동일한 방법으로 조사하였다. 각 처리 농도는 3 반복으로 실시하였다.
- 7% 물한천4 mL와 혼합하였다. 이후 세균 한천액과 곰팡이 한천액을 훈증처리된 동애등에 세균 여과지 위에 올리고 28℃ (대조구 E. coli는 37℃)에서 48 시간 동안 배양 후 여과지 주변으로 세균 또는 곰팡이 균사 성장 억제 유무를 관찰하였다.
- 여기에 본 연구는 동애등에의 장내 서식하는 세균류를 분석하여 동애등에의 소화능력에 대한 이해를 넓히고자 수행되었다. 장내 세균의 동정은 소화관 즙액을 추출하고, 이를 16S rDNA 서열 기반 메타게놈 방식으로 진행하되 다시 동일한 소화관 추출액을 영양배지에 도말하여 상이한 균총을 얻고 이를 탄소원 이용원 차이에 기반을 둔 미생물동정장치로 동정하였다. 본 연구는 아메리카동애등에의 소화관에서 상이한 3종의 세균을 보고하고 이들에 대해서 소화효소 활성 및 항생 능력을 비교 분석하였다.
- 장내세균을 분석하기에 앞서 본 연구는 아메리카동애등에의 소화관 구조를 분석했다. 소화관 전체의 길이는 몸 체장에 약 7배를 이루는 구조를 나타냈다.
- 장내세균의 항균력은 Ji et al. (2004)의 방법을 변형하여 분석하였다. 우선 동애등에 세균(5 × 108 cfu/mL)을 직경 6 mm의 멸균된 원형 여과지에 20 ㎕씩 분주하고 28℃에서 48 시간동안 NA 배지 상에서 배양시켰다.
- 종령 유충의 동애등에 소화관을 적출하여 부위별로 크기와 세균을 분석하였다(Fig. 1). 소화관은 체강에 여러 겹으로 접혀 있는 모습으로 존재했다.
- PCR 조건은 35 회 증폭 주기로 실시되었으며, 각 주기는 94℃ 변성, 55℃ 재생 및 72℃ 사슬연장의 반응 순서로 구성되었다. 증폭된 결과물은 PCR2.1 cloning vector (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에 TA 클로닝시킨 후 Escherichia coli Top10 균주세포에 형질전환시켰다. 형질전환된 균총 가운데 임의로 20개를 선발하여 바이오니어 사(Daejon, Korea)의 제한효소인 Alu I과 Msp I으로 절편 다형을 보이는 균주를 선발하였다.
- 1% Congo red로 염색시킨 다음 1 M NaCl로 세척 후 균총 주변의 감귤색 halo를 나타내는지 확인하였고, 아밀레이즈 분해효소 유무는 2% Lugol 용액을 뿌린 후 곧바로 균총 주변의 투명대를 형성하는지 확인하였다. 지질 분해효소 생산 유무는 불용성 침전물이 생기는 지를 확인하였다.
- 처리된 여과지를 동애등에 장내 세균(2 × 106 cfu/plate)이 각각 도말된 NA 배지에 올린 후 48 시간 동안 28℃에서 배양한 후 여과지 주변의 세균 성 장 억제 유무를 관찰하였다.
- 동애등에에 존재하는 장내세균은 두 가지 방법으로 세균 동정을 실시하였다. 첫째로 미생물동정장치인 Biolog를 이용하여 생화학적 특성에 바탕을 둔 동정을 실시하였다. 여기에는 3 가지 상이한 장내세균을 대상으로 동정을 실시하였다(Table 1).
- 항생제 내성 분석은 Ji and Kim (2004)의 방법을 변형한 방법으로 장내세균증식 억제유무에 따라 결정하였다. 4 종류의 항생제(ampicillin, kanamycin, tetracycline, streptomycin sulfate (Sigma-Aldrich, 미국내 도시 등)를 멸균수를 이용하여 각각 1, 10, 102, 103, 105, 107 ppm 농도로 조제하여 직경 6 mm의 멸균한 원형 여과지에 20 ㎕씩 분주하였다.
대상 데이터
- 국내 산업용으로 응용되고 있는 아메리카동애등에에 대해서 발현유전체를 분석하였다(Park et al., 2013). 면역, 스트레스 및 소화와 관련된 다수의 유전자를 동애등에 전사체에서 찾을 수 있었다.
- 동애등에 종령 유충을 선발하여 체장을 측정하였다. 이후 체표면을 70% 에탄올로 표면 살균한 후 멸균된 인산완충용액 (PBS: 100 mM phosphate, 0.
- 소화관 추출물의 원액을 NA 배지에 도말하여 얻은 세균 단일 층을 루프로 수거하여 게놈 DNA 추출에 사용하였다. DNA 추출은 Sambrook et al.
- 시험곤충은 공주시 정안면의 그린테코에서 얻은 유충을 분양받아 돼지사료(Nonghyup Livestock Grains, Seoul)를 먹이로 유충 성장을 유지시켰다.
- 아메리카동애등에의 광식성을 이해하고자 이 곤충이 갖는 장내세균의 효소활성 분석이 본 연구에서 분리된 세 종류의 장내세균류를 대상으로 분석되었다(Table 5). 세 종류의 세균은 서로 소화효소 활성에 차이를 나타냈다.
- (2011)의 방법을 따라 조사하였다. 아밀레이즈 분해효소 검정 배지는 0.3% beet extract (BD Difco, Sparks, Maryland, USA), 2% soluble starch (Katayama Chemical, Osaka, Japan), 0.5% peptone, 0.5% NaCl, 1.5% agar (Duksan Pure Chemicals, Ansan, Korea)로 구성되었다. 지질 분해효소 검정배지는 1% Tween 80 (Daejung-Hwakeum, Siheung, Korea), 1% peptone, 0.
- 억제 대상 곰팡이 2 종(Phytophthora capsici, Colletotrichum capsici)의 포자 용액(5 × 107 spores/mL) 0.2 mL을 0.7% 물한천4 mL와 혼합하였다.
- 억제 대상 세균 3 종(Ralstonia solanacearum, Serratia marscens, Paenibacillus polymixa)의 세균현탁액(3 × 108 cfu/mL) 0.2 mL을 각각 45℃의 0.7% 물한천 4 mL와 혼합하였다.
- 5% agar (Duksan Pure Chemicals, Ansan, Korea)로 구성되었다. 지질 분해효소 검정배지는 1% Tween 80 (Daejung-Hwakeum, Siheung, Korea), 1% peptone, 0.5% NaCl, 0.01% CaCl2 (Junsei Chemical, Tokyo, Japan), 1% agar로 구성되었다. 섬유소 분해효소 검정배지는 1% sodium carboxymethyl cellulose, 1% tryptone (MBcell, Seoul, Korea), 0.
- 1 cloning vector (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에 TA 클로닝시킨 후 Escherichia coli Top10 균주세포에 형질전환시켰다. 형질전환된 균총 가운데 임의로 20개를 선발하여 바이오니어 사(Daejon, Korea)의 제한효소인 Alu I과 Msp I으로 절편 다형을 보이는 균주를 선발하였다. 선발된 상이한 균주의 16S rDNA 염기서열은 마크로젠(Seoul, Korea)에 의뢰하여 DNA 서열을 분석하였다.
이론/모형
- NA 배지에서 자란 균총들 가운데 형태가 상이한 3종류의 세균을 대상으로 Bensen (1990)의 방법으로 그람염색을 하였다.
- 소화관 추출물의 원액을 NA 배지에 도말하여 얻은 세균 단일 층을 루프로 수거하여 게놈 DNA 추출에 사용하였다. DNA 추출은 Sambrook et al. (1989)의 게놈 DNA 추출법을 이용하였다. 16S rDNA 부위는 27F (AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)와 1492R (GGTTACCTTGTTACGACTT)의 두 프라이머 (Yeom et al.
- 장내세균의 영양소에 따른 소화효소 생산능력은 Jeon et al. (2011)의 방법을 따라 조사하였다. 아밀레이즈 분해효소 검정 배지는 0.
성능/효과
- 여기에는 3 가지 상이한 장내세균을 대상으로 동정을 실시하였다(Table 1). Biolog 동정 결과 I형 균주는 Morganella morganii, II형 균주는 Providencia rettgeri, 그리고 III형 균주는 Bacillus halodurans로 각각 동정되었다.
- I과 II균주가 우점종을 이루며 소화관에 분포하지만, 이 가운데 I균주가 후장에 더많이 분포하는 것으로(X2 = 147.6; df = 2; P < 0.0001) 나타났다(Fig. 1D).
- , 1998; Watanabe and Sato, 1998) 타 세균으로부터 항생제 내성 유전자의 획득에 기인하였을 것으로 사료된다. M. morganii와 P. rettgeri는 모두 그람양성균에 대한 항균활성을 나타냈고, M. morganii는 더불어 그람음성균에 대한 항균활성과 진균활성을 모두 보였다. 일반적으로 공생 미생물의 기주에 대한 공헌도는 난분해 물질의 소화를 통한 영양물질 제공 뿐만 아니라 해로운 미생물의 증식을 억제하는 역할을 담당한다(Berg, 1996).
- 결론적으로 본 연구 결과는 아메리카동애등에가 소화관에 유용한 기능을 하는 세균을 함유하고 있다고 제시하고 있다. 추후 이러한 세균들과 동애등에 사이에 공생관계를 밝히는 기능적 연구가 진행되어야 한다.
- rettgeri에서 나타났다. 그러나 섬유소 분해효소 능력은 M. morganii에서만, 지질 분해효소활성은 B. halodurans 에서만, 단백질 분해효소 활성은 P. rettgeri에서만 관찰되었다.
- 세 세균 모두는 분석된 4 가지 항생제에 대해서 내성을 나타냈다(Table 3). 대조구로서 사용된 E. coli는 tetracycline을 제외하고 조사된 모든 항생제에서 최소 농도인 1 ppm을 견디지 못하는 반면, 동애등에 장내분리 세균은 모두최소한 105 ppm 또는 심지어 107 ppm 이상의 최소억제 농도를 나타냈다. 세 균주 가운데 주요 세균류인 M.
- (2011)은 이와 유사한 전략을 세우고 아메리카동애등에의 소화관에 서식하는 세균을 분석하였다. 먹이 조건에 따라 상이한 세균 종수가 검출되었으나 최대 9,293 종이 검출되었다. 이러한 다양한 세균이 아메리카동애등에에 존재한다는 사실은 최근에 이 소화관 서식 세균 가운데에서 Paenalcaligenes hermetiae 라는 신종의 보고를 가능하게 하였다(Lee et al.
- , 2013). 먹이 조건에 따라 장내세균의 종류가 크게 달라지지만 공통적으로 포함된 36 종의 주요 세균 종집단에는 본 연구에서 동정된 M. morganii와 P. rettgeri가 포함되었으나, 본 연구와 달리 차세대 염기서열 방식으로 분석된 세균 종 다양성에서는 이들 두 세균이 우점종은 아니었다. 이러한 차이는 아마도 본 연구의 동정이 영양배지에서 자라는 세균에서 선발하였기에 소화관 내의 밀도를 대변하기에는 무리가 있었을 것으로 사료된다.
- coli는 tetracycline을 제외하고 조사된 모든 항생제에서 최소 농도인 1 ppm을 견디지 못하는 반면, 동애등에 장내분리 세균은 모두최소한 105 ppm 또는 심지어 107 ppm 이상의 최소억제 농도를 나타냈다. 세 균주 가운데 주요 세균류인 M. morganii와 P. rettgeri가 B. halodurans에 비해 높은 항생제 내성을 나타내는 것으로 나타났다.
- 동정된 세 장내세균에 대해서 항생제 내성 및 항균활성 분석이 실시되었다. 세 세균 모두는 분석된 모든 항생제에 대해서 높은 내성을 보였다. 이들 장내세균의 높은 항생제 내성은 다양한 먹이원에서 비롯되는 화학물질에 대한 내성으로 해석되고 이는 이들이 장내 서식하는 데 필수적 생리 현상으로 고려될 수 있다(Basset et al.
- 아메리카동애등에의 소화관에는 최소 6종류의 배양 가능한 세균이 존재하는 것으로 본 연구에서 조사되었다 생화학적 분석에 기반을 둔 미생물동정장치 Biolog 는 M. morganii, P. rettgeri, B. halodurans를 동정하였고, 16S rDNA에 기반을 둔 동정 결과는 이들 세균 외에 Proteus mirabilis, P. alcalifaciens, Providencia sp.을 추가하였다.
- 이 PCR 결과 얻은 16S rDNA를 제한효소로 잘라 단편 다형을 기준으로 상이한 16S rDNA를 선발하고, 이들을 염기서열 분석하였다(Table 2). 이 결과 5 가지 서로 다른 세균(Proteus mirabilis, Morganella morganii, Providencia rettgeri, Providencia alcalifaciens, Providencia sp.)이 동정되었다. 즉, Biolog에서 동정된 두 가지 주요 세균이 16S rDNA 동정에서도 검출되었다.
- 세 종류의 동애등에 세균에 대해서 동식물 병원미생물에 대한 항균 활성을 분석하였다(Table 4). 이들 세 종류 중 P, rettgeri는 그람양성균인 P. polymyxa에 대해서만 항균활성을 보인 반면, M. morganii는 그람양성균(P. polymyxa), 그람음성균(E. coli) 및 곰팡이(Phytophthora capsici)에 대해서도 진균 활성을 보였다.
- 소화관은 체강에 여러 겹으로 접혀 있는 모습으로 존재했다. 이를 적출하여 관찰하여 본 결과 소화 관의 길이는 몸 길이(10 mm)의 약 7배(약 71 mm)에 달하였다 (Fig. 1A). 일반적으로 음식물을 보관하는 전장은 중장에 비해 직경이 더 큰 모습을 나타냈고, 중장과 후장 사이에는 말피기관이 연결되어 있었다.
- 전체 소화관의 세균 밀도는 개체 당 5.0 × 10⁶ cfu, 전장과 중장에 9.4 × 10⁴cfu로 전체 소화관 세균 가운데 1.9%를 차지하며, 후장에서는 3.3 × 10⁶ cfu로 전체의 98.1% 세균 밀도를 차지했다(Fig. 1C).
- )이 동정되었다. 즉, Biolog에서 동정된 두 가지 주요 세균이 16S rDNA 동정에서도 검출되었다.
후속연구
- 따라서 아메리카동애등에 장내세균의 항생능력은 기주 곤충을 감염시키는 곤충병원성 미생물의 정착 및 증식을 억제하는 데 중요한 방어 역할을 담당할 것으로 사료된다. 그러나 아메리카동애등에 소화관에서 분리된 세균들이 모두 기주와 공생관계를 갖는 지에 대해서는 본 연구로서 정확히 규명하기 어렵다. 일반적으로 곤충과 세균 사이에 공생관계는 편리공생(commensalism)과 상생공생(mutualism) 으로 나눌 수 있다.
- 결론적으로 본 연구 결과는 아메리카동애등에가 소화관에 유용한 기능을 하는 세균을 함유하고 있다고 제시하고 있다. 추후 이러한 세균들과 동애등에 사이에 공생관계를 밝히는 기능적 연구가 진행되어야 한다.
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