포도잎으로부터 분리된 Quercetin-3-O-glucuronide의 LPS로 유도된 BV2 미세아교세포에서의 항염증 효과 Anti-neuroinflammatory Effects of Quercetin-3-O-glucuronide Isolated from the Leaf of Vitis labruscana on LPS-induced Neuroinflammation in BV2 Cells원문보기
Grapes has long been used for food, and reported as containing polyphenol which has antioxidant and anti-cancer effects. Neuroinflammation is chronic inflammation at the brain, lead to neurodegenerative diseases. In this study, quercetin-3-O-glucuronide (QG) isolated from the leaf of Vitis labruscan...
Grapes has long been used for food, and reported as containing polyphenol which has antioxidant and anti-cancer effects. Neuroinflammation is chronic inflammation at the brain, lead to neurodegenerative diseases. In this study, quercetin-3-O-glucuronide (QG) isolated from the leaf of Vitis labruscana has anti-neuroinflammatory effects. QG were investigated using MTT assay, western blot, nitric oxide (NO) assay, prostaglandin $E_2$ ($PGE_2$) assay, cytokine assay in lipopolysaccharide (LPS)-induced inflammation in BV2 cells. QG dose-dependently attenuated the expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS) and cyclooxygenase-2 (COX-2), accordingly inhibited the production of NO and $PGE_2$. QG decreases the levels of proinflammatory cytokine such as tumor necrosis factor-${\alpha}$ (TNF-${\alpha}$), interlukin-$1{\beta}$ (IL-$1{\beta}$). Thereby, QG may offer therapeutic potential for treatment of neurodegenerative disease related to neuroinflammation.
Grapes has long been used for food, and reported as containing polyphenol which has antioxidant and anti-cancer effects. Neuroinflammation is chronic inflammation at the brain, lead to neurodegenerative diseases. In this study, quercetin-3-O-glucuronide (QG) isolated from the leaf of Vitis labruscana has anti-neuroinflammatory effects. QG were investigated using MTT assay, western blot, nitric oxide (NO) assay, prostaglandin $E_2$ ($PGE_2$) assay, cytokine assay in lipopolysaccharide (LPS)-induced inflammation in BV2 cells. QG dose-dependently attenuated the expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS) and cyclooxygenase-2 (COX-2), accordingly inhibited the production of NO and $PGE_2$. QG decreases the levels of proinflammatory cytokine such as tumor necrosis factor-${\alpha}$ (TNF-${\alpha}$), interlukin-$1{\beta}$ (IL-$1{\beta}$). Thereby, QG may offer therapeutic potential for treatment of neurodegenerative disease related to neuroinflammation.
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문제 정의
19,20) 이 중 NO와 PGE2는 염증 유발 인자인 TNF-α, IL-1α, LPS 등에 의해 발현되는 inducible nitric oxide synthase(iNOS)와 cyclooxygenase2(COX-2)에 의해 생성되므로 이들 단백질 조절이 염증의 조절에 중요한 기전으로 인식되고 있다.21) 따라서, 본 논문에서는 포도잎으로부터 분리한 quercetin-3-O-glucuronide의 LPS로 유도된 BV2 세포에서 항염증 효과에 대한 연구를 진행하고자 하였다.
본 연구에서는 포도잎 추출물에서 분리한 QG의 항염증 효과를 확인하고자 하였고, 그 결과 QG는 유의적인 항염증 효과를 나타냈다. QG는 iNOS와 COX-2의 발현 억제와, 그의 부산물인 NO, PGE2의 생성을 억제시켰고, TNF-α, IL-1β와 같은 사이토카인의 생성을 억제하는 뚜렷한 항염증 효과를 나타냈다.
제안 방법
, EtOAc, BuOH 분획물을 BV2세포에서 NO assay 결과 BuOH 분획물에서 NO 억제 효과를 나타내어 BuOH 분획물의 분리를 진행하였다. BuOH 분 획물 2.1g을 Sephadex LH-20 column chromatography, reverse phase(RP-18) column chromatography 이용하여 순수한 화합물 quercetin-3-O-glucuronide을 얻었고, QG의 1H NMR과 13C NMR을 측정한 후 선행 문헌28,29)과의 비교를 통해 구조를 동정하였다(Fig. 1A). QG를 이용한 포도잎 추출물의 HPLC 정량실험에서 추출물에 QG가 0.
EIA에 의한 PGE2 측정 − PGE2의 측정은 항체(lyophilized prostaglandin E2 conjugate to horseradish peroxidase)를 사용하여 prostglandin E2 enzymeimmunoassay system(EIA, Amersham Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ)을 이용하였다.
HPLC 측정 시 QG는 각각 10 µl씩 주입하였고, 5%-50%-100%(v/v) AcN을 용매기울기법으로 측정하였다.
흡광도는 BioRad사의 Microplate Reader 를 이용하여 측정하였다. NMR 스펙트럼은 JEOL JNM ECP-400 spectrometer(400 MHz for 1H and 100 MHz for 13C)기기로 DMSO-d6와 CD3OD 용매를 이용하여 측정하였다. HPLC는 Younglin사의 YOUNGLIN-YL9100 기기를 통하여 측정하였고, column은 SHISHIDO사의 CAPCELL PAK C18 (4.
Nitrite Assay − 배양된 세포를 5×105 cells/well 수준으로 96 well plate에 100 µl 씩 접종한 다음 24시간 동안 배양하고, 24시간 후 medium을 제거한 후 DMEM으로 희석된 각 농도별 시료 처리 후 LPS(1 µg/ml)를 처리하여 24시간 후 세포에서 media로 분비되어 나온 NO의 양을 Griess시약 (0.1%(w/v) N-(1-naphathyl)-ethylenediamine and 1%(w/v) sulfanilamide in 5%(v/v) phosphoric acid)을 사용하여 반응 하였다.
QG의 BV2 세포에서의 독성은 MTT assay를 통해 확인하였고, QG를 농도별로 BV2 미세아교세포에 처리 하였을 때, 세포 독성을 나타내지 않은 10, 20, 40, 80 µM을 실험 가능한 농도로 정하여 실험을 진행하였다(Fig. 1B).
TNF-α and IL-1β assay − TNF-α와 IL-1β의 측정은 항체(lyophilized TNF-α or IL-1β conjugate to horseradish peroxidase)를 사용하여 enzymeimmunoassay system kit (R&D Systems, Abingdon, UK)을 이용하여 측정 하였다.
Western Blot Analysis − BV2 세포를 60 mm dish에 3×105 cells/well 밀도로 24시간 배양한 후 각각의 시료를 농도별로 처리하였다.
, EtOAc, BuOH 순으로 분획한 후 각 분획들을 감압 농축하여 용매를 휘발시킨 뒤 무게를 측정하였다. n-hexane (1.1 g), CH2Cl2 (0.7 g), EtOAc (0.9 g), BuOH (2.1 g), H2O (9.3 g)을 얻었고, BuOH 분획물 2.1 g을 SephadexLH20 column chromatography를 이용하여 80%와 100% MeOH의 용매 조건으로 순차적인 분획을 나누어 4가지 분획물을 얻고 감압 농축하였다. 3번째 분획물 0.
기존의 배지를 제거하고 새로운 배지를 넣어준 후 DMSO에 녹인 시료를 다양한 농도(10, 20, 40, 80 µM)로 DMEM 배지에 희석하여 첨가하였다.
다음으로, BV2 미세아교세포에 QG를 10, 20, 40, 80 µM로 처리한 후, 3시간 동안 incubator에 배양하고 LPS 1 µg/ml 을 처리하였고, 24시간 후에 NO와 PGE2의 생성을 확인하였다.
다음으로는 BV2 미세아교세포에 QG를 10, 20, 40, 80 µM로 처리한 후, 3시간 동안 incubator에 배양하고 LPS 1 µg/ml을 처리하여, 염증 반응에서 생성되는 사이토카인 TNF-α, IL-1β들을 측정하였다.
BV2 세포에 RIPA buffer를 첨가한 다음, 4℃, 14,000×g에서 25분간 원심분리하고 상등액을 튜브에 옮겼다. 단백질 정량은 BSA 단백질 실험 키트를 이용하였고 각각의 시료를 12% SDS-polyacrylamide gel에서 영동하고 nitrocellulose membrane(NC membrane)으로 전사하였다. 전사된 NC membrane을 5% 무지방유가 포함된 신선한 blocking buffer(0.
먼저 BV2 미세아교세포에 QG를 10, 20, 40, 80 µM로 3시간 동안 전 처리한 후, LPS 1 µg/ml을 처리하고 24시간 후에 iNOS와 COX-2의 발현 정도를 Western blot을 통해 관찰하였다.
본 연구에서는 선행연구를 통해 포도잎 추출물이 LPS로 자극한 BV2 세포에서 NO의 생성을 억제하는 효과가 있음을 확인하였고, 이 결과를 바탕으로 추출물 14 g을 분획하여 얻은 n-Hexane, CH2Cl2, EtOAc, BuOH 분획물을 BV2세포에서 NO assay 결과 BuOH 분획물에서 NO 억제 효과를 나타내어 BuOH 분획물의 분리를 진행하였다. BuOH 분 획물 2.
세포 배양 − BV2 미세아교세포(5×105 cells/well)를 10% heat-inactivated FBS, penicillin G (100 IU/ml), streptomycin (100 µg/ml), L-glutamine (2 mM)을 함유한 DMEM 배지에 분주하고 5% CO2 배양기 내에서 37°C의 온도로 배양하였다.
여기서 Y는 HPLC를 UV/vis 330 nm에서 분석한 peak area이며, X는 QG의 양을 의미한다. 얻어진 검량선을 이용하여 포도 잎 추출물에서의 QG의 농도를 구한 후, 함량을 %(w/w)로 환산하였다.
포도 잎 추출물로부터 QG의 분리 및 NMR Analysis −포도잎 추출물 14 g을 증류수로 현탁 시킨 후 n-hexane, CH2Cl2, EtOAc, BuOH 순으로 분획한 후 각 분획들을 감압 농축하여 용매를 휘발시킨 뒤 무게를 측정하였다.
74% 함유되어 있음을 확인하였다. 포도잎으로부터 분리한 QG가 미세아교세포에서 항염증 효과를 갖는지 검색하기 위해, LPS로 유도된 BV2 미세아교세포에서의 염증 관련 인자들을 측정하였다. QG의 BV2 세포에서의 독성은 MTT assay를 통해 확인하였고, QG를 농도별로 BV2 미세아교세포에 처리 하였을 때, 세포 독성을 나타내지 않은 10, 20, 40, 80 µM을 실험 가능한 농도로 정하여 실험을 진행하였다(Fig.
1B). 항염증 효과를 검색하기 위해서 LPS로 유도한 BV2 세포에서 iNOS, COX-2 단백질의 발현과 이에 따라 나오는 부산물인 NO, PGE2의 생성을 측정하였다. 먼저 BV2 미세아교세포에 QG를 10, 20, 40, 80 µM로 3시간 동안 전 처리한 후, LPS 1 µg/ml을 처리하고 24시간 후에 iNOS와 COX-2의 발현 정도를 Western blot을 통해 관찰하였다.
96-Well tissue culture plates와 기타 tissue culture dishes는 Nunc사 제품을 이용하였다. 흡광도는 BioRad사의 Microplate Reader 를 이용하여 측정하였다. NMR 스펙트럼은 JEOL JNM ECP-400 spectrometer(400 MHz for 1H and 100 MHz for 13C)기기로 DMSO-d6와 CD3OD 용매를 이용하여 측정하였다.
대상 데이터
L-glutamate, Trolox와 3'-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)는 Sigma사에서 구입하였다. 96-Well tissue culture plates와 기타 tissue culture dishes는 Nunc사 제품을 이용하였다. 흡광도는 BioRad사의 Microplate Reader 를 이용하여 측정하였다.
HPLC는 Younglin사의 YOUNGLIN-YL9100 기기를 통하여 측정하였고, column은 SHISHIDO사의 CAPCELL PAK C18 (4.6 mmI.D×250 mm, 5 µm-particle size)를 이용하였다.
실험재료 − 본 실험에 사용된 포도잎은 2013년 전북 김제시 백구면 지역의 포도 재배 농가에서 재배된 것을 채취 후 건조하여 사용하였으며, 원광대학교 자원식물원 장규관교수에게 의뢰하여 동정하였다.
데이터처리
, San Diego, CA)을 사용하였다. 각 실험군 간의 결과는 평균치와 표준오차로 나타내었으며, 각 실험군 간의 결과는 ANOVA test를 사용하여 분석하고 유의적인 차이가 있는 항목에 대해서만 검정하였다. 실험군 간의 차이는 95% 수준(p<0.
형성된 formazan의 각 well에 DMSO 20 µl를 첨가한 후 orbital shaker를 이용하여 녹이고, 30분 후 595 nm 에서 흡광도를 측정하였다. 실험은 3회 반복 실시하여 평균값을 구하였으며, control의 흡광도 값을 기준으로 세포 생존율을 비교하였다.
통계처리 − 본실험의 통계처리는 GraphPad Prism, version 3.03(GraphPad Software Inc., San Diego, CA)을 사용하였다.
이론/모형
세포 독성 − 본 실험에서 BV2 미세아교세포에 대한 세포 독성 및 실험 시 처리 농도를 결정하고, QG의 세포독성을 측정하기 위해 MTT assay를 사용하였다.
성능/효과
)의 세 종류로 크게 나눌 수 있다.1) 포도 잎은 맛이 시고 떫어서 식용으로 사용하지 않다가, 최근 웰빙에 대한 관심이 높아지며 식용으로 쓰이려는 시도가 나타나고 있으며, 항산화 작용과, 항당뇨 효과 또한 발표되었다.2) 중동이나 동·서 유럽에서는 포도잎을 절임이나 통조림으로 조제하여 식용으로 이용하고 있고, 그리스에서는 포도잎을 이용한 전통 음식이 개발되어 소비되고 있다.
14) 뇌와 척수의 신경세포들은 그 위치에 따라 매우 다양한 기능을 하고 있으며, 중추신경계(central nerve system, CNS)에 존재하는 미세아교세포(microglial)는 뇌의 염증, 면역과 퇴행성에 중요한 역할을 하므로, 이 세포에서 발생되는 염증 반응을 조절하여 퇴행성 뇌질환을 막을 수 있다.15) 미세아교세포가 활성화되면 약물이나 독소에 의한 이물질을 제거하고 신경 성장 인자를 분비하여 신경세포를 보호 및 CNS의 항상성 유지하는데 중요한 역할을 한다.
본 연구에서는 포도잎 추출물에서 분리한 QG의 항염증 효과를 확인하고자 하였고, 그 결과 QG는 유의적인 항염증 효과를 나타냈다. QG는 iNOS와 COX-2의 발현 억제와, 그의 부산물인 NO, PGE2의 생성을 억제시켰고, TNF-α, IL-1β와 같은 사이토카인의 생성을 억제하는 뚜렷한 항염증 효과를 나타냈다. 이러한 결과와 선행 연구들을 토대로 포도잎과 그 주요 성분인 QG는 앞으로 퇴행성 뇌질환 약물이나 항염증제로 개발 가능할 것으로 사료된다.
1A). QG를 이용한 포도잎 추출물의 HPLC 정량실험에서 추출물에 QG가 0.74% 함유되어 있음을 확인하였다. 포도잎으로부터 분리한 QG가 미세아교세포에서 항염증 효과를 갖는지 검색하기 위해, LPS로 유도된 BV2 미세아교세포에서의 염증 관련 인자들을 측정하였다.
후속연구
QG는 iNOS와 COX-2의 발현 억제와, 그의 부산물인 NO, PGE2의 생성을 억제시켰고, TNF-α, IL-1β와 같은 사이토카인의 생성을 억제하는 뚜렷한 항염증 효과를 나타냈다. 이러한 결과와 선행 연구들을 토대로 포도잎과 그 주요 성분인 QG는 앞으로 퇴행성 뇌질환 약물이나 항염증제로 개발 가능할 것으로 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
포도는 무엇인가?
포도는 갈대나무목(Rhamnales) 포도과(Vitaceae)에 속하는 목본성 덩굴 식물로, 포도과에는 11 속, 700 여종의 포도가 있다. 포도는 대체로 아시아, 지중해군에 속하는 유럽종(Vitis vinifera L.
포도 잎의 효능에 관해서 어떤 연구가 발표되었는가?
)의 세 종류로 크게 나눌 수 있다.1) 포도 잎은 맛이 시고 떫어서 식용으로 사용하지 않다가, 최근 웰빙에 대한 관심이 높아지며 식용으로 쓰이려는 시도가 나타나고 있으며, 항산화 작용과, 항당뇨 효과 또한 발표되었다.2) 중동이나 동·서 유럽에서는 포도잎을 절임이나 통조림으로 조제하여 식용으로 이용하고 있고, 그리스에서는 포도잎을 이용한 전통 음식이 개발되어 소비되고 있다.
포도에는 어떤 성분들이 함유되어 있는가?
3) 그러나 우리나라에서는 포도잎에 함유된 생리 활성 성분에 대한 연구가 미흡하며 국민들의 인식이 낮아 포도 재배 시 수확량과 당도를 높이기 위한 순따기를 통해 대부분 폐기되고 있는 실정이다.4) 포도에는 당분과 무기질이 다량으로 함유되어 있고, 대표적인 성분으로 잘 알려진 레스 베라트롤(resveratrol), 안토시아닌(anthocyanin)계, 탄닌(tannin) 계, 쿼세틴(quercetin)계 등의 폴리페놀(polyphenol) 성분을 함유하는 것으로 알려져 있다.5,6) 포도의 다양한 폴리페놀 성분은 항암, 항산화, 항노화에 효과가 있는 것으로 알려져 있으며,7,8) 특히 레스베라트롤은 항산화, 항염증, 혈관보호, 항암 효과가 있다고 보고되어 있다.
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