[논문]쓴쑥 지상부의 화학성분과 RAW264.7 및 BV2 미세아교세포에서 Nitric Oxide 생성 억제효과

고해주; 이환; 이동성; 우은란

쓴쑥 지상부의 화학성분과 RAW264.7 및 BV2 미세아교세포에서 Nitric Oxide 생성 억제효과
Chemical Constituents from the Aerial Parts of Artemisia absinthium and Its Inhibitory Effects of Nitric Oxide Production in RAW264.7 and BV2 Microglia 원문보기

생약학회지, v.49 no.1, 2018년, pp.1 - 6

고해주 (조선대학교 약학대학) , 이환 (조선대학교 약학대학) , 이동성 (조선대학교 약학대학) , 우은란 (조선대학교 약학대학)

Abstract ▼ AI-Helper

Six compounds, eupatilin (1), dammaradienyl acetate (2), glutinol acetate (3), $3{\beta}-acetoxyoleanan-12-one$ (4), taraxasterol (5) and quercetin-3,4'-dimethyl ether (6) were isolated from the aerial parts of Artemisia absinthium. The chemical structures of compounds 1-6 were determined by the basis of physico-chemical properties and spectroscopic methods such as 1D and 2D NMR. Among them, compounds 2-5 were isolated from this plant for the first time. The inhibitory effects of these isolated compounds against nitric oxide (NO) production in LPS-induced RAW264.7 cells or BV2 microglia were also examined. Among the tested compounds, compound 1, eupatilin, inhibited the production of NO in LPS-induced RAW264.7 cells and BV2 microglia, respectively.

주제어

표/그림 (3)

그림 Fig. 1. Chemical structures of compounds 1-6 from A. absinthium
표 Table I. Effects of compounds 1-6 from A. absinthium on NO production with IC₅₀ values in LPS-induced RAW264.7 cells. Cells were pre-treated for 3 hr with compounds 1-6 and stimulated 24 hr with LPS (1 μg/ml). Butein was used as a positive control
표 Table II. Effects of compounds 1-6 from A. absinthium on NO production with IC₅₀ values in LPS-induced BV2 microglia. Cells were pre-treated for 3 hr with compounds 1-6 and stimulated 24 hr with LPS (1 μg/ml). Butein was used as a positive control

AI 본문요약
AI-Helper

* AI 자동 식별 결과로 적합하지 않은 문장이 있을 수 있으니, 이용에 유의하시기 바랍니다.

제안 방법

13C-NMR 스펙트럼에서 δ 78.5에서 수산기의 존재를, δ 142.0, 119.8의 피크로 이중결합의 존재를,δ 170.9, 21.2의 피크로 아세테이트기의 존재를 각각 확인하였다.
17)본 연구에서는 쓴쑥에서 분리된 6종 화합물의 NO생성 억제 효과를 RAW264.7 대식세포와 BV2 미세아교세포에서 탐색하였다. 먼저, 쓴쑥에서 분리된 6종의 화합물을 RAW264.
CH2Cl2 분획 19 g에 대해 실리카젤 컬럼 크로마토그라피(Hexane:EtOAc=20:1→1:1, CHCl3:EtOAc=10:1→5:1, CHCl3:MeOH=10:1→1:1)를 실시하여 36개의 소분획(D-1, D-2 … D-36)을얻었다.
7 대식세포(Table I)와 BV2 미세아교세포(Table II)에서 NO생성 억제효과를 보였다. Eupatilin(1)의 NO생성억제 IC₅₀ 값을 각각의 세포에서 확인하였다(Table I and II). Eupatilin(1)의 RAW264.
RAW264.7대식세포와 BV2 미세아교세포(5×105 cells/well)를 10% heat-inactivated FBS, penicillin G(100 IU/ml), streptomycin(100 μg/ml), L-glutamine(2 mM)을 함유한 DMEM배지에 분주하고 5% CO2 배양기내에서 37oC의 온도로 배양하였다.
기기 및 시약 − 융점측정기는 Fisher Scientific(Model 307N0043, Canada)를 사용하였고 선광도는 AUTOPOL®automatic polarimeter(Rudolph Research Flangers, NJ07836, U.S.A.)를 사용하였으며 IR 스펙트럼은 JASCO FT/IR-300E(JASCO Co., Japan)를 사용하였다.
기존의 배지를 제거하고 새로운 배지를 넣어준 후 DMSO에 녹인 시료를 다양한 농도(1-40 µM)로 DMEM 배지에 희석하여 첨가하였다.
이들 화합물중 triterpene계 화합물인 2-5는 쓴쑥에서 처음으로 분리된 화합물들이다. 또한, 분리된 6종의 화합물에 대해 RAW264.7 대식세포와 BV2 미세아교세포에서 NO억제 효과를 탐색하였다.
본 연구에서는 쓴쑥의 메탄올 추출물을 용매분획한 후 얻어 진 CH2Cl2 분획에 대해 실리카겔, RP-18, MCI-gel등의컬럼충진제를 이용한 컬럼 크로마토그래피를 반복적으로 수행하여 6종의 화합물 eupatilin(1), dammaradienyl acetate(2), glutinol acetate(3), 3β-acetoxyoleanan-12-one(4), taraxasterol(5), quercetin-3,4'-dimethyl ether(6)을 분리, 동정하였다.
성분연구가 미흡한 쓴쑥(A. absinthium)의 지상부로부터 6종의 성분들을 단리하여 각각 eupatilin(1), dammaradienyl acetate(2), glutinol acetate(3), 3β-acetoxyoleanan-12-one(4),taraxasterol(5), quercetin-3,4'-dimethyl ether(6)으로 동정하였다.
7대식세포와 BV2 미세아교세포에 농도별(1-40 μM)로 48시간 처리하였고, 6종의 화합물 모두가 40 μM까지 세포 독성이 없음을 확인하였다(Data not shown). 이에 RAW264.7 대식세포와 BV2 미세아교세포에 쓴쑥에서 분리된 6종의 화합물을 처리하고 LPS로 24시간동안 염증반응을 유발한 후 NO생성 억제여부를 측정하였다. 그 결과 6종 가운데 eupatilin(1)만 RAW264.
EI-MS 스펙트럼에서는 분자이온이 m/z 468[M]⁺에 나타났다. 이와 같은 모든 data를 종합하고 기존에 보고된 문헌과 비교하여 화합물 2는 dammaradienyl acetate 로 동정하였다.¹⁰⁾
EI-MS스펙트럼에서는 분자이온이 m/z 468[M]⁺에나타났다. 이와 같은 모든 data를 종합하고 기존에 보고된 문헌과 비교하여 화합물 3은 glutinol acetate로 확인 동정하였다.^11,12)

대상 데이터

, Japan)를 사용하였다. ESI-MS는 JMS 700(JEOL, Japan)을 사용하였고 ¹H-NMR과 ¹³C-NMR은 Varian Unity Inova 500(KBSI-광주분원) 및 JEOL JNM-LA 300을 사용하였다. 분취용 컬럼 크로마토그라피의 충진제로는Kieselgel 60(63-200 µm, Art.
분취용 컬럼 크로마토그라피의 충진제로는Kieselgel 60(63-200 µm, Art. 7734, Merck), Kieselgel60(40-63 µm, Art. 9385, Merck), Sephadex LH-20(Beads size 25-100 µm, Sigma), MCI gel CHP20P(75-150 µm, Mitsubishi Chemical Co.)을 사용하였다.
세포 배양 − RAW264.7 대식세포는 ATCC에서 동결상태로 구입하였고, BV2 미세아교세포는 원광대학교 약학대학 김윤철 교수님으로부터 분양 받아 사용하였다.
실험재료 − 본 실험에 사용한 쓴쑥(Aretemisia absinthiumL.)은 조선대학교 약학대학 약초원에서 채취하여 전문가(우은란 교수, 조선대 약학과)의 동정과정을 거쳐 사용하였으며, 표본은 조선대학교 약학대학 표본실에 보관하고 있다.

데이터처리

, San Diego, CA, USA)을 사용하였다. 각 실험군간의 결과는 평균치와 표준오차로 나타냈으며, 각 실험군간의 결과는 ANOVA test를 사용하여 분석하고 유의적인 차이가 있는 항목에 대해서만 검정하였다
형성된 formazan의 각 well에 DMSO 20 μl를 첨가한 후 orbital shaker를 이용하여 녹이고, 30분 후 595 nm에서 흡광도를 측정하였다. 실험은 3회 반복 실시하여 평균값을 구하였으며, 대조군의 흡광도 값을 기준으로 세포 생존율을 비교하였다.
통계처리 − 본 실험의 통계처리는 GraphPad Prism, version 3.03(GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA)을 사용하였다.

이론/모형

세포 독성 − 본 실험에서 RAW264.7 대식세포와 BV2 미세아교세포에 대한 세포독성 및 실험 시 처리 농도를 결정하고, 6종 화합물의 세포독성을 측정하기 위해 MTT assay를 사용하였다.

성능/효과

유럽이 원산지로 2,100 m 고도의 카슈미르 지역에서 발견되며 높이 약 150 cm 정도에 이른다.¹⁾ 밑에서 가지가 많이 갈라지고 전체에 잿빛을 띠고 있으며, 잎은 어긋나고 2~3회 깃꼴로 갈라지며 흰 털이 많이 나고 씹으면 쓴맛이 강한 것이 특징이다.¹⁾ 여름에 꽃이 피고 많은 두화가 원추형 꽃차례에 달린다.
¹⁾ 밑에서 가지가 많이 갈라지고 전체에 잿빛을 띠고 있으며, 잎은 어긋나고 2~3회 깃꼴로 갈라지며 흰 털이 많이 나고 씹으면 쓴맛이 강한 것이 특징이다.¹⁾ 여름에 꽃이 피고 많은 두화가 원추형 꽃차례에 달린다. 전통적으로 간질, 위장, 비장, 비뇨기 질환 치료 및 상처치유에 사용되었다.
7 대식세포와 BV2 미세아교세포에 쓴쑥에서 분리된 6종의 화합물을 처리하고 LPS로 24시간동안 염증반응을 유발한 후 NO생성 억제여부를 측정하였다. 그 결과 6종 가운데 eupatilin(1)만 RAW264.7 대식세포(Table I)와 BV2 미세아교세포(Table II)에서 NO생성 억제효과를 보였다. Eupatilin(1)의 NO생성억제 IC₅₀ 값을 각각의 세포에서 확인하였다(Table I and II).
먼저, 쓴쑥에서 분리된 6종의 화합물을 RAW264.7대식세포와 BV2 미세아교세포에 농도별(1-40 μM)로 48시간 처리하였고, 6종의 화합물 모두가 40 μM까지 세포 독성이 없음을 확인하였다(Data not shown).
소분획 D-4(271 mg)에 대해 실리카젤 및RP-18 컬럼 크로마토그라피(Hexane:EtOAc=70:1→5:1, 95:1→90:1, Acetone:H2O=4:1)를 반복 실시하여 각각 화합물2(8.65 mg), 3(6.09 mg)을 얻었다.
또한 ESI-MS 스펙트럼에서 분자이온이 m/z 345[M+H]⁺에 나타났다. 이와 같은 모든 data를 종합하고 기존에 보고된 문헌과 비교하여 화합물 1은 eupatilin으로 동정하였다.⁹⁾
EI-MS 스펙트럼에서는 분자이온이 m/z426[M]+에 나타났다. 이와 같은 모든 data를 종합하고 기존에 보고된 문헌과 비교하여 화합물 5는 taraxasterol로 동정하였다.^14,15)
화합물 2은 백색의 침상결정으로 1H-NMR 스펙트럼에서 7개의 메틸기가 δ 1.69, 1.62, 0.97, 0.87, 0.86, 0.85에 나타났고 exo-methylene기의 피크가 δ 4.74, 4.70에 나타났으며,δ 4.50에 oxy methine 피크가, δ 5.13에 이중결합의 수소피크가 δ 2.04에, -OCOCH3기에 유래하는 피크가 관찰되어 화합물 2는 dammarane type의 triterpenoid 화합물로 추정되었다.
화합물 3과는 달리 13C-NMR 스펙트럼에서 δ 215.5의 피크로 카르보닐기의 존재를 확인하였고, δ 80.6에서 수산기의 존재를,δ 170.9, 21.3에서 아세테이트기의 존재를 각각 확인하였다.
화합물 6은 황색의 분말상태로서 ¹H-NMR data가 화합물1과 매우 유사한 것으로 나타나 flavonoid계 화합물임을 예상할 수 있었다. 벤젠환의 ABX-type의 수소피크가 δ 7.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	쓴쑥에서 분리한 성분 중 NO생성억제에 유의미한 효과를 낸 성분은 무엇인가요?	absinthium)의 지상부로부터 6종의 성분들을 단리하여 각각 eupatilin(1), dammaradienylacetate(2), glutinol acetate(3), 3β-acetoxyoleanan-12-one(4),taraxasterol(5), quercetin-3,4'-dimethyl ether(6)으로 동정하였다. 이 가운데 eupatilin(1)만이 RAW264.7 대식세포와 BV2 미세아교세포에서 LPS로 유발한 NO생성억제 효과를 나타냈다. 화합물 2-5는 쓴쑥에서 처음으로 분리된 화합물들이다.
	쓴쑥에 대해 설명하시오	쓴쑥(Artemisia absinthium L.)은 초롱꽃목 국화과에 속하는 여러해살이 반관목 식물이다. 유럽이 원산지로 2,100 m 고도의 카슈미르 지역에서 발견되며 높이 약 150 cm 정도에 이른다.
	논문의 연구에서 수행한 쓴쑥 공정 과정은 어떻게 되나요?	연구에서는 쓴쑥의 메탄올 추출물을 용매분획한 후 얻어 진 CH2Cl2 분획에 대해 실리카겔, RP-18, MCI-gel등의컬럼충진제를 이용한 컬럼 크로마토그래피를 반복적으로 수행하여 6종의 화합물 eupatilin(1), dammaradienyl acetate(2), glutinol acetate(3), 3β-acetoxyoleanan-12-one(4), taraxasterol(5), quercetin-3,4'-dimethyl ether(6)을 분리, 동정하였다. 이들 화합물중 triterpene계 화합물인 2-5는 쓴쑥에서 처음으로 분리된 화합물들이다.

참고문헌 (19)

Colin, W. (2002) Artemisia, Artemisia Medicinal and Aromatic Plants, p. 344. Industrial Profiles and Chemical Rubber Company (CRC), London & New York.
Aberham, A., Cicek, S. S., Schneider, P. and Stuppner, H. (2010) Analysis of sesquiterpene lactones, lignans, and flavonoids in wormwood (Artemisia absinthium L.) using highperformance liquid chromatography (HPLC)-mass spectrometry, reversed phase HPLC, and HPLC-solid phase extraction-nuclear magnetic resonance. J. Agric. Food Chem. 58: 10817-10823.

상세보기
Ahamad, J., Naquvi, K. J., Ali, M. and Mir, S. R. (2014) Isoflavone glycosides from aerial parts of Artemisia absinthium. Chem. Nat. Compd., 49: 996-1000.

상세보기
Tulake, A., Jiang, Y. and Tu, P. F. (2012) Nine lignans from Artemisia absinthium L. J. Chin. Pharm. Sci. 21: 360-364.
Ahamad, J., Naquvi, K. J., Ali, M. and Mir, S. R. (2013) New glycoside esters from the aerial parts of Artemisia absintium Linn. Nat. Prod. J. 3: 260-267.
Berlet, B. S. and Stadtman, E. R. (1997) Protein oxidation in aging, disease, and oxidative stress. J. Biol. Chem. 272: 20313-20316.

상세보기
Remick, D. G., Strieter, R. M., Eskandari, M. K., Nguyen, D. T., Genord, M. A., Raiford, C. L. and Kunkel, S. L. (1990) Role of tumor necrosis factor-alpha in lipopolysaccharideinduced pathologic alterations. Am. J. Pathol. 136: 49-60.

상세보기
Gonzalelz-Scarano, F. and Baltuch, G. (1999) Microglia as mediators in inflammatory and degenerative disease. Annu. Rev. Neurosci. 22: 219-240.

상세보기
Kim, A. R., Ko, H. J., Chowdhury, M. A., Chang, Y. S. and Woo, E.-R. (2015) Chemical constituents on the aerial parts of Artemisia selengensis and their IL-6 inhibitory activity. Arch. Pharm. Res. 38: 1059-1065.

상세보기
Liu, R., Wang, X.-B. and Kong, L.-Y. (2006) Dammaradienyl acetate. Acta Cryst. E62: o3544-o3546.
Seedi, E. and Hesham, R. (2005) Antimicrobial triterpenes from Poulsenia armata Miq. Standl. Nat. Prod. Res. 19: 197-202.

상세보기
Fingolo, C. E., Santos, T. de S., Vianna, F. M. D. M. and Kaplan, M. A. C. (2013) Triterpene esters: natural products from Dorstenia arifolia. Molecules 18: 4247-4256.

상세보기
Gaydou, E. M., Faure, R. and Wollenweber, E. (1996) ${\beta}$ -amyrin acetate epoxide from Canarina canariensis. Phytochemistry 42: 1115-1118.

상세보기
Yekta, M. M. and Alavi, S. H. R. (2008) New triterpenoids from Peucedanum ruthemicum. Iran J Pharm. Sci. 4: 289-294.
Carvalho, M. G., Velandia, J. R. and Beserra, L. O. F. B. (1998) Triterpenoid isolated from Eschweilera longipes Miers (Lecythidaceae). Quim. Nova. 21: 740-743.
Kwon, Y. S. and Kim, C. M. (2003) Antioxidant constituents from the stem of Sorghum bicolor. Arch. Pharm. Res. 26: 535-539.

원문보기 상세보기
Knowles, R. G. and Moncada, S. (1994) Nitric oxide synthases in mammals. Biochem. J. 298: 249-258.

상세보기
Choi, E. J., Lee, S., Chae, J. R., Lee, H. S., Jun, C. D. and Kim, S. H. (2011) Eupatilin inhibits lipopolysaccharideinduced expression of inflammatory mediators in macrophages. Life Sci. 88: 1121-1126.

상세보기
Sapkota, A., Gaire, B. P., Cho, K. S., Jeon, S. J., Kwon, O. W., Jang, D. S., Kim, S. Y., Ryu, J. H. and Choi, J. W. (2017) Eupatilin exerts neuroprotective effects in mice with transient focal cerebral ischemia by reducing microglial activation. PLoS One. 12: e0171479.

상세보기

저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

내보내기 구분	파일저장 인쇄 메일전송
구성항목	기본정보 상세정보 관리번호, 논문명, 저널/프로시딩명, 저자 , 발행년, 권, 호, 시작페이지, 끝페이지, 발행기관 관리번호, 논문명, 대등논문명, 저자 , 저널/프로시딩명, 발행기관, 발행년, 발행언어, 권, 호, 시작페이지, 끝페이지, ISBN, ISSN, 주제분야, 키워드, 초록(한글), 초록(영문), 저자(소속기관)
저장형식	Text(ASCII format) Excel format RefWorks Direct Export RIS format (for Reference Manager, ProCite, EndNote), Scholar's Aids, Mendeley
메일정보	받는사람 (필수) @ 보내는사람 (선택) @ 제목 내용 KISTI 검색결과 이메일 서비스
안내	총 건의 자료가 검색되었습니다. 다운받으실 자료의 인덱스를 입력하세요. (1-10,000) 검색결과의 순서대로 최대 10,000건 까지 다운로드가 가능합니다. 데이타가 많을 경우 속도가 느려질 수 있습니다.(최대 2~3분 소요) 다운로드 파일은 UTF-8 형태로 저장됩니다. 파일의 내용이 제대로 보이지 않을실 때는 웹브라우저 상단의 보기 -> 인코딩 -> 자동선택 여부를 확인하십시오. ~ Text(ASCII format) Excel format

연합인증