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문제 정의
- Chronic mild stress 모델을 이용한 荷葉 추출물(NLE)의 항우울 효과를 확인하기 위해 진행된 이번 실험에서 다음과 같은 결과를 얻었다.
- 본 연구에서는 만성 스트레스로 인해 발생되는 우울증의해결 방안을 모색하고자 Chronic mild stress 방법으로 우울증 증상을 유발시킨 동물모델에서, 두통완화 효과 및 항산화 효과를 가진 荷葉 추출물의 항우울 효과를 검증하고자, 자당선호도 (Sucrose preference test, SPT)변화, 강제수영법 (Forced swim test, FST), 꼬리매달기 (Tail suspension test, TST) 등의 우울증적 증상 개선 유무를 확인 할 수 있는 행동실험 및 스트레스 관련 호르몬인 corticosteron 함량 변화 통하여 荷葉 추출물의 항우울 효과에 대한 실험을 진행하였다.
제안 방법
- 2) 로 여과한 후 잔류물에 동량의 물을 첨가하여 2차 추출하였다. 1, 2차 추출액을 감압농축 (Buchi Rotavapor R-114 system) 한 후, 동결건조 (일신랩 Freeze Dryer FD5508A, Korea)를 통하여 荷葉 물 추출물 건조분말을 제조하였다. 제조된 건조분말은 균일한 품질을 위한 균질화 작업 후 바코드를 부착하여 냉장보관 (4℃이하) 하면서 실험에 사용하였다.
- 실험동물에 가해진 스트레스는 물 또는 먹이 박탈, 물 박탈 후 빈 물병 제시, 먹이 박탈 후 먹이제한, 주간·야간 주기의 역전, 고밀집 사육, 사육 상자 기울이기 (45°), 깔집 제거, 축축한 깔집 등이 포함되어 있다 (Table 1). CMS는 총 5주 동안 진행하였으며, 정상군을 제외한 모든 실험군에 처음 2주간은 CMS만을 적용하였고, 그 후 3주간은 CMS 및 약물 투여를 병행 하였다(Fig. 1). 실험 동물은 언제 어떤 종류의 스트레스가 제시될지 예측 할 수 없었다.
- CMS를 진행 후 실험동물의 1% 자당용액 섭취량 변화를 통하여 우울증 유발 관련 행동 변화 중자극에 대한 무쾌감 반응을 확인 지표로 결정하였다16,17). 자당용액 섭취량 변화 확인 전 실험동물을 1% 자당용액에 적응시키기 위해하여 검사 48시간 전 물통에 자당용액 넣어 섭취 할 수 있게 하였다.
- Chronic mild stress 모델은 1984년 Willner에 의해 제안된 실험 모델로 본 실험에서는 Willner의 실험방법을 일부 수정하여 실시하였다14). 실험동물에 가해진 스트레스는 물 또는 먹이 박탈, 물 박탈 후 빈 물병 제시, 먹이 박탈 후 먹이제한, 주간·야간 주기의 역전, 고밀집 사육, 사육 상자 기울이기 (45°), 깔집 제거, 축축한 깔집 등이 포함되어 있다 (Table 1).
- NLE의 항우울 효과를 확인하기 위해 CMS로 우울증이 유발된 동물모델에게 3주간 NLE 200 mg/kg의 농도로 투여 후 자당섭취량 변화 및 강제수영(FST), 꼬리매달기(TST) 행동 실험을 진행하였다. 그 결과 NLE을 투여한 군에서의 우울증 유발 유무의 육안적 지표인 자당 선호도의 회복율은 스트레스만 받은 대조군 보다는 증가한 것을 확인하였다.
- Sucrose consumption of mice. The sucrose preference test was carried out before stress (0 week) and 5 weeks after stress (5 week). All values given are the mean±S.
- 자당용액 섭취량 변화 확인 전 실험동물을 1% 자당용액에 적응시키기 위해하여 검사 48시간 전 물통에 자당용액 넣어 섭취 할 수 있게 하였다. 검사 24시간 전에는 절수, 절식을 시켰으며, 검사 당일 3시간 동안의 자당용액 섭취량 변화를 물병 무게의 변화를 통하여 확인하였다. 측정은 스트레스 전 (0 week)와 CMS 5주 후(5 week) 총 2번 측정하였다.
- 높이 40cm 직경 20 cm되는 수조에 온도 25± 1℃의 물을 30 cm가 되게 채운 후 실험용 쥐를 한 마리씩 수조에 넣고 총 6분 중 최초 2분은 적응시간으로 측정하지 않고, 마지막 4분 동안의 실험동물 부동상태(immobility) 시간을 측정하였다.
- 먼저 CMS 방법을 통하여 실험동물의 상태가 우울증으로 유도되었는지 확인하기 위해 체중과 자당 선호도 변화를 확인하였다. CMS와 같은 방법으로 지속적인 스트레스에 노출 된 동물은 스트레스를 받지 않은 동물에 비하여 체중 및 자당 선호율이 감소하며 이를 지표로 실험동물의 우울증 유발 유무를 확인 할 수 있다16,17).
- 본 연구에 이용된 CMS방법을 통한 실험동물의 우울증 상태 유발 및 NLE의 항우울 효과에 대한 검증은 자당섭취량 변화, 강제수영, 꼬리매달기와 같은 행동실험 및 스트레스 호르몬인 corticosterone의 변화를 이용하여 확인 하였다.
- 스트레스 관련 호르몬인 Corticosterone의 함량 변화는 5주간의 CMS 진행 후 실험동물의 혈장을 이용하여 측정하였다(Fig. 5). 정상군 (27.
- 실험동물의 몸무게 측정은 5주간 매주 측정 하였으며, 경구 투여에 사용한 NLE와 양성대조군인 Imipramine은 생리식염수에 200 mg/kg과 20 mg/kg의 용량으로 녹여 매일 오전 09:00에 3주간 경구투여 하였다. 약물 투여 없이 스트레스만 주는 대조군은 동일한 용량에 생리식염수를 경구투여 하였다.
- 실험방법은 한국한의학연구원 윤리위원회의 심의(승인번호: 13-079)을 거쳤으며, 실험동물 사육 및 유지는 한국한의학연구원 실험동물연구센터의 동물 관리 및 사용규정에 입각하여 온도 23 ± 2℃, 습도 50 ± 10% 내외 명암주기 12시간 주기로 일정하게 유지된 사육실에서 Individually Ventilated Cage (IVC)에 5마리씩 넣어 사육하였다.
- . 실험용 쥐 꼬리 끝 1cm 정도에 고정 장치를 장착 후 지면에서 50cm 떨어진 위치에 매달고, 총 6분 동안의 측정 중 최초 2분은 적응시간으로 측정하지 않고 마지막 4분 동안의 실험동물 상태 중 부동상태(immobility) 시간을 측정하였으며, 부동상태는 매달려있는 상태에서 아무런 움직임 없이 완전히 멈춰 있는 상태를 부동상태로 간주하였다.
- 실험동물의 몸무게 측정은 5주간 매주 측정 하였으며, 경구 투여에 사용한 NLE와 양성대조군인 Imipramine은 생리식염수에 200 mg/kg과 20 mg/kg의 용량으로 녹여 매일 오전 09:00에 3주간 경구투여 하였다. 약물 투여 없이 스트레스만 주는 대조군은 동일한 용량에 생리식염수를 경구투여 하였다. 양성대조군인 Imipramine은 시그마 알드리치 코리아 (St.
- 실험 동물은 언제 어떤 종류의 스트레스가 제시될지 예측 할 수 없었다. 정상군은 스트레스가 적용되는 집단과 접촉을 피하도록 다른 사육실에서 사육 하였고, 자당 선호도 검사 전날 먹이, 물 박탈 이외에는 물과 먹이를 자유롭게 공급 하였다.
- 검사 24시간 전에는 절수, 절식을 시켰으며, 검사 당일 3시간 동안의 자당용액 섭취량 변화를 물병 무게의 변화를 통하여 확인하였다. 측정은 스트레스 전 (0 week)와 CMS 5주 후(5 week) 총 2번 측정하였다.
대상 데이터
- 본 실험에서 사용된 荷葉은 ㈜광명당제약(울산, 한국)으로 부터 구입하여 진행하였으며, 표본은 연구원에 보관되어 있다(표본번호 : KIOM012909).
- 실험동물로 사용된 8주령 수컷 ICR 마우스는 ㈜ 샘타코 바이오 코리아(경기도, 한국)에서 공급 받아 사용하였다. 실험 동물은 Specific Pathogen Free(SPF) 시설인 한국한의학연구원 실험동물연구센터에서 7일간 적응 시킨 후 스트레스를 주지 않는 정상군, 스트레스만 주는 대조군, 스트레스와 시판 항우울제를 투여하는 양성대조군, 스트레스와 추출물을 투여하는 실험군으로, 각 군당 10마리씩 총 4군으로 구분하여 실험을 진행하였다. 실험방법은 한국한의학연구원 윤리위원회의 심의(승인번호: 13-079)을 거쳤으며, 실험동물 사육 및 유지는 한국한의학연구원 실험동물연구센터의 동물 관리 및 사용규정에 입각하여 온도 23 ± 2℃, 습도 50 ± 10% 내외 명암주기 12시간 주기로 일정하게 유지된 사육실에서 Individually Ventilated Cage (IVC)에 5마리씩 넣어 사육하였다.
- 실험동물로 사용된 8주령 수컷 ICR 마우스는 ㈜ 샘타코 바이오 코리아(경기도, 한국)에서 공급 받아 사용하였다. 실험 동물은 Specific Pathogen Free(SPF) 시설인 한국한의학연구원 실험동물연구센터에서 7일간 적응 시킨 후 스트레스를 주지 않는 정상군, 스트레스만 주는 대조군, 스트레스와 시판 항우울제를 투여하는 양성대조군, 스트레스와 추출물을 투여하는 실험군으로, 각 군당 10마리씩 총 4군으로 구분하여 실험을 진행하였다.
- 약물 투여 없이 스트레스만 주는 대조군은 동일한 용량에 생리식염수를 경구투여 하였다. 양성대조군인 Imipramine은 시그마 알드리치 코리아 (St. Louis Mo)의 제품을 사용하였다.
데이터처리
- 결과 값의 표기는 ‘평균±표준편차’로 표시하였으며, 실험군별 차이의 유의성 검증은 일원변량분석(one-way ANOVA) 을 실시하였다.
이론/모형
- 그 후 4℃, 15,000 rpm에서 15분간 원심 분리하여 상등액 (plasma)을 분리, 실험 전까지 냉동보관(-20℃)하였다. Corticosterone 농도는 일반적으로 사용하는 EIA kit (Corticosterone EIA kit, Oxford Biomedical Research, USA)를 이용하여 측정하였다.
- NLE의 항우울 효과를 측정하기 위해 Porsolt 등의 방법을 이용하였다28). 높이 40cm 직경 20 cm되는 수조에 온도 25± 1℃의 물을 30 cm가 되게 채운 후 실험용 쥐를 한 마리씩 수조에 넣고 총 6분 중 최초 2분은 적응시간으로 측정하지 않고, 마지막 4분 동안의 실험동물 부동상태(immobility) 시간을 측정하였다.
- 꼬리매달기 실험은 Steru 등의 방법을 이용하였다29). 실험용 쥐 꼬리 끝 1cm 정도에 고정 장치를 장착 후 지면에서 50cm 떨어진 위치에 매달고, 총 6분 동안의 측정 중 최초 2분은 적응시간으로 측정하지 않고 마지막 4분 동안의 실험동물 상태 중 부동상태(immobility) 시간을 측정하였으며, 부동상태는 매달려있는 상태에서 아무런 움직임 없이 완전히 멈춰 있는 상태를 부동상태로 간주하였다.
성능/효과
- 1. CMS로 인해 우울증이 유발된 동물모델에서 특징적으로 나타나는 체중 및 자당섭취량 감소는 3주 동안의 NLE (200mg/kg)을 투여함으로써 증가하는 것을 확인하였다.
- 2. 항우울 효과 확인을 위한 행동실험인 강제수영(FST), 꼬리매달기(TST)에서 스트레스만 받은 대조군과 비교하였을 때 포기상태를 나타내는 부동자세 시간이 감소하는 것을 확인하였다.
- 3. NLE을 투여한 군과 스트레스만 받은 대조군을 비교 하였을 때 스트레스 호르몬인 코르티코스테론(corticosterone) 수치가 낮아지는 것을 확인하였다.
- 스트레스에 의한 코르티코스테론의 증가는 해마에 신경세포 손상 및 해마 신경세포의 고유한 속성에 영향을 미쳐 해마 신경세포의 흥분성을 감소시키며 이는 해마 LTP의 손상을 가져 온다 보고되어 있다34,35). 3주간 NLE을 투여한 군은 스트레스만 받은 대조군에 비해 코르티코스테론의 상승률이 낮았으며, NLE을 투여를 통하여 스트레스 완화 및 그로인한 뇌의 산화적 손상 보호효과도 예측해 볼 수 있었다.
- 우울증 유발 증상 중 하나인 무쾌감 반응에 대한 확인 지표인 자당선호도 확인은 CMS 진행 전(0 week)에서는 각 그룹별 자당 선호도의 변화는 크게 나타내지 않았다. 5주 동안의 CMS 진행 후 각 그룹별 자당 선호도는 정상군과 비교해보았을 때 대조군 24.0%, NLE 투여군 11.3%, Imipramine 투여군 3.4%의 자당 선호율이 감소하였다(Fig. 2). 반면에 양성대조군인 Imipramine 투여군 보다는 NLE 투여군의 자당선호도에 대한 회복율은 낮았지만, 스트레스만 받은 대조군에 비해 NLE 투여군의 자당 선호율은 12.
- NLE 투여 후 꼬리매달기에서의 부동상태 시간 변화를 확인해본 결과(Fig. 4), 정상군에 비해 스트레스만 받은 대조군의 부동상태 시간은 84초 이상 더 오래 지속되었다. 반면 NLE와 Imipramine 투여군의 부동상태 시간은 정상군에 비해서는 증가하였지만, 스트레스만 받은 대조군과 비교하였을 땐 각각 27초(p=0.
- NLE의 CMS모델에서의 체중 변화에 대한 효과를 확인해본 결과, 초기 체중은 정상군 32.1±0.8g, 대조군 32.5 ±0.7g, NLE 투여군 32.9 ± 0.8g, Imipramine 투여군 31.9± 1.0g으로 모든 군의 체중은 유사하게 나타났다.
- 강제수영에서의 우울적 행동의 척도인 부동상태의 시간 변화를 각 군별로 확인해본 결과, 정상군에 비해 대조군의 부동상태 시간은 115초 이상 더 오래 지속되었다. 반면 NLE와 Imipramine 투여군의 부동상태 시간은 정상군에 비해 증가 하였지만 스트레스만 받은 대조군과 비교하였을 땐 각각 61초(p=0.
- NLE의 항우울 효과를 확인하기 위해 CMS로 우울증이 유발된 동물모델에게 3주간 NLE 200 mg/kg의 농도로 투여 후 자당섭취량 변화 및 강제수영(FST), 꼬리매달기(TST) 행동 실험을 진행하였다. 그 결과 NLE을 투여한 군에서의 우울증 유발 유무의 육안적 지표인 자당 선호도의 회복율은 스트레스만 받은 대조군 보다는 증가한 것을 확인하였다. 또한 행동제한적인 공간에서 우울증이 유발된 실험동물의 부동적 상태의 시간의 증가를 통하여 절망과 정신적 우울감 상태를 확인하는 실험으로 알려져 있는28,29) FST와 TST의 행동실험 결과를 보면 부동자세의 지속 시간이 스트레스만 받은 대조군에 비해 NLE을 투여한 군에서 상당히 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
- 그러나 CMS 진행 2주차부터 CMS가 진행된 실험군들의 체중은 정상군에 비해 약 3g 이상씩 급격하게 감소하기 시작했다. 반면 CMS 3주차부터 NLE와 Imipramine를 투여한 군의 체중은 투여가 진행됨에 따라 정상군과 비교하였을 때 체중이 점차 회복 되는 것을 확인 할 수 있었으나, NLE 투여군의 체중 회복은 Imipramine 투여군 보다는 낮았다(Table 2).
- 4), 정상군에 비해 스트레스만 받은 대조군의 부동상태 시간은 84초 이상 더 오래 지속되었다. 반면 NLE와 Imipramine 투여군의 부동상태 시간은 정상군에 비해서는 증가하였지만, 스트레스만 받은 대조군과 비교하였을 땐 각각 27초(p=0.04), 78초(p=0.0002) 감소하였다. 하지만 NLE 투여군의 부동상태 시간은 Imipramine 투여군 보다는 51초 더 길게 나타났다.
- 2). 반면에 양성대조군인 Imipramine 투여군 보다는 NLE 투여군의 자당선호도에 대한 회복율은 낮았지만, 스트레스만 받은 대조군에 비해 NLE 투여군의 자당 선호율은 12.6% 증가하는 것을 확인 할 수 있었다.
- 본 실험에 이용된 실험동물들의 체중 감소와 자당섭취량 감소 결과를 토대로 CMS 방법을 통한 우울증 유발이 제대로 유도됐음을 확인 할 수 있었다.
- 위 결과들을 종합해 볼 때 CMS모델을 통한 항우울 효과 검증 실험은 항우울제제 개발 효능 평가 실험에 유용하다고 사료되며, NLE은 양성대조군인 Imipramine보다는 항우울 효과가 뛰어 나진 않았지만 우을증 행동 개선 및 스트레스 호르몬의 분비를 저하시킬 수 있는 항우울 효과가 있음을 확인하였다. 또한 스트레스로 인해 발생 될 수 있는 뇌 손상에 대한 보호 효과 가능성을 예측해 볼 수 있었으며, 차후 뇌신경 보호 효과에 대한 효능 검증 및 항우울 효과를 나타내는 물질에 대한 구조 분석이 필요 할 것으로 사료된다.
- 또한 행동제한적인 공간에서 우울증이 유발된 실험동물의 부동적 상태의 시간의 증가를 통하여 절망과 정신적 우울감 상태를 확인하는 실험으로 알려져 있는28,29) FST와 TST의 행동실험 결과를 보면 부동자세의 지속 시간이 스트레스만 받은 대조군에 비해 NLE을 투여한 군에서 상당히 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 이 결과들을 종합해 볼 때 NLE는 양성대조군인 Imipramine 보다는 항우울 효과는 낮지만, 우울증 행동 개선 효과가 있음을 확인 할 수 있었다.
- 이상의 결과로 보아 荷葉 추출물(NLE)은 항우울 효과 및 스트레스 완화 효과가 있는 것으로 사료된다.
후속연구
- 위 결과들을 종합해 볼 때 CMS모델을 통한 항우울 효과 검증 실험은 항우울제제 개발 효능 평가 실험에 유용하다고 사료되며, NLE은 양성대조군인 Imipramine보다는 항우울 효과가 뛰어 나진 않았지만 우을증 행동 개선 및 스트레스 호르몬의 분비를 저하시킬 수 있는 항우울 효과가 있음을 확인하였다. 또한 스트레스로 인해 발생 될 수 있는 뇌 손상에 대한 보호 효과 가능성을 예측해 볼 수 있었으며, 차후 뇌신경 보호 효과에 대한 효능 검증 및 항우울 효과를 나타내는 물질에 대한 구조 분석이 필요 할 것으로 사료된다.
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