대황(Eisenia bicyclis)은 온대 태평양에 서식하며 우리나라에서는 울릉도 일대에서 주로 발견 되는 갈조류이다. 대황은 칼슘 함량이 가장 높고 요오드, 철, 마그네슘뿐만 아니라 많은 미네랄과 비타민을 포함하고 있다. 본 연구에서는 대황 추출물을 이용하여 세포 수준에서 대황의 골 형성에 미치는 영향을 검토하였다. MTT 분석법에 의한 조골세포 증식률에서는 대황 에탄올 추출물 10 ${\mu}g/ml$ 처리하였을 때 128%의 높은 활성을 나타내었다. 반면 열수추출물 첨가군에서는 에탄올 추출물에 비해 유의적으로 낮은 활성을 나타내었고, 첨가 농도가 증가할수록 감소되는 결과를 보였다. 대황 추출물의 농도에 따른 석회화 형성에 미치는 영향을 검토한 결과, 대황의 에탄올 추출물 1~100 ${\mu}g/ml$의 범위에서 시료를 처리 하지 않은 대조군에 비해 높은 골석회화 형성능을 나타내었다. 또한, 적색의 석회화 형성 부위를 현미경을 통해 관찰한 결과, 대황의 에탄올 추출물을 처리 하였을 때, 시료를 처리하지 않은 대조군 보다 붉은 색의 반점이 많이 형성된 것을 확인할 수 있었다. 한편, ALP 활성에서는 에탄올 추출물 50 ${\mu}g/ml$에서 179% 활성을 나타내었다. 파골세포인 RAW 264.7 세포를 이용하여 세포 증식률을 측정한 결과, 대황 열수추출물의 경우 1~200 ${\mu}g/ml$의 모든 농도에서 대조군과 비교하여 유의적으로 감소하여 파골세포의 증식억제 효과가 나타났다. 파골세포의 분화형태를 측정하고자 TRAP효소 활성을 측정한 결과, 열수 및 에탄올 추출물의 10 ${\mu}g/ml$이상의 농도에서 대조군에 비해 감소하는 경향을 나타내었다. 대황 추출물의 첨가 농도가 증가함에 따라 파골세포의 증식이 감소된 결과와 마찬가지로 파골세포의 분화 지표인자인 TRAP활성 역시 농도가 증가함에 따라 감소함을 알 수 있었다. 이상의 결과, 대황 추출물이 조골세포의 증식, 분화유도와 석회화능을 촉진하고 파골세포의 증식 및 분화를 억제시킨다는 것을 알 수 있었다. 향후 대황 추출물 중의 활성성분들의 규명과 in vivo 연구가 병행된다면 조골세포의 증식과 파골세포의 억제에 관여할 수 있는 기능성 식품의 천연소재로 개발이 가능하리라 사료된다.
대황(Eisenia bicyclis)은 온대 태평양에 서식하며 우리나라에서는 울릉도 일대에서 주로 발견 되는 갈조류이다. 대황은 칼슘 함량이 가장 높고 요오드, 철, 마그네슘뿐만 아니라 많은 미네랄과 비타민을 포함하고 있다. 본 연구에서는 대황 추출물을 이용하여 세포 수준에서 대황의 골 형성에 미치는 영향을 검토하였다. MTT 분석법에 의한 조골세포 증식률에서는 대황 에탄올 추출물 10 ${\mu}g/ml$ 처리하였을 때 128%의 높은 활성을 나타내었다. 반면 열수추출물 첨가군에서는 에탄올 추출물에 비해 유의적으로 낮은 활성을 나타내었고, 첨가 농도가 증가할수록 감소되는 결과를 보였다. 대황 추출물의 농도에 따른 석회화 형성에 미치는 영향을 검토한 결과, 대황의 에탄올 추출물 1~100 ${\mu}g/ml$의 범위에서 시료를 처리 하지 않은 대조군에 비해 높은 골석회화 형성능을 나타내었다. 또한, 적색의 석회화 형성 부위를 현미경을 통해 관찰한 결과, 대황의 에탄올 추출물을 처리 하였을 때, 시료를 처리하지 않은 대조군 보다 붉은 색의 반점이 많이 형성된 것을 확인할 수 있었다. 한편, ALP 활성에서는 에탄올 추출물 50 ${\mu}g/ml$에서 179% 활성을 나타내었다. 파골세포인 RAW 264.7 세포를 이용하여 세포 증식률을 측정한 결과, 대황 열수추출물의 경우 1~200 ${\mu}g/ml$의 모든 농도에서 대조군과 비교하여 유의적으로 감소하여 파골세포의 증식억제 효과가 나타났다. 파골세포의 분화형태를 측정하고자 TRAP 효소 활성을 측정한 결과, 열수 및 에탄올 추출물의 10 ${\mu}g/ml$이상의 농도에서 대조군에 비해 감소하는 경향을 나타내었다. 대황 추출물의 첨가 농도가 증가함에 따라 파골세포의 증식이 감소된 결과와 마찬가지로 파골세포의 분화 지표인자인 TRAP활성 역시 농도가 증가함에 따라 감소함을 알 수 있었다. 이상의 결과, 대황 추출물이 조골세포의 증식, 분화유도와 석회화능을 촉진하고 파골세포의 증식 및 분화를 억제시킨다는 것을 알 수 있었다. 향후 대황 추출물 중의 활성성분들의 규명과 in vivo 연구가 병행된다면 조골세포의 증식과 파골세포의 억제에 관여할 수 있는 기능성 식품의 천연소재로 개발이 가능하리라 사료된다.
The effects of Eisenia bicyclis extracts on osteoblast differentiation and osteoclast formation were investigated. The proliferation of MC3T3-E1 osteoblastic cells was tested in an MTT assay. Treatment with E. bicyclis ethanol extract increased cell proliferation by approximately 128% at a concentra...
The effects of Eisenia bicyclis extracts on osteoblast differentiation and osteoclast formation were investigated. The proliferation of MC3T3-E1 osteoblastic cells was tested in an MTT assay. Treatment with E. bicyclis ethanol extract increased cell proliferation by approximately 128% at a concentration of 10 ${\mu}g/ml$. The ALP activities in the MC3T3-E1 cells was 179% higher when the E. bicyclis ethanol extract was processed at a concentration of 50 ${\mu}g/ml$. The proliferation of RAW 264.7 osteoclastic cells decreased significantly in response to treatment with the E. bicyclis extracts. Moreover, the proliferation of the RAW 264.7 osteoclastic cells treated with E. bicyclis hot water extract decreased by nearly 80%. In addition, the E. bicyclis extract reduced the number of tartrate-resistant acid phosphatase-positive (TRAP+) multinucleated cells from osteoclastic RAW 264.7 cells. These results indicate that E. bicyclis extracts have an anabolic effect on bone through the promotion of osteoclast differentiation and suggest that the extracts could be used in the treatment of common metabolic bone diseases.
The effects of Eisenia bicyclis extracts on osteoblast differentiation and osteoclast formation were investigated. The proliferation of MC3T3-E1 osteoblastic cells was tested in an MTT assay. Treatment with E. bicyclis ethanol extract increased cell proliferation by approximately 128% at a concentration of 10 ${\mu}g/ml$. The ALP activities in the MC3T3-E1 cells was 179% higher when the E. bicyclis ethanol extract was processed at a concentration of 50 ${\mu}g/ml$. The proliferation of RAW 264.7 osteoclastic cells decreased significantly in response to treatment with the E. bicyclis extracts. Moreover, the proliferation of the RAW 264.7 osteoclastic cells treated with E. bicyclis hot water extract decreased by nearly 80%. In addition, the E. bicyclis extract reduced the number of tartrate-resistant acid phosphatase-positive (TRAP+) multinucleated cells from osteoclastic RAW 264.7 cells. These results indicate that E. bicyclis extracts have an anabolic effect on bone through the promotion of osteoclast differentiation and suggest that the extracts could be used in the treatment of common metabolic bone diseases.
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문제 정의
본 연구에서는 대황 추출물을 이용하여 세포 수준에서 대황의 골 형성에 미치는 영향을 검토하고자 조골세포인 MC3T3-E1 세포와 파골세포인 RAW 264.7 세포를 이용하여 조골세포와 파골세포의 증식에 미치는 영향, 파골세포의 활성과 분화인자인 ALP 활성 및 파골세포의 TRAP활성을 검토하였다.
제안 방법
염기성 인산분해 효소(Alkaline phosphatase; ALP)는 거의 모든 조직에 존재하며 특히 골조직에 존재하는 ALP는 골 성장이 활발히 일어날 때 그 활성이 증가한다. 따라서 조골세포활성을 알아보는 biomarker로써 MC3T3-E1 조골세포에서의 ALP 활성을 측정하는 방법이 일반화되어 있으므로[16], 대황 추출물이 ALP 활성에 미치는 영향을 검토하였다.
파골세포의 생성을 위해서는 receptor activator of NF-kB ligand (RANKL)가 필수적인데, 이러한 cytokine이 파골세포의 분화를 유도한다. 따라서 본 연구에서는 미분화된 파골세포 전구세포로부터 파골세포의 생성 및 활성에 미치는 영향을 검토하기 위하여, murine macrophage 유래인 RAW 264.7 세포를 이용하여 분화를 유도하였고, 대황 추출물의 영향을 검토하였다. 대황 추출물이 파골세포의 증식률 또한 세포의 증식과 성장을 알아보는 대표적인 실험 방법인 MTT assay를 이용하여 측정하였다.
대상 데이터
본 실험에서 사용한 대황(Eisenia bicyclis)은 2010년 4월 울릉도 해안 일대에서 채취된 것을 세척, 자연 건조 후 분쇄하여 판매하는 것을 구입하였다. 분말시료에 각각 10배량(w/v)의 80% ethanol 혹은 3차 증류수를 첨가한 후, 80℃에서 4시간 동안 추출을 수행하였으며, 추출액을 지름 200 mm의 여과지(Advantec, Japan)를 이용하여 2회 여과한 후, rotary vacuume vaporator (R-200, Buchi, Switzerland)로 농축하여 농축된 추출액을 동결건조장치(FD8518, Ilshin BioBase, Korea)를 이용하여 동결건조 후 추출물을 얻었다.
한국세포주은행에서 분양 받은 RAW 264.7 세포는 10% FBS와 1% antibiotics를 포함한 DMEM 배지를 이용해 배양하였다. 세포는 37℃, 5%의 CO2 incubator에서 70~80% 증식되었을 때, 2~3일 간격으로 계대 배양하면서 실험에 사용하였다.
한국세포주은행에서 분양 받은 mouse calvaria osteoblast cell인 MC3T3-E1 세포는 10% FBS와 1% antibiotics를 포함한 α-MEM 배지에서 37℃, 5%의 CO2 incubator에서 2～3일 마다 배지를 교환하면서 실험에 사용하였으며, 분화유도를 위해 5mM β-glycerol phosphate와 50 mg/ml의 vitamin C를 첨가하여 분화유도배지로 사용하였고, 7일에서 14일 동안 3일마다 배지를 교환하였다.
데이터처리
본 실험에 대한 모든 실험의 결과는 mean ± SD 치로 나타내었고, 통계적 유의성은 SPSS version 17.0 통계 프로그램을 이용하여 상호비교 하였다. 집단 간의 차이를 알아보기 위해 일원변량분석(one-way ANOVA)를 이용하여 분석하였고, 사후검증은 Tukey’s 및 Duncan`s multiple range test에 의해 p<0.
0 통계 프로그램을 이용하여 상호비교 하였다. 집단 간의 차이를 알아보기 위해 일원변량분석(one-way ANOVA)를 이용하여 분석하였고, 사후검증은 Tukey’s 및 Duncan`s multiple range test에 의해 p<0.05 수준에서 각 실험군 간의 유의성을 검증하였다.
이론/모형
7 세포를 이용하여 분화를 유도하였고, 대황 추출물의 영향을 검토하였다. 대황 추출물이 파골세포의 증식률 또한 세포의 증식과 성장을 알아보는 대표적인 실험 방법인 MTT assay를 이용하여 측정하였다.
세포의 증식은 MTT assay 방법[33]을 사용하여 측정하였다. 배양한 MC3T3-E1와 RAW 264.
성능/효과
대황 추출물을 농도별(1, 10, 50, 100 μg/ml)로 처리한 결과, 모든 농도에서 열수 및 에탄올 추출물 모두 시료를 처리 하지 않은 대조군보다 높은 ALP 활성을 나타내었다(Fig. 4).
파골세포의 분화형태를 측정하고자 TRAP 효소 활성을 측정한 결과, 열수 및 에탄올 추출물의 10 μg/ml이상의 농도에서 대조군에 비해 감소하는 경향을 나타내었다. 대황 추출물의 첨가 농도가 증가함에 따라 파골세포의 증식이 감소된 결과와 마찬가지로 파골세포의 분화 지표인자인 TRAP활성 역시 농도가 증가함에 따라 감소함을 알 수 있었다. 대황은 주요성분으로서 tannin, phlorotannin과 같은 polyphenol 화합물을 함유하고 있으며 이들에 대한 항염증과 항산화 작용에 대한 다양한 연구가 보고되어 있다[15].
2에 나타내었다. 대황의 에탄올 추출물은 1~100 μg/ml의 범위에서 시료를 처리 하지 않은 대조군에 비해 높은 골석회화 형성능을 보였으며 농도가 높아지면서 활성이 감소하는 경향을 나타내었다. 특히, 에탄올 추출물 50 μg/ml로 처리 하였을 때 110%가 넘는 골석회화 형성능을 나타내었다.
본 연구의 대황 에탄올 추출물을 50 μg/ml 첨가하였을 때 170% 이상의 활성으로 톳의 에탄올 분획물보다 훨씬 높은 활성이 있음을 나타내었다. 따라서 대황 추출물이 조골세포의 ALP의 발현을 증가시켜 조골세포의 분화에 영향을 줄 가능성을 제시하였다.
본 실험 결과, 대황 열수추출물의 경우 1~200 μg/ml의 모든 농도에서 대조군과 비교하여 유의적으로 감소하여 파골세포의 증식 억제 효과가 나타났다. 한편, 에탄올 추출물의 경우 10 및 200 μg/ml의 농도에서만 증식 억제 효과가 나타나, 열수추출물만큼의 효과는 나타나지 않았다.
조골세포 증식과 관련한 갈조류의 연구에서 김[16]에 의하면 패추출물이 대조군과 비교하여 유의적으로 증가하였고, 패 에탄올 추출물을 50 μg/ml로 처리하였을 때 138%로 높은 증식률을 나타내었다는 보고가 있다. 본 연구에서는 패 에탄올 추출물 처리했을 때보다 증식률이 낮은 값을 나타내었으나, 10 μg/ml의 낮은 농도로 대조군에 비해 매우 높은 증식률을 나타냄을 확인 할 수 있다. 또 다른 연구에 의하면, 갈조류 종류인 톳의 에탄올 분획물을 첨가하였을 때에는 최고 120% 정도의증식유도 효과가 나타났다는 보고가 있다[13].
폴리페놀류들이 파골 세포의 분화에 미치는 영향에 대한 연구들을 보면 콩의 genistein, daidzen 같은 이소플라본의 파골세포 분화 억제 효과와 quercetin, kaempferol, tannin 등의 파골세포 apoptosis 유도 효과 등이 있다[14]. 이러한 연구로 미루어 보아 대황에 존재하는 폴리페놀 물질이 조골세포의 증식 및 파골세포의 분화억제 효과를 보이는 것으로 유추 할 수 있다.
이상으로 대황의 에탄올 추출물이 열수 추출물보다 높은 골 석회화능을 나타내었으며, 이를 바탕으로 조골세포의 활발한 골 형성 지표인 ALP 활성이 대황 추출물로 인해 어떤 영향을 미치는지를 검토하기 위하여 다음의 실험을 수행하였다.
이상의 결과, 대황 추출물이 조골세포의 증식, 분화유도와 석회화능을 촉진하고 파골세포의 증식 및 분화를 억제시킨다는 것을 알 수 있었다. 앞으로 활성성분들의 규명과 in vivo연구가 병행된다면 골다공증 예방과 관련된 기능성 식품의 천연소재로 개발이 가능하리라 사료된다.
또 다른 연구에 의하면, 갈조류 종류인 톳의 에탄올 분획물을 첨가하였을 때에는 최고 120% 정도의증식유도 효과가 나타났다는 보고가 있다[13]. 이에 비해 대황 에탄올 추출물은 보다 높은 증식률을 나타내고 있으므로 대황 추출물이 조골세포 증식유도에 효과적인 영향을 미치는 것을 확인할 수 있었다.
파골세포의 분화형태를 측정하고자 TRAP 효소 활성을 측정한 결과, 열수 및 에탄올 추출물의 10 μg/ml이상의 농도에서 대조군에 비해 감소하는 경향을 나타내었다. 대황 추출물의 첨가 농도가 증가함에 따라 파골세포의 증식이 감소된 결과와 마찬가지로 파골세포의 분화 지표인자인 TRAP활성 역시 농도가 증가함에 따라 감소함을 알 수 있었다.
후속연구
이상의 결과, 대황 추출물이 조골세포의 증식, 분화유도와 석회화능을 촉진하고 파골세포의 증식 및 분화를 억제시킨다는 것을 알 수 있었다. 앞으로 활성성분들의 규명과 in vivo연구가 병행된다면 골다공증 예방과 관련된 기능성 식품의 천연소재로 개발이 가능하리라 사료된다.
한편, 에탄올 추출물의 경우 10 및 200 μg/ml의 농도에서만 증식 억제 효과가 나타나, 열수추출물만큼의 효과는 나타나지 않았다. 조골세포의 경우 증식 및 분화에서 에탄올 추출물을 첨가하였을 때 그 활성이 유의적으로 촉진되었으나 파골세포의 경우 일부분 조골세포와는 다른 결과가 나타나 향후 구체적인 성분 분석 및 메커니즘 규명이 이루어져야 할 것으로 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
폐경기 여성의 골다공증 치료법으로 사용되는 방법은?
조골세포에 의한 골 형성이 감소하고 파골세포로 인한 골 흡수 증가시 골다공증이 유발되는데, 특히 폐경기 여성에게서 그 위험성이 보고되었다[31]. 그 치료법은 estrogen (에스트로겐) 투여가 기본적으로 사용되고 있다[23]. 이 치료법은 폐경기간이나 나이에 관계없이 골량 증가의 효과가 있고 척추 및 고관절골절의 예방효과가 뛰어난 것으로 알려져 있다.
대황(Eisenia bicyclis)은 무엇인가?
대황(Eisenia bicyclis)은 온대 태평양에 서식하며 우리나라에서는 울릉도 일대에서 주로 발견 되는 갈조류이다. 대황은 칼슘 함량이 가장 높고 요오드, 철, 마그네슘뿐만 아니라 많은 미네랄과 비타민을 포함하고 있다.
대황에 함유된 영양소는?
대황(Eisenia bicyclis)은 온대 태평양에 서식하며 우리나라에서는 울릉도 일대에서 주로 발견 되는 갈조류이다. 대황은 칼슘 함량이 가장 높고 요오드, 철, 마그네슘뿐만 아니라 많은 미네랄과 비타민을 포함하고 있다. 본 연구에서는 대황 추출물을 이용하여 세포 수준에서 대황의 골 형성에 미치는 영향을 검토하였다.
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