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문제 정의
- 따라서 본 연구의 주요 목적은 긴병꽃풀속내 분류군의 한계가 다소 명확하다고 판단되는 총 5종(G. grandis, G. hederacea, G. hirsuta, G. longituba, G. sardoa)을 대상으로 핵리보솜 DNA의 ITS 구간의 염기서열을 비교하여 종간 계통 유연관계를 분석하고, 주사전자현미경(SEM: Scanning Electron Microscope)을 통한 화판과 악편의 미세형태 구조를 관찰하고 기재하여 분류군간의 식별형질로서의 가치를 파악하고자 한다.
제안 방법
- : DNA추출은 엽병 및 주맥을 제외한 부분을 막자사발에 넣고 DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN, Germany)를 사용하였으며, 모든 과정은 안내서(DNeasy Plant Mini Handbook, 1996; QIAGEN, Germany)를 따라 수행하였다. 추출한 DNA는 일부를 1.
- : 핵 리보솜 DNA의 ITS부위의 증폭을 위한 PCR은 HL premix (Bioneer, Dae-Jeon)를 사용하였고, PCR 조건은 97°C에서 1분간 predenaturation시킨 이후 97℃에서 10초간 denaturation, 48°C에서 30초간의 annealing, 72°C에서 20초간 extension하였 으며, extension시간은 첫 회 이후 cycle당 4초씩 증가시켜 40회 반복 한 후 72°C에서 7분간 더 유지시켰다.
- : 화판과 악편의 형태 및 모용의 분포는, 석엽표본으로부터 각 분류군마다 가능한 여러 집단(1-6개체)을 선정하여 해부현미경으로 관찰하였으며(Appendix I), 성숙한 화판 및 악편을 채취한 후, 연화제(water : agepon solution = 20 : 1)에 넣어 24시간 이상 담가 조직을 부드럽게 한 후, 다시 FAA (formaldehyde - acetic acid - ethanol)에 고정하였다. 이 후 아세톤시리즈 (acetone series: 50%, 70%, 90%, 100%에서 각 약 30분-1시간 정도 보관)를 거쳐 탈수한 후, 이산화탄소(CO2 gas)를 이용한 임계점 건조 처리(critical point drying; JEOL, SPI-13200JAB, Japan)로 완전히 건조시켰다.
- Heuristic search 방법을 이용하여 최대절약 분석(maximum parsimony analysis)을 하였으며, 이에 따른 option으로는 ACCTRAN, ‘TBR’ branch swapping, ‘MULPARS’으로 최적화하였다.
- 이 후 아세톤시리즈 (acetone series: 50%, 70%, 90%, 100%에서 각 약 30분-1시간 정도 보관)를 거쳐 탈수한 후, 이산화탄소(CO2 gas)를 이용한 임계점 건조 처리(critical point drying; JEOL, SPI-13200JAB, Japan)로 완전히 건조시켰다. 건조된 시료는 알루미늄 스터브(aluminum stub) 위에 올린 다음 이온증착기(ionsputter; JEOL, JFC-1100, Japan)를 이용하여 백금(Pt)으로 이온증착하고, 주사전자현미경(SEM; JEOL, JSM-5200, Japan)으로 가속전력 20kV에서 관찰하고 사진 촬영하였다. 화판 및 악편에 분포하는 기공복합체의 수가 많지 않은 관계로, 크기 및 형태는 3개를 최소단위로 측정하였다.
- 또한 형질에 있어서 가중치는 모두 동일하게 처리하였고, 전체 염기서열 중 gap은 모두 결여형질(missing character)로 처리하였으며, 정렬된 염기서열의 모든 형질은 ‘unordered’, ‘unweighted’로 설정하였다.
- , 2002). 염기서열 분석은 Clustal X program (Thompson et al., 1997)을 이용하여 실행한 후 육안으로 세부정렬을 최종적으로 확인하였다. 정렬한 염기서열은 PAUP* (Swofford, 2002) 프로그램을 이용하여 분자계통수를 도출하였고, G + C 염기조성을 비교하였다(Table 2).
- : 화판과 악편의 형태 및 모용의 분포는, 석엽표본으로부터 각 분류군마다 가능한 여러 집단(1-6개체)을 선정하여 해부현미경으로 관찰하였으며(Appendix I), 성숙한 화판 및 악편을 채취한 후, 연화제(water : agepon solution = 20 : 1)에 넣어 24시간 이상 담가 조직을 부드럽게 한 후, 다시 FAA (formaldehyde - acetic acid - ethanol)에 고정하였다. 이 후 아세톤시리즈 (acetone series: 50%, 70%, 90%, 100%에서 각 약 30분-1시간 정도 보관)를 거쳐 탈수한 후, 이산화탄소(CO2 gas)를 이용한 임계점 건조 처리(critical point drying; JEOL, SPI-13200JAB, Japan)로 완전히 건조시켰다. 건조된 시료는 알루미늄 스터브(aluminum stub) 위에 올린 다음 이온증착기(ionsputter; JEOL, JFC-1100, Japan)를 이용하여 백금(Pt)으로 이온증착하고, 주사전자현미경(SEM; JEOL, JSM-5200, Japan)으로 가속전력 20kV에서 관찰하고 사진 촬영하였다.
- : DNA추출은 엽병 및 주맥을 제외한 부분을 막자사발에 넣고 DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN, Germany)를 사용하였으며, 모든 과정은 안내서(DNeasy Plant Mini Handbook, 1996; QIAGEN, Germany)를 따라 수행하였다. 추출한 DNA는 일부를 1.5% agarose gel에 전기영동한 뒤 ethidiumbromide (EtBr)로 염색한 후, UV 조명하에서 밴드를 확인하고 Nanophotometer를 이용하여 농도를 확인하였다.
- 건조된 시료는 알루미늄 스터브(aluminum stub) 위에 올린 다음 이온증착기(ionsputter; JEOL, JFC-1100, Japan)를 이용하여 백금(Pt)으로 이온증착하고, 주사전자현미경(SEM; JEOL, JSM-5200, Japan)으로 가속전력 20kV에서 관찰하고 사진 촬영하였다. 화판 및 악편에 분포하는 기공복합체의 수가 많지 않은 관계로, 크기 및 형태는 3개를 최소단위로 측정하였다.
대상 데이터
- : 긴병꽃풀 속내 총 5종(9개체)에 대한 핵 리보솜 DNA의 ITS 염기서열 결정을 수행하기 위해 사용된 DNA 시료는 한국, 중국, 유럽 등지에서 직접 채집하거나 국내외 표본관에 소장된 표본에서 절취한 잎으로부터 각각 추출하였다(Table 1; Holmgren and Holmgren, 1998). 중국의 고유종인 G.
- 외군은 외부 형태적 특징에 의해 긴병꽃풀속과 가장 근연이라고 알려진 Marmoritis Benth.속내 2종(M. complanata, M. decolorans)으로 선정하였다(Hedge, 1990).
데이터처리
- , 1997)을 이용하여 실행한 후 육안으로 세부정렬을 최종적으로 확인하였다. 정렬한 염기서열은 PAUP* (Swofford, 2002) 프로그램을 이용하여 분자계통수를 도출하였고, G + C 염기조성을 비교하였다(Table 2). 또한 형질에 있어서 가중치는 모두 동일하게 처리하였고, 전체 염기서열 중 gap은 모두 결여형질(missing character)로 처리하였으며, 정렬된 염기서열의 모든 형질은 ‘unordered’, ‘unweighted’로 설정하였다.
이론/모형
- 또한 계통수의 각 분계 군(clade)의 신뢰도를 평가하기 위한 부트스트랩 값은 파시모니 분석 방법을 통해 구해졌고(Felsenstein, 1985), Kimura’s two-parameter method (Kimura, 1980)로 계산된 염기변이 값을 기초로 한 Neighbor-joining tree (NJ)를 산출하였다(Saitou and Nei, 1987; Farris et al., 1996).
성능/효과
- : 핵 리보솜 DNA의 ITS 염기서열의 파시모니 분석 결과 2개의 가장 짧은 계통수를 얻었으며, CI (consistency index)는 0.9314, RI (retention index)는 0.9103, RC (rescaled consistency index)는 0.8478을 나타내었다. 분류군간 strict consensus tree에서 긴병꽃풀속 내에서는 3개의 분계조(유럽-미국, 일본, 한국-중국)로 구분 지을 수 있었다.
- 결론적으로 긴병꽃풀속 내의 종간 한계 설정에 있어 화판 및 악의 미세형태형질의 연구보다 핵 리보솜 DNA의 ITS 염기서열에 기초한 분자 계통학적인 연구가 유용한 방법임이 판명되었다. 그러나 구체적인 본 속내 계통 분류학적인 논의를 위해서는 누락된 중국의 고유종 두 분류군을 포함한 확장된 분류군에 대한 조사를 수행하고, 외부 형태학적 형질에 대한 분석을 동시에 수행할 필요가 있으며, 계통학적 유용성이 보다 높은 DNA 구간을 추가로 분석할 필요가 있다.
- 1R)등 모두 5 종류가 관찰되었다(Table 3). 단세포 비선모와 다세포 비선모는 모든 분류군의 화판 안쪽 면에 밀집하여 분포하였으나(Fig. 1C, D, I), G. longituba와 G. hirsuta의 화판 바깥 면에서는 다세포 비선모가 관찰되어지지 않았다(Table 3). 선모의 경우 두상선모는 G.
- 2-3). 따라서 한국산 긴병꽃풀은 중국산 G. longituba와 매우 가까운 유전적 거리를 가지는 분류군으로 판단되나, 화판 및 악의 미세 구조에 따르면 분류군간에 큰 차이를 보이지 않았다(Table 3; Fig. 1). 그러나 본 연구는 소수 분류군만을 대상으로 수행하였기 때문에 보다 정확한 한국산 긴병꽃풀의 분류학적 위치를 증명하기 위해서는 일본 및 중국의 더 많은 분류군이 추가되어야 할 것으로 판단된다.
- 모용(비선모: non-glandular trichome와 선모: glandular trichome)은 단세포 비선모(uni-cellular non-glandular trichome; Fig. 1C-D, I, S), 다세포 비선모(multi-cellular non-glandular trichome; Fig. 1A-B, J), 짧은 자루 두상 선모(short-stalked capitate glandular trichome; Fig. 1K, O), 긴 자루 두상 선모(long-stalked glandular trichome; Fig. 1T), 방패형 선모(peltate glandular trichome; Fig. 1R)등 모두 5 종류가 관찰되었다(Table 3). 단세포 비선모와 다세포 비선모는 모든 분류군의 화판 안쪽 면에 밀집하여 분포하였으나(Fig.
- 정렬된 염기서열 617 bp중 계통학적 분석에 유용한 정보는 55개였다. 분류군간 유전적 거리(pairwise distance)를 계산한 결과는 외군을 제외한 긴병꽃풀속 내 분류군 간에는 0.00-3.22%의 유전적 거리를 보였다(Table 4).
- hirsuta의 화판 바깥 면에서는 다세포 비선모가 관찰되어지지 않았다(Table 3). 선모의 경우 두상선모는 G. sardoa의 화판의 안쪽 및 바깥 면에서 관찰되었으나(Table 3), 모든 분류군의 악에서는 방패형 선모를 포함한 모든 선모가 산재되어 분포하여 종내 진단형질로써의 가치는 보여주지 않았다(Table 3).
- , 1995). 연구된 분류군들의 G + C 염기조성은 ITS 1부분이 64.46-65.98%, ITS 2부분은 65.07-67.14%로 ITS 2부분이 ITS 1부분보다 높은 G+C 염기조성을 보였으며, 5.8S의 경우 55.48-56.77%로 ITS 1, ITS 2부분에 비해 낮은 것으로 나타났다(Table 2). 정렬된 염기서열 617 bp중 계통학적 분석에 유용한 정보는 55개였다.
- 조사된 모든 분류군의 화판의 안쪽 및 바깥쪽의 표피세포의 형태는 유두상(papilate)이며, 각피층이 잘 발달되어 있었고(Fig. 1F), 중간 부분은 다각형의 세포(polygonal cell)가 연결되어 나타나며(Fig. 1G), 하단 부분의 세포구조는 직사각형(rectangular)이었다(Fig. 1H). 악의 표피세포 형태는 안쪽면과 바깥쪽 모두 퍼즐형의 세포들로 구성되어 있었으며(Fig.
- 분류군간 strict consensus tree에서 긴병꽃풀속 내에서는 3개의 분계조(유럽-미국, 일본, 한국-중국)로 구분 지을 수 있었다. 한국과 중국에 분포하는 G. longituba는 89%의 부트스트랩 값으로 단계통군을 형성하였으며, 유럽에 분포하는 G. sardoa와 미국 및 유럽에 분포하는 G. hederacea는 91%의 부트스트랩 값으로 단계통군을 형성하였다(Fig. 2). 북미에 광범위하게 도입되어 분포하는 G.
- 이는 긴병꽃풀속 분류군들이 포복경을 가지고 무성 생식으로 빠르게 번식하는 특이성으로 인하여 유전적인 차이를 보이는 지리적 변이가 나타나지 않은 것으로 판단되나 추가적인 연구에 의해 확인되어져야 할 필요가 있다. 한편, 이탈리아의 고유종으로 기록되어있는 G. sardoa는 핵 리보솜 DNA의 ITS 염기서열이 G. hederacea와 일치하였으나, 화판 및 악에 존재하는 선모와 방패형 선모의 밀도가 긴병꽃풀속내 다른 분류군에 비해 밀집되어 나타나는 것으로 확인되었다(Table 3; Fig. 1M). 이는 이탈리아의 Sardinia 지역과 Corsica 지역에 제한되어 분포하는 생태적인 변이에 의한 결과로 생각된다(Ballero et al.
- grandis로 인식되거나(Suh, 2007), 동종으로 통합기도 한다(Murata and Yamazaki, 1993). 핵 리보솜 DNA의 ITS 염기서열의 결과에서 한국산 긴병꽃풀은 중국산 G. longituba와 함께 89%의 부트스트랩 값을 갖는 단계통군을 이루며 일본의 G. grandis와는 분리되어 나타났다(Figs. 2-3). 따라서 한국산 긴병꽃풀은 중국산 G.
후속연구
- 결론적으로 긴병꽃풀속 내의 종간 한계 설정에 있어 화판 및 악의 미세형태형질의 연구보다 핵 리보솜 DNA의 ITS 염기서열에 기초한 분자 계통학적인 연구가 유용한 방법임이 판명되었다. 그러나 구체적인 본 속내 계통 분류학적인 논의를 위해서는 누락된 중국의 고유종 두 분류군을 포함한 확장된 분류군에 대한 조사를 수행하고, 외부 형태학적 형질에 대한 분석을 동시에 수행할 필요가 있으며, 계통학적 유용성이 보다 높은 DNA 구간을 추가로 분석할 필요가 있다.
- 1). 그러나 본 연구는 소수 분류군만을 대상으로 수행하였기 때문에 보다 정확한 한국산 긴병꽃풀의 분류학적 위치를 증명하기 위해서는 일본 및 중국의 더 많은 분류군이 추가되어야 할 것으로 판단된다.
- hederacea의 개체는 핵 리보솜 DNA의 ITS 지역에서 유럽에 분포하는 종과 유전적 차이를 보여주지 않았으며, 19세기 이후에 유럽에서 북미지역으로 빠르게 확산된 것으로 추정하고 있다(Bllmann and Scholler, 2004). 이는 긴병꽃풀속 분류군들이 포복경을 가지고 무성 생식으로 빠르게 번식하는 특이성으로 인하여 유전적인 차이를 보이는 지리적 변이가 나타나지 않은 것으로 판단되나 추가적인 연구에 의해 확인되어져야 할 필요가 있다. 한편, 이탈리아의 고유종으로 기록되어있는 G.
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