Objectives : Inflammation is mediated by cellular components, such as leukocytes and microglia, and molecular components, including cytokines, extracellular proteases, and reactive oxygen species. Cnidium Rhizoma effects the anti-inflammatory, antioxidant, suppression of the microglia activation and...
Objectives : Inflammation is mediated by cellular components, such as leukocytes and microglia, and molecular components, including cytokines, extracellular proteases, and reactive oxygen species. Cnidium Rhizoma effects the anti-inflammatory, antioxidant, suppression of the microglia activation and protection of the nerve cell injury. For this reason, we investigated the anti-inflammatory effects of water extracts of Cnidium Rhizoma on intracerebral hemorrhage (ICH). Method : ICH was induced by the stereotaxic intracerebral injection of bacterial collagenase type IV (0.23 $U/{\mu}{\ell}$, 0.1 ${\mu}{\ell}/min$) in Sprague-Dawley rats. We orally administrated once 3 hours after ICH, then 2 times at 24-hour intervals the water extracts of Cnidium Rhizoma (500 mg/kg), myeloperoxidase (MPO) was observed by using immunofluorescense and expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS), tumor necrosis factor-${\alpha}$ (TNF-${\alpha}$) and microglia were observed by using immunohistochemistry. Results : Infiltration of MPO expressing neutrophil, expression of iNOS and TNF-${\alpha}$ and activated microglia were significantly reduced in peri-hematoma of the rats fed with water extracts of Cnidium Rhizoma. Conclusion : These results demonstrated that water extracts of Cnidium Rhizoma suppressed an inflammatory reaction through inhibition of MPO, iNOS and TNF-${\alpha}$ positive cell and activated microglia number in peri-hematoma of ICH-induced rats.
Objectives : Inflammation is mediated by cellular components, such as leukocytes and microglia, and molecular components, including cytokines, extracellular proteases, and reactive oxygen species. Cnidium Rhizoma effects the anti-inflammatory, antioxidant, suppression of the microglia activation and protection of the nerve cell injury. For this reason, we investigated the anti-inflammatory effects of water extracts of Cnidium Rhizoma on intracerebral hemorrhage (ICH). Method : ICH was induced by the stereotaxic intracerebral injection of bacterial collagenase type IV (0.23 $U/{\mu}{\ell}$, 0.1 ${\mu}{\ell}/min$) in Sprague-Dawley rats. We orally administrated once 3 hours after ICH, then 2 times at 24-hour intervals the water extracts of Cnidium Rhizoma (500 mg/kg), myeloperoxidase (MPO) was observed by using immunofluorescense and expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS), tumor necrosis factor-${\alpha}$ (TNF-${\alpha}$) and microglia were observed by using immunohistochemistry. Results : Infiltration of MPO expressing neutrophil, expression of iNOS and TNF-${\alpha}$ and activated microglia were significantly reduced in peri-hematoma of the rats fed with water extracts of Cnidium Rhizoma. Conclusion : These results demonstrated that water extracts of Cnidium Rhizoma suppressed an inflammatory reaction through inhibition of MPO, iNOS and TNF-${\alpha}$ positive cell and activated microglia number in peri-hematoma of ICH-induced rats.
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문제 정의
川芎에 대한 연구들과 효능을 통해 뇌출혈 후 염증에 대해 川芎이 효과가 있을 것으로 생각되어 이에 대한 연구에 착수하였다.
이후 염증과 관련된 MPO 양성 중성백혈구 수, iNOS, TNF-α 및 활성미세아교세포 수의 변화를 면역형광과 면역조직화학염색방법을 이용하여 측정한바, 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
면역형광염색된 MPO 양성반응 세포는 confocal laser-scanning microscopy (LSM510 META, CarlZeiss, Germany)를 사용하여 관찰하였으며, DAB로 발색된 iNOS와 TNF-α 및 OX-42 발현은 CCD카메라 (DP70, Olympus, Japan)가 장착된 광학현미경 (BX51, Olympus, Japan)을 사용하여 관찰하였다. 각 지표의 발현 정도는 양성반응 세포 수를 측정하여 비교하였다. 양성반응 세포 수 측정을 위해서 각각의 영상을 영상분석시스템에 저장하고, ImageJ software (ver.
약물 500 ㎎/㎏을 실험동물의 1회 투여량으로 하였다. 뇌조직출혈 유발 3시간 뒤에 한번 그리고 약물투여 후 약 24시간 간격으로 2회 총 3회 경구투여 하였다.
뇌조직출혈 유발을 위한 수술과정은 electronic temperature controller (CMA150, CMA, Sweden)를 통하여 정상체온 (37±0.5 ℃)이 유지되는 상태에서, 2% isoflurane을 포함한 70% N2O와 30% O2 gas의 흡입마취 하에서 이루어졌으며, 필요한 경우 추가적으로 pentobarbital sodium (50 ㎎/㎏)을 복강주사 하였다.
이에 저자는 뇌출혈로 인한 염증 반응에 대해 川芎의 효과를 관찰하기 위해 흰쥐의 선조체 내에 콜라겐 분해효소(collagenase)를 주입하여 출혈을 유발하였으며, 川芎 물추출물을 3일간 경구 투여하였다. 이후 염증과 관련된 MPO 양성 중성백혈구 수, iNOS, TNF-α 및 활성미세아교세포 수의 변화를 면역형광과 면역조직화학염색방법을 이용하여 측정한바, 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
다음 0.05% 3,3′-diamino-benzidine tetrachloride (DAB, Sigma-Aldrich, USA)에서 2분간 발색시키고 수세하고 탈수한 다음 봉입하여 조직표본을 제작하였다.
iNOS와 TNF-α 및 미세아교세포의 표식자인 OX-42는 각각 1차 항체를 anti-iNOS (1:200, #610297, BD Science, USA), anti-TNF-α (1:100, Sc-1349, SantaCruz Biotechnology, USA) 및 anti-OX-42 (1:250, MCA275EL, Serotec, USA)를 사용하였으며, PBS와 Triton X-100을 섞은 용액으로 희석한 후 4℃에서 반응시켰다. 다음 biotinylated anti-rabbit secondary antibody (1:200, Vector Labolatories, USA)에 실온에서 1시간동안 반응시키고, 조직을 PBS로 씻어낸 후 avidin-biotin immuno-peroxidase의 방법에 따라 각각 1시간씩 반응시켰다. 다음 0.
마취된 흰쥐의 머리를 뇌정위고정장치 (Stoelting, USA)에 고정한 다음 두정부의 정중선을 따라 피부를 절개하고 두개골이 드러나게 하였다. 두개골의 bregma로부터 전방으로 0.2 ㎜, 우측으로 3.5 ㎜ 위치에 전기드릴을 사용하여 약 1 ㎜ 직경의 두개골 천공을 만들고, 뇌정위고정장치에 장착된 Hamilton 주사기 (26-gauge, 10 ㎕, Hamilton, USA)를 뇌경막 (dura mater)으로부터 5.5 ㎜ 깊이로 선조체에 삽입하였다. 이어서 1 ㎕ 내에 0.
마취된 흰쥐의 머리를 뇌정위고정장치 (Stoelting, USA)에 고정한 다음 두정부의 정중선을 따라 피부를 절개하고 두개골이 드러나게 하였다. 두개골의 bregma로부터 전방으로 0.
뇌조직출혈에 대한 川芎의 효능을 관찰하기 위하여 실험군은 다음과 같이 구분하였다. 마취와 두정부의 피부절개 및 두개골의 천공 과정은 시행하였으나 collagenase를 주입하지 않은 정상대조군 (Sham군)과 이러한 사전준비에 이어 선조체에 collagenase를 주입하여 뇌조직출혈을 유발시킨 대조군 (ICH군) 및 대조군과 같이 뇌조직출혈을 유발한 다음 川芎 물추출물을 경구 투여한 川芎투여군 (ICH+CR군)으로 나누었다. 각 군의 실험동물은 12마리씩 총 36마리를 사용하였다.
면역조직화학 및 면역형광 염색을 위해 뇌조직출혈 유발 48시간 후 실험동물을 pentobarbital의 복강주사로 깊게 마취한 다음 개흉하고 심장을 통하여 0.05 M phosphate buffered saline (PBS)과 4% paraformaldehyde로 충분히 관류하였다. 이후 뇌를 적출한 다음 24시간 정도 post-fixation하고, sucrose 용액에 담궈 침전시켰다.
면역형광염색된 MPO 양성반응 세포는 confocal laser-scanning microscopy (LSM510 META, CarlZeiss, Germany)를 사용하여 관찰하였으며, DAB로 발색된 iNOS와 TNF-α 및 OX-42 발현은 CCD카메라 (DP70, Olympus, Japan)가 장착된 광학현미경 (BX51, Olympus, Japan)을 사용하여 관찰하였다.
본 실험에 사용한 川芎(Cnidium officinale Makino)은 (주)허브메디에서 국내산을 구입하였다. 세절한 川芎 400 g에 3,000 ㎖의 물을 가하여 전탕하고, 여과액을 rotary evaporator로 감압 농축한 후 동결건조 하였다. 136.
약물 500 ㎎/㎏을 실험동물의 1회 투여량으로 하였다. 뇌조직출혈 유발 3시간 뒤에 한번 그리고 약물투여 후 약 24시간 간격으로 2회 총 3회 경구투여 하였다.
각 지표의 발현 정도는 양성반응 세포 수를 측정하여 비교하였다. 양성반응 세포 수 측정을 위해서 각각의 영상을 영상분석시스템에 저장하고, ImageJ software (ver. 1.41, NIH, USA)를 사용하여 뇌출혈 주변부에서 양성반응 세포 수를 측정한 다음 일정면적 (105 ㎛2)으로 보정하여 자료로 사용하였다.
이에 저자는 뇌출혈로 인한 염증 반응에 대해 川芎의 효과를 관찰하기 위해 흰쥐의 선조체 내에 콜라겐 분해효소(collagenase)를 주입하여 출혈을 유발하였으며, 川芎 물추출물을 3일간 경구 투여하였다. 이후 염증과 관련된 MPO 양성 중성백혈구 수, iNOS, TNF-α 및 활성미세아교세포 수의 변화를 면역형광과 면역조직화학염색방법을 이용하여 측정한바, 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
뇌출혈로 인한 염증 반응에 대해 川芎의 효과를 관찰하기 위해 흰쥐의 선조체내에 콜라겐 분해효소(collagenase)를 주입하여 출혈을 유발하였으며, 川芎 물추출물을 3일간 경구 투여하였다. 이후 염증과 관련된 MPO 양성반응의 중성백혈구 침착을 면역형광염색과 iNOS, TNF-α 및 활성미세아교 양성반응 세포를 면역조직화학염색으로 관찰한바 아래와 같은 결과를 얻었다.
대상 데이터
iNOS와 TNF-α 및 미세아교세포의 표식자인 OX-42는 각각 1차 항체를 anti-iNOS (1:200, #610297, BD Science, USA), anti-TNF-α (1:100, Sc-1349, SantaCruz Biotechnology, USA) 및 anti-OX-42 (1:250, MCA275EL, Serotec, USA)를 사용하였으며, PBS와 Triton X-100을 섞은 용액으로 희석한 후 4℃에서 반응시켰다.
마취와 두정부의 피부절개 및 두개골의 천공 과정은 시행하였으나 collagenase를 주입하지 않은 정상대조군 (Sham군)과 이러한 사전준비에 이어 선조체에 collagenase를 주입하여 뇌조직출혈을 유발시킨 대조군 (ICH군) 및 대조군과 같이 뇌조직출혈을 유발한 다음 川芎 물추출물을 경구 투여한 川芎투여군 (ICH+CR군)으로 나누었다. 각 군의 실험동물은 12마리씩 총 36마리를 사용하였다. Sham군의 조직은 염색과정 등에서 정상대조군으로 사용하였으며, 그 자료는 실험결과로 제시하지 않았다.
다음 뇌를 -40℃의 dry ice-isophentane 용액으로 동결시키고 조직절편을 제작할 때까지는 -80℃에 보관하였다. 뇌조직은 cryocut으로 30 ㎛ 두께의 관상절편으로 제작하여 염색에 사용하였다.
본 실험에 사용한 川芎(Cnidium officinale Makino)은 (주)허브메디에서 국내산을 구입하였다. 세절한 川芎 400 g에 3,000 ㎖의 물을 가하여 전탕하고, 여과액을 rotary evaporator로 감압 농축한 후 동결건조 하였다.
실험동물은 나라바이오텍 (Nara Biotechnology, Korea)에서 구입한 11주령, 약 300 g 전후의 Sprague-Dawley계 수컷 흰쥐를 사용하였다. 흰쥐는 온도 (21-23 ℃), 습도 (40-60%), 조명 (12시간 명/암)이 자동적으로 유지되는 사육실에서 무균음수와 사료를 자유롭게 공급하며 사육되었고, 실험실 환경에 1주 이상 적응시킨 후 사용하였다.
이후 3회 씻어 낸 후 1차 항체를 처리하였다. 중성백혈구 표식자인 myeloperoxidase (MPO)에 대해서 1차 항체는 anti-MPO (1:250, A-0398, DAKO, USA)를, 2차 항체는 Cy5-conjugated goat anti-rabbit (1:200, ab6564, Abcam, UK)를 사용하였다. iNOS와 TNF-α 및 미세아교세포의 표식자인 OX-42는 각각 1차 항체를 anti-iNOS (1:200, #610297, BD Science, USA), anti-TNF-α (1:100, Sc-1349, SantaCruz Biotechnology, USA) 및 anti-OX-42 (1:250, MCA275EL, Serotec, USA)를 사용하였으며, PBS와 Triton X-100을 섞은 용액으로 희석한 후 4℃에서 반응시켰다.
데이터처리
측정된 모든 자료는 student's t-test를 사용하여 ICH군과 ICH+CR군 사이에서 P<0.05의 유의수준으로 검증하였다.
ICH 주변조직에서 활성미세아교세포를 관찰한 결과 본 연구의 결과에서도 뇌출혈 조직 및 주변 조직에서 활성미세아교세포들이 관찰되었다. 川芎을 투여한 ICH+CR군은 ICH군에 비교하여 뇌출혈 조직에서 나타난 활성미세아교세포들이 감소하였음을 확인할 수 있었다.
ICH 주변조직에서 활성미세아교세포를 관찰한 결과 본 연구의 결과에서도 뇌출혈 조직 및 주변 조직에서 활성미세아교세포들이 관찰되었다. 川芎을 투여한 ICH+CR군은 ICH군에 비교하여 뇌출혈 조직에서 나타난 활성미세아교세포들이 감소하였음을 확인할 수 있었다.
뇌조직출혈 흰쥐의 출혈 주변조직에서 MPO 양성반응의 중성백혈구 침착을 동일한 일정면적에서 측정한 결과, ICH군은 103.2±4.9 개였다.
뇌조직출혈 흰쥐의 출혈 주변조직에서 OX42에 양성반응을 나타낸 활성미세아교세포를 관찰한 결과, ICH군과 ICH+CR군은 모두 큰 세포체와 굵고 짧은 돌기들을 갖은 활성화된 미세아교세포들만이 관찰되었다. 활성미세아교세포를 동일한 일정면적에서 측정한 결과, ICH군은 38.
뇌조직출혈 흰쥐의 출혈 주변조직에서 TNF-α 양성반응 세포를 관찰한 결과, 川芎을 투여한 ICH+CR군은 ICH군에 비해 TNF-α 발현이 감소된 것을 관찰할 수 있었다 (Fig. 3).
뇌조직출혈 흰쥐의 출혈 주변조직에서 iNOS 양성반응 세포를 동일한 일정면적에서 측정한 결과, ICH군은 24.8±3.0 개 였다.
MPO는 염증질환의 진행을 판별하는 지표로 사용되며, 중성백혈구의 면역염색 표식자로 활용되고 있다. 뇌출혈 주변조직에서 MPO 양성반응을 보이는 중성백혈구의 침윤에 대한 天芎의 영향을 관찰한 결과 川芎을 투여한 ICH+CR군이 대조군인 ICH군보다 MPO에 양성반응으로 보이는 중성백혈구 침착수를 유의하게 억제하여 뇌조직의 염증반응을 억제하는 효능이 있음을 확인할 수 있었다.
05의 유의성 있는 iNOS 양성반응 세포의 감소를 나타내었다. 또한 川芎을 투여한 ICH+CR군에서는 ICH군에 비해 내포 (interncal capsule) 부위에서 iNOS 발현이 현저하게 억제되었다 (Fig. 2).
염증반응의 기전과 관련하여 川芎이 TNF-α발현과 iNOS 발현에 미치는 영향을 면역조직화학염색을 통하여 관찰한 결과 川芎은 출혈 주변조직에서 TNF-α와 iNOS의 발현 증가를 유의하게 억제하는 것을 확인했다.
이상의 결과들을 종합하면, 川芎이 MPO 양성반응 중성백혈구, iNOS, TNF-α 및 활성미세아교세포 발현을 억제하여 뇌조직 출혈 주변부의 염증을 억제하는 것으로 판단된다.
이상의 결과로 보아 川芎은 뇌출혈 주변조직에서 염증반응을 억제하는 효능이 있는 것으로 판단된다.
활성미세아교세포를 동일한 일정면적에서 측정한 결과, ICH군은 38.5±2.7 개였으며, 川芎을 투여한 ICH+CR군은 30.7±1.9 개로 P<0.05의 유의성 있는 활성미세아교세포의 감소를 나타내었다 (Fig. 4).
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
뇌출혈 신체에 어떠한 영향을 끼치는가?
뇌출혈(Intracerebral Hemorrhage, ICH)은 뇌혈관질환의 심각한 형태로서, 사망률이 50%에 이르며, 생존해도 이들 중 40%는 중등도의 기능장애가 있는 채로 살아가고, 15-30%는 심각한 후유증이 동반되는 등 심각한 신경학적 손상이 뒤따른다1,2). 뇌출혈은 전체 뇌졸중의 15-20%를 차지하며 미국에서는 매년 120,000명에게 뇌출혈이 발생하지만3), 현재 뇌출혈에 대한 효과적인 치료법이 없는 실정이다.
뇌출혈 시 염증 초기 단계에서 myeloperoxidase (MPO)가 혈관 내피세포에 침윤되면 어떻게 되는가?
뇌출혈 시 염증 초기 단계에서 myeloperoxidase (MPO)가 혈관 내피세포에 침윤되면 투과성을 증가시켜 뇌세포를 더욱 손상시키며, MPO는 산화제를 생성하는 반응 기전에 중요한 역할을 한다5). iNOS는 염증 전 매개인자(proinflammatory mediators)의 역할을 하며6), TNF-α는 ICH 후 염증반응을 매개시키며7,8), 활성화된 미세아교세포는 ICH 후 발생하는 뇌조직의 염증반응을 더욱 증가시킨다9).
CR의 실험적 연구에서 보고된 효과에는 무엇이 있는가?
川芎(Cnidium Rhizoma, CR)은 『神農本草經』에 처음 기재된 이래 活血行氣, 祛風止痛하는 효능이 있어 血瘀頭痛, 中風, 癥痂, 婦人科 질환 등을 치료하는 걸로 알려져 있다10). 川芎에 대한 실험적 연구에서 항산화 작용11), 항염 작용12), 활성미세아교세포 생성에 대한 억제작용13), 유리기 제거 작용14), 뇌허혈에 있어서의 뇌신경세포 보호효과15)가 있다고 하였다. 川芎에 대한 연구들과 효능을 통해 뇌출혈 후 염증에 대해 川芎이 효과가 있을 것으로 생각된다.
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