검정콩 껍질 유래 안토시아닌의 RBL-2H3 세포에서 탈과립화와 사이토카인 생성 저해 효과 Inhibitory Effects of Anthocyanins Isolated from Black Soybean (Glycine max L.) Seed Coat on Degranulation and Cytokine Generation in RBL-2H3 Cells원문보기
안토시아닌(anthocyanins)은 플라보노이드에 속하고 항산화 활성들을 포함한 그들의 다양한 건강 유익성에 대해 알려져 있다. 그들 중 검정콩 껍질에서 분리한 주요 안토시아닌은 glycopyranose를 함유하고 있는 배당체이다. 천식은 호염기성 세포(basophils)와 비만세포(mast cells)를 포함한 다양한 면역세포와 관련된 알레르기 관련 질병이다. 호산구(eosinophils), 호염기성 세포, 비만세포는 탈과립화에 의한 천식-특이적 보조 2(T-helper 2) 사이토카인 분비 그리고 계속해서 일어나는 증폭과 같은 염증을 일으키는 매개체의 증가를 통해 알레르기 천식(allergic asthma)에서 중요한 역할을 한다. 흰쥐 호염기성 백혈병(rat basophilic leukemia) RBL-2H3 세포는 알레르기 반응을 측정하기 위해 가장 일반적으로 사용되는 in vitro 모델이다. 본 연구에서는 검정콩 껍질 안토시아닌이 항원으로 자극한 RBL-2H3 세포에서 탈 과립 그리고 Th2 사이토카인 생산에 미치는 효과를 조사하였다. 세포 탈과립은 ${\beta}$-hexosaminidase의 방출을 검출함으로써 평가하였다. IgE-항원 복합체로 자극한 RBL-2H3 세포내 ${\beta}$-hexosaminidase 방출과 Th2 사이토카인 생산이 무처리군의 그것과 비교하여 더 높았다. 안토시아닌은 RBL-2H3 세포의 IgE-항원 복합체 유도 탈과립을 현저하게 억제시켰고 RBL-2H3 세포내 IgE-항원 복합체-매개체 interleukin(IL)-4, IL-13 그리고 TNF-${\alpha}$ 생산을 저해하였다. 이러한 결과는 검정콩 껍질 유래 안토시아닌이 알레르기 반응(allergic reaction)을 현저히 저해하는 효과가 있음을 보였고, 이들 안토시아닌이 향후 알레르기 천식을 억제하거나 개선하는데 유용한 물질로 사용될 가능성이 있을 것으로 판단되었다.
안토시아닌(anthocyanins)은 플라보노이드에 속하고 항산화 활성들을 포함한 그들의 다양한 건강 유익성에 대해 알려져 있다. 그들 중 검정콩 껍질에서 분리한 주요 안토시아닌은 glycopyranose를 함유하고 있는 배당체이다. 천식은 호염기성 세포(basophils)와 비만세포(mast cells)를 포함한 다양한 면역세포와 관련된 알레르기 관련 질병이다. 호산구(eosinophils), 호염기성 세포, 비만세포는 탈과립화에 의한 천식-특이적 보조 2(T-helper 2) 사이토카인 분비 그리고 계속해서 일어나는 증폭과 같은 염증을 일으키는 매개체의 증가를 통해 알레르기 천식(allergic asthma)에서 중요한 역할을 한다. 흰쥐 호염기성 백혈병(rat basophilic leukemia) RBL-2H3 세포는 알레르기 반응을 측정하기 위해 가장 일반적으로 사용되는 in vitro 모델이다. 본 연구에서는 검정콩 껍질 안토시아닌이 항원으로 자극한 RBL-2H3 세포에서 탈 과립 그리고 Th2 사이토카인 생산에 미치는 효과를 조사하였다. 세포 탈과립은 ${\beta}$-hexosaminidase의 방출을 검출함으로써 평가하였다. IgE-항원 복합체로 자극한 RBL-2H3 세포내 ${\beta}$-hexosaminidase 방출과 Th2 사이토카인 생산이 무처리군의 그것과 비교하여 더 높았다. 안토시아닌은 RBL-2H3 세포의 IgE-항원 복합체 유도 탈과립을 현저하게 억제시켰고 RBL-2H3 세포내 IgE-항원 복합체-매개체 interleukin(IL)-4, IL-13 그리고 TNF-${\alpha}$ 생산을 저해하였다. 이러한 결과는 검정콩 껍질 유래 안토시아닌이 알레르기 반응(allergic reaction)을 현저히 저해하는 효과가 있음을 보였고, 이들 안토시아닌이 향후 알레르기 천식을 억제하거나 개선하는데 유용한 물질로 사용될 가능성이 있을 것으로 판단되었다.
Anthocyanins belong to a group of flavonoid compounds and are well known for their various health beneficial effects, which include antioxidative activities. Among them, the major anthocyanins isolated from seed coat of black soybean (Glycine max L.) were previously characterized as glycosides conta...
Anthocyanins belong to a group of flavonoid compounds and are well known for their various health beneficial effects, which include antioxidative activities. Among them, the major anthocyanins isolated from seed coat of black soybean (Glycine max L.) were previously characterized as glycosides containing glucopyranose. Asthma is an allergic disease that is strongly associated with various immune cells, including basophils and mast cells. Eosinophils, basophils, and mast cells play important roles in allergic asthma through the release of inflammatory mediators such as asthma-specific T-helper 2 (Th2) cytokines and subsequent amplification of asthma symptoms via degranulation. Rat basophilic leukemia RBL-2H3 cells are the most common in vitro models for evaluating allergic reactions. In this study, we examined the effects of anthocyanin from seed coat of black soybean on antigen-stimulated degranulation and Th2 cytokine production in RBL-2H3 cells. Cell degranulation was evaluated by measuring the release of ${\beta}$-hexosaminidase. ${\beta}$-Hexosaminidase release and Th2 cytokine production in RBL-2H3 cells was much higher upon stimulation with IgE-antigen complex than those in untreated control cells. Anthocyanins significantly suppressed IgE-antigen complex-induced degranulation of RBL-2H3 cells and inhibited IgE-antigen complex-mediated interleukin (IL)-4, IL-13, and tumor necrosis factor ${\alpha}$ (TNF-${\alpha}$) production in RBL-2H3 cells. These findings suggest that anthocyanins from seed coat of black soybean effectively inhibit allergic reactions and may have beneficial effects against allergic asthma.
Anthocyanins belong to a group of flavonoid compounds and are well known for their various health beneficial effects, which include antioxidative activities. Among them, the major anthocyanins isolated from seed coat of black soybean (Glycine max L.) were previously characterized as glycosides containing glucopyranose. Asthma is an allergic disease that is strongly associated with various immune cells, including basophils and mast cells. Eosinophils, basophils, and mast cells play important roles in allergic asthma through the release of inflammatory mediators such as asthma-specific T-helper 2 (Th2) cytokines and subsequent amplification of asthma symptoms via degranulation. Rat basophilic leukemia RBL-2H3 cells are the most common in vitro models for evaluating allergic reactions. In this study, we examined the effects of anthocyanin from seed coat of black soybean on antigen-stimulated degranulation and Th2 cytokine production in RBL-2H3 cells. Cell degranulation was evaluated by measuring the release of ${\beta}$-hexosaminidase. ${\beta}$-Hexosaminidase release and Th2 cytokine production in RBL-2H3 cells was much higher upon stimulation with IgE-antigen complex than those in untreated control cells. Anthocyanins significantly suppressed IgE-antigen complex-induced degranulation of RBL-2H3 cells and inhibited IgE-antigen complex-mediated interleukin (IL)-4, IL-13, and tumor necrosis factor ${\alpha}$ (TNF-${\alpha}$) production in RBL-2H3 cells. These findings suggest that anthocyanins from seed coat of black soybean effectively inhibit allergic reactions and may have beneficial effects against allergic asthma.
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문제 정의
따라서 본 연구에서는 검정콩 껍질에서 분리한 안토시아닌의 항알레르기 효과 및 분자생물학적 기전을 밝히기 위하여 IgE-항원 복합체 자극에 의해 활성화된 rat basophilic leukemia RBL-2H3 세포에서 탈과립화 및 천식관련 사이토카인(IL-4, IL-13 그리고 TNF-α) 발현 억제효과를 측정하여 항알레르기 효과와 관련 건강기능식품, 의약품 등에 검정콩 껍질에서 분리한 안토시아닌이 이용될 수 있을지 그 가능성을 살펴보고자 한다.
흰쥐 호염기성 백혈병(rat basophilic leukemia) RBL-2H3 세포는 알레르기 반응을 측정하기 위해 가장 일반적으로 사용되는 in vitro 모델이다. 본 연구에서는 검정콩 껍질 안토시아닌이 항원으로 자극한 RBL-2H3 세포에서 탈과립 그리고 Th2 사이토카인 생산에 미치는 효과를 조사하였다. 세포 탈과립은 β-hexosaminidase의 방출을 검출함으로써 평가하였다.
제안 방법
β-Hexosaminidase 방출 정도는 Huang 등(12)의 방법을 일부 변경하여 측정하였다.
24-well plates에서 배양한 RBL-2H3 세포에 TRIzol Reagent(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 0.5 mL씩 가하여 완전히 마쇄시킨 후 Invitrogen사에서 제공한 제품 사용설명서에 따라 RNA를 추출하였다. 본 연구에 First-stand cDNA를 생산하기 위하여 Power cDNA synthesis kits (Intron, Seongnam, Korea)와 oligo(dT)15 primer(500 μg/mL)를 이용하여 Intron사에서 제공한 제품 사용설명서에 따라 cDNA를 합성하였다.
DNP-IgE(0.5 μg/mL)를 함유한 배지로 24시간 배양하였고, Siraganian buffer(119 mM NaCl, 5 mM KCl, 25 mM PIPES, 5.6 mM glucose, 1 mM CaCl2, 0.4 mM MgCl2, 0.1% BSA, pH 7.2)로 3회 세척한 후 Siraganian buffer를 넣고 10분간 배양한 다음 0, 5, 10, 25 그리고 50 μg/mL의 anthocyanins이 함유된 MEM로 2시간 배양하였다.
DNP-IgE(0.5 μg/mL)를 함유한 배지로 24시간 배양하였고, Siraganian buffer(119 mM NaCl, 5 mM KCl, 25 mM PIPES, 5.6 mM glucose, 1 mM CaCl2, 0.4 mM MgCl2, 0.1% BSA, pH 7.2)로 3회 세척한 후 Siraganian buffer를 넣고 10분간 배양한 다음 0, 5, 10, 25 및 50 μg/mL의 안토시아닌이 함유된 MEM로 2시간 배양하였다.
TNF-α, IL-4 그리고 IL-13의 PCR 조건을 보면, 94℃에서 2분, 94℃에서 20초, 60℃에서 30초, 72℃에서 40초, 72℃에서 5분이었고, 내부 표준 유전자로 사용한 GAPDH의 annealing 온도는 55℃였다. PCR 산물은 0.002% ethidium bromide가 첨가된 2% agarose gel에 80 V에서 30시간 전기 영동 한 후 자외선 광으로 유전자 발현 정도를 알아보았다. 그 밴드의 강도를 SigmaGel(Jandel Scientific, San Rafael, CA, USA) 소프트웨어에 의해 분석 정량하였다.
PCR를 합성한 cDNA 1 μL와 각 primer 2 μL(forword와 reverse, 10 pmol/μL)를 Maxime PCR PreMix kit(Intron)에 더한 후 RNase-free water 17 μL를 넣어 최종부피 20 μL로 맞춘 후 PCR를 수행하였다.
각 plate를 10분간 ice bath에서 둠으로써 반응을 종결시켰고 상층액은 β-hexosaminidase 방출 정도를 확인하기 위해 사용하였으며 세포는 RT-PCR를 위한 시료로 사용하였다.
002% ethidium bromide가 첨가된 2% agarose gel에 80 V에서 30시간 전기 영동 한 후 자외선 광으로 유전자 발현 정도를 알아보았다. 그 밴드의 강도를 SigmaGel(Jandel Scientific, San Rafael, CA, USA) 소프트웨어에 의해 분석 정량하였다.
따라서 0, 5, 10, 25 및 50 μg/mL를 계속되는 실험에 사용하였다.
본 연구에 First-stand cDNA를 생산하기 위하여 Power cDNA synthesis kits (Intron, Seongnam, Korea)와 oligo(dT)15 primer(500 μg/mL)를 이용하여 Intron사에서 제공한 제품 사용설명서에 따라 cDNA를 합성하였다.
Cheongja 3] 껍질로부터 Lee 등(10)에 의해 서술된 방법을 사용하여 분리하였다. 분리된 안토시아닌은 cyanidin-3-O-glucoside(68.3 %), delphinidin-3-O-glucoside(25.2%) 및 petunidin-3-O-glucoside(6.5%)가 함유되어 있는 혼합물이고 그들의 순도와 조성은 HPLC로 분석하였다(10).
세포 내 활성 산소종(reactive oxygen species, ROS)의 양을 측정하는 방법으로 ROS 수준은 2',7'-dichlorofluorescin diacetate(DCFH-DA) probe를 이용하여 측정하였다.
세포 탈과립은 β-hexosaminidase의 방출을 검출함으로써 평가하였다.
대상 데이터
RBL-2H3세포는 Korea Cell Line Bank(Seoul, Korea)에서 구입하여 10% fetal bovine serum(Gibco-BRL, Grand Island, NY, USA)과 1% penicillin-streptomycin을 넣은 Eagle’s minimum essential medium(MEM; Gibco-BRL) 배양액으로 5% CO2가 공급되는 배양기에서 37℃ 조건으로 배양한다.
본 실험에 사용된 안토시아닌은 농촌진흥청국립식량과학원[National Institute of Crop Science(NICS)]에 의해 품종 개량한 검정콩[Glycine max(L.) Merr., cv. Cheongja 3] 껍질로부터 Lee 등(10)에 의해 서술된 방법을 사용하여 분리하였다. 분리된 안토시아닌은 cyanidin-3-O-glucoside(68.
데이터처리
실험에서 얻어진 결과의 통계적 유의성은 GraphPad InStat Version 3.05(GraphPad, San Diego, CA, USA) 통계 package를 이용하여 평균±표준오차로 표시하였고, 각 농도 평균 차의 통계적 유의성을 Tukey-Kramer multiple comparisons test에 의해 검정하였다.
이론/모형
DPPH 라디칼 소거능은 Chung 등(11)의 방법에 의하여 일정 농도의 안토시아닌과 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) 용액을 가하여 잘 혼합한 다음 37℃에서 30분간 반응시킨 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. DPPH 라디칼 소거활성은 대조구에 대한 시료 첨가구의 흡광도를 비교하여 (1－시료의 흡광도/대조구의 흡광도)×100에 의하여 %로 나타내었다.
cells/mL의 밀도로 깔아주고 24시간 동안 배양한 후 세포를 무혈청 배지로 세척하고 안토시아닌 처리 12시간 전에 FBS가 무 첨가된 배지로 교체하였다. 세포 생존율은 Huang 등(12)의 방법과 같이 처리한 후 MTT[3-(3,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] 환원방법을 이용하여 측정하였다.
성능/효과
PBS로 남아 있는 DCFH-DA probe를 제거한 후 PBS를 넣어 5분간 37℃에서 반응시킨 후 DCF의 형광은 fluorescence reader(BioTek, Winooski, VT, USA)로 파장 495 nm(excitation)와 525 nm(emission)에서 측정하였다. DCF 형광 광도는 안토시아닌과 DNP-BSA를 처리하지 않는 대조군을 100%로 하였을 때 상대적인 양을 계산하였다.
IgE 감작 후 DNP-HSA 처리는 현저하게 β-hexosaminidase 방출을 증가시켰고, 이들 증가는 안토시아닌 처리에 의해 농도 의존적으로 β-hexosaminidase 방출을 억제하였으며 50 μg/mL 안토시아닌 처리에 의해 43.8% 감소하였다(Fig. 3).
IgE-항원 복합체로 자극한 RBL-2H3 세포내 β-hexosaminidase 방출과 Th2 사이토카인 생산이 무처리군의 그것과 비교하여 더 높았다.
IgE에 의해 감작된 RBL-2H3세포에 DNA-HSA를 처리했을 때 IL-4, IL-13 그리고 TNF-α mRNA 발현이 현저하게 증가하였고, 안토시아닌 처리는 이들 사이토사인 발현을 현저하게 감소시켰다.
RBL-2H3 세포내에 항원(DNP-HSA) 처리 시 ROS 생산이 유도되었고, 안토시아닌 처리 시 ROS 생성이 억제되었다(Fig. 2A). 한편, 검정콩 껍질에서 분리된 안토시아닌이 DPPH 라디칼 소거작용이 있는지 확인한 결과 안토시아닌은 농도 의존적으로 DPPH 라디칼을 소거하였다(Fig.
따라서 본 연구 결과 검정콩 껍질에서 분리한 안토시아닌 처리에 의한 IL-4, IL-13 그리고 TNF-α의 발현 억제는 염증반응 관련 알레르기성 천식을 개선 및 예방할 수 있을 것을 시사하고 있다.
세포의 탈과립 정도를 알 수 있는 histamin과 β-hexosaminidase 방출 저해 효과를 가진 천연소재 발굴은 항알레르기 신약 개발 및 건강기능식품개발을 가능하게 할 수 있을 것이다(6,16). 본 연구 결과 검정콩 껍질에서 분리된 안토시아닌은 탈과립화를 억제함으로써 항알레기기 효과를 나타나는 신소재임을 알 수 있었다.
카마로사(Camarosa) 종의 딸기로부터 분리한 안토시아닌은 항산화 효과가 있고(14), 검정콩 껍질에서 분리된 안토시아닌 역시 DPPH radical 소거작용, LDL 산화억제, thiobarbituric acid reactive substances(TBARS) 생성억제 효과가 있는 것으로 알려져 있으나(15), 세포내 ROS를 감소할 수 있는지에 대한 연구는 전무하다. 본 연구에서 안토시아닌 처리는 항원에 의해 증가된 세포내 ROS를 감소시켰고, 이는 검정콩 껍질에서 분리한 안토시아닌의 강한 항산화효과에 기인된 것으로 생각되며 이와 같은 항산화력은 알레르기 질환 개선에 유익한 영향력을 미칠 것으로 생각된다.
후속연구
본 연구 결과 검정콩 껍질에서 분리된 안토시아닌은 β-hexodaminidase 방출 및 사이토카인 생성을 현저하게 억제하였으므로 항알레르기 효과를 나타내는 건강기능식품 개발 등 다양한 산업적 용도로 사용 가능할 것으로 생각된다.
세포의 탈과립 정도를 알 수 있는 histamin과 β-hexosaminidase 방출 저해 효과를 가진 천연소재 발굴은 항알레르기 신약 개발 및 건강기능식품개발을 가능하게 할 수 있을 것이다(6,16).
안토시아닌은 RBL-2H3 세포의 IgE-항원 복합체 유도 탈과립을 현저하게 억제시켰고 RBL-2H3 세포내 IgE-항원 복합체-매개체 interleukin(IL)-4, IL-13 그리고 TNF-α 생산을 저해하였다. 이러한 결과는 검정콩 껍질 유래 안토시아닌이 알레르기 반응(allergic reaction)을 현저히 저해하는 효과가 있음을 보였고, 이들 안토시아닌이 향후 알레르기 천식을 억제하거나 개선하는데 유용한 물질로 사용될 가능성이 있을 것으로 판단되었다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
알레르기성 천식을 예방, 개선 및 치료 효과를 가진 천연물 탐색에 IL-13, IL-4, TNF-α가 지표로 이용되고 있는 이유는?
IL-4는 B 세포를 자극하여 IgE 생산을 촉진시키고, 염증 세포들을 자극하여 염증매개 물질들을 분비시켜 기관지과민성과 기도폐쇄를 일으켜 천식증상을 일으키며, IL-13은 IL-4와 동등한 생물학적 역할을 수행한다(4). 전염증성 사이토카인(proinflammatory cytokines) tumor necrosis factor α(TNF-α)는 천식 유발 모델 마우스의 폐조직, 기관지 폐포 세척액(bronchoalveolar lavage fluid, BALF) 및 rat basophilic leukemia RBL-2H3 세포를 이용한 알레르기 모델에서 증가하였다(5,6). 따라서 알레르기성 천식을 예방, 개선 및 치료 효과를 가진 천연물 탐색에 IL-13, IL-4 그리고 TNFα가 중요한 지표로 사용되고 있다.
천식은 무엇인가?
천식은 면역글로불린(immunoglobulin E, IgE) 관련 type I 알레르기 반응으로 T helper 2(Th2) 세포에 의해서 조절되며 비만세포, 호염기구 그리고 호산구가 중요한 역할을 하는 염증반응이다. 그 발생기전을 알아보면, 먼저 IgE 항체 생성과 감작의 단계이며, 외부로부터 천식의 원인물질인 항원이 들어오면 이 항원을 제거하기 위해 대식세포가 활성화되고, 이 대식세포는 항체를 생산하도록 B 세포를 자극하여 항원 특이성 IgE를 생산한다.
IL-4은 어떻게 천식 증상을 일으키는가?
IL-4는 B 세포를 자극하여 IgE 생산을 촉진시키고, 염증 세포들을 자극하여 염증매개 물질들을 분비시켜 기관지과민성과 기도폐쇄를 일으켜 천식증상을 일으키며, IL-13은 IL-4와 동등한 생물학적 역할을 수행한다(4). 전염증성 사이토카인(proinflammatory cytokines) tumor necrosis factor α(TNF-α)는 천식 유발 모델 마우스의 폐조직, 기관지 폐포 세척액(bronchoalveolar lavage fluid, BALF) 및 rat basophilic leukemia RBL-2H3 세포를 이용한 알레르기 모델에서 증가하였다(5,6).
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