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제안 방법
- 귀 두께는 DNFB로 자극한 24시간 뒤에 digital caliper(Control Company, Friendsweed, TX, USA)를 이용하여 측정하였다. 4주 후에 mouse를 희생시켜 림프 노드와 비장(spleen)의 무게를 측정하고 귀 조직을 갈아서 원심분리 한 다음 상층액을 이용하여 사이토카인의 생산량을 측정하였으며, 혈청 속의 IgE 농도는 심장 채혈하여 원심분리 한 다음 측정하였다(16).
- Acetone-olive oil(3:1) 용액 내 25 μL의 0.15% DNFB를 4주 동안 1주에 한 번씩 mouse의 귀에 발라 주었고 S.F는 3일에 한 번씩 mouse의 귀에 발라 주었다.
- Mouse는 6주령 암컷 BALB/c mouse를 이용하였다. Acetone-olive oil(3:1)을 처리한 군(normal)과 DNFB를 처리한 군, DNFB를 처리하고 S.F(50 mg/kg)를 구강 투여한 군, DNFB를 처리하고 S.F(50 mg/kg)를 귀에 바른(painting) 군 및 DNFB를 처리하고 항염제인 dexamethasone(2.5 mg/kg)을 복강 주사한 군 등 5개 군으로 나누어 실시하였으며, 한 군당 mouse를 5마리씩 실험에 사용하였다. Acetone-olive oil(3:1) 용액 내 25 μL의 0.
- BALB/c mice (n=5) were sensitized with 25 μL of 0.15% DNFB in acetone-olive oil (3:1) or vehicle alone, and applied to the ear lobes once every week for total of 4 weeks.
- S.F를 농도별로 처리한 후 24시간 동안 반응시킨 다음 배양액을 제거한 뒤 0.5 mg/mL의 MTT를 각 well에 넣고 37°C 배양기에서 2시간 배양한 후 상등액를 제거하고, DMSO를 100 μL씩 분주하여 충분히 섞은 후 micro plate reader(Molecular Devices Corp., Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 550 nm에서 흡광도를 측정하여 평균값과 표준편차를 구하였다.
- 건조된 괴화를 분쇄한 후 중량 10배의 70% 에탄올로 48시간 동안 3회에 걸쳐 추출하였다. 추출물을 지름 110 mm 종이 여과지(Whatman, Maidstone, UK)를 이용하여 감압 여과 하였다.
- F는 3일에 한 번씩 mouse의 귀에 발라 주었다. 귀 두께는 DNFB로 자극한 24시간 뒤에 digital caliper(Control Company, Friendsweed, TX, USA)를 이용하여 측정하였다. 4주 후에 mouse를 희생시켜 림프 노드와 비장(spleen)의 무게를 측정하고 귀 조직을 갈아서 원심분리 한 다음 상층액을 이용하여 사이토카인의 생산량을 측정하였으며, 혈청 속의 IgE 농도는 심장 채혈하여 원심분리 한 다음 측정하였다(16).
- 본 연구에서는 비만세포에 Ca++ ionophore인 A23187의 자극을 통하여 Ca++ 유입에 의해 활성화된 비만세포에서 괴화 에탄올 추출물(S.F)에 의한 비만세포 활성 억제를 확인하고 in vivo 알레르기 모델에서 괴화의 70% 에탄올 추출물의 알레르기 저해 효과를 확인하였다.
- 추출물을 지름 110 mm 종이 여과지(Whatman, Maidstone, UK)를 이용하여 감압 여과 하였다. 여과액을 감압농축기(Eyela, Tokyo, Japan)를 사용하여 농축한 다음, 동결건조기(Matsushita, Tokyo, Japan)로 동결건조 하여 분말을 얻어 DMSO에 녹여 실험에 사용하였다.
- 즉시형 알레르기 반응의 지표인 탈과립에 대한 억제 효과를 분석하기 위하여 β-hexosaminidase의 분비를 측정하였다.
- 건조된 괴화를 분쇄한 후 중량 10배의 70% 에탄올로 48시간 동안 3회에 걸쳐 추출하였다. 추출물을 지름 110 mm 종이 여과지(Whatman, Maidstone, UK)를 이용하여 감압 여과 하였다. 여과액을 감압농축기(Eyela, Tokyo, Japan)를 사용하여 농축한 다음, 동결건조기(Matsushita, Tokyo, Japan)로 동결건조 하여 분말을 얻어 DMSO에 녹여 실험에 사용하였다.
대상 데이터
- Mouse는 6주령 암컷 BALB/c mouse를 이용하였다. Acetone-olive oil(3:1)을 처리한 군(normal)과 DNFB를 처리한 군, DNFB를 처리하고 S.
- RBL-2H3(rat basophilic leukemia cell line)은 ATCC(Rockville, MD, USA)에서 분양받아 실험하였다. 세포의 배양은 15% heat-inactivated FBS와 1% penicillin 및 streptomycin을 포함한 MEM 배지에서 배양하였다.
- 세포배양에 사용되는 minimum essential media(MEM), penicillin 및 streptomycin, 0.5% trypsin-EDTA solution, phosphate buffered saline(PBS), fetal bovine serum(FBS)은 Gibco(Grand Island, NY, USA)에서 구입하였다. MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide), dexamethasone, A23187은 모두 Sigma-Aldrich Co.
- 실험에 사용된 mouse는 BALB/c계를 오리엔트 바이오(Gapyung, Korea)에서 구입하여 실험에 사용하였다. 사육은 표준 환경(온도 22±2°C, 습도 55±5%, 37°C)에서 자유 급식과 음수를 제공하였으며, 모든 동물 실험은 건국대학교 실험동물 윤리위원회의 기준에 의거하여 실시하였다.
데이터처리
- 실험은 mean±standard error of mean(SEM)을 통해 나타냈다. 각 그룹간의 통계적 차이는 one-way ANOVA를 통한 Dunnett test를 통해서 나타냈다. P 값은 <0.
이론/모형
- Ear homogenate cytokines IL-4 (A), TNF-α (B), IFN-γ (C) levels and serum IgE level (D) in the indicated groups were measured using ELISA method.
- S.F가 RBL-2H3 세포의 생존 및 증식에 미치는 영향을 알아보기 위하여 MTT법을 사용하였다. RBL-2H3 세포를 15% FBS를 포함한 MEM에 현탁시킨 후 96 well plate(SPL, Anyang, Korea)에 1×104 cells/mL의 세포수가 되도록 분주하여 37°C, 5% CO2 배양기(Sanyo, Osaka, Japan)에서 12시간 배양하였다.
- 실험은 mean±standard error of mean(SEM)을 통해 나타냈다.
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