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문제 정의
- 2014).본 리뷰에서는 최근 3년간 여러 곰팡이성 병원균과 다양한 기주 혹은 비기 주식물과의 상호작용에 관하여 프로테오믹스적 기법으로 접근한 연구들을 소개하고 있다. 특히 주목할 점은 식물과 미생물의 상호작용 시 서로 직접적인 반응이 일어나는 식물 ap oplast에서 분비단백질체(secretome) 분석이 벼 도열병(M agn apo rthe oryzae, M.
- 최근 3년간 (2010년-2013년) 총 12개의 작물(벼, 보리, 밀, 토마토, 딸기 등)-곰팡이병원 균에 대한 방어기작 및 병원균 상호작용을 이해하기 위하여 단백질 체연구 접근에 대해서 논의하고자 한다(Table 1 ).특히 Figure 1은 식물 곰팡이 상호작용에 관여하는 중요한 단백질들의 발현 양상을 보여주고 있다.
제안 방법
- 2005). 2-D E 와 MAL DI-TO F/T OF M S/ M S기법을 이용하여 C. fra ga riae를 감염시킨 딸기 잎으로부터 단백질을 추출하여 분석하였다(F ang et al. 2 01 2). 딸기와 C.
- 2-DE는 거의 대부분의 연구에서 pI 값을 이용하여 분리해내는 기술인 IEF를 일차원상에서, 분자량을 이용한 SDS-PAGE를 이 차원상에서 분리해내는 두 가지의 전기영동 기술을 이용하여 이루어진다. 2-DE를 통해 단백질들이 분리되어 있을 g el을 염색하는 기술은 Sil ver s tai nin g, Coo massebl uestainng 또는 fluores cence detecti on 등으로 다양하며, 본 리뷰에서 언급한 10개의 연구에서는 Silver Nitrat e이나 Coom asieblue을 사용하여 gel을 염색하였다. 2-D E는 사용 시 비교 단백질 발현 패턴 연구에 있어서 높은 단백질 정량 분석 능력을 보일 뿐 아니라 질량분석기를 이용한 단백질 대량 분석보다 상대적으로 비교적 저렴한 비용이 소요되기 때문에 보편적으로 단백질 체 분석에 많이 이용되고 있다.
- 20 03). P. T ri tici -repen ti s로부터 P tr To xB를 추출하여 이를 밀잎에 접종시켜 프토테 오믹스적 변화를 관찰하였다(Kimet al. 2010 ). P.
- sp . Tritici 를 비기 주식물인 벼잎에 접종시켜 식물의 프로테옴적 변화를 관찰하였다(Liet al. 2012 ). 33개의 단백질이 증가 패턴으로 발현되고 9개의 단백질이 감소되는 패턴으로 발현되고 있음을 확인하였다.
- s p. Tritici에 감염된 밀의 잎에서 gel을 필요로 하지 않는 이 차 원 액체크로마토그래피를 통해 분리하여 Nano LCESI-M S/ MS를 통해 33개의 단백질을 동정하였다(Maytalm an et al. 20 13).그 중에서 27개의 단백질들이기주식물의 단백질로 동정되었으며 다양한 생물학적 과정을 바탕으로 다섯 개의 그룹으로 나눌 수 있었다.
- 토마토과실에 다양한 네 가지 방법으로 오존을 처리한 후 B . cinerea 감염시켜 토마토과실에서 단백질 변화를 관찰하였다(T zorzak is et al. 2013).오존의 농도와 그 시간에 따라 토마토가 B.
- 연구진은 C . fr agariae-responsiveprotei n 네트워크를 연구에서 동정된 단백질들을 이용하여 제시하였다. 이 네트워크는 R OS 생산과 제거 사이의 조절, HSPs 생합성의 가속화 해당과정 그리고 cel l-wall -lig nin 형성을 강화시키는 기능적인 구성 성분들을 포함하고 있다.
- M . oyzae를 벼의 엽육에 감염시켜 그로부터 나오는 분비 단백질체를 동정 및 분석하였다(Kogaet al. 2012). 연구진은 감수성 벼 식물의 엽육세포에서 발현되는 whole-pl antspecific resistance (W PSR )가 A bsci si c acid (ABA )나 저온에 의해 제약을 받는다는 것을 발견했다.
- 2 001 ).민트 잎에 A. alternat a를 접종하여 그 잎으로부터 단백질체를 추출 후 분석하였다(Shinha et al. 2 011 ). A .
- 2003). 벼도열병과 벼의 상호작용에서 유도되는 Pathogen-responsive 단백질에 대한 프로테오믹스 연구를 수행하기 위하여 M.oryzae를 감염시킨 지 24시간, 48시간 그리고 72시간 된 벼잎을 이용하여 probenazolinduced protein (PB Z1 ), Domain unknown protein (DU F26 ), Peroxidase, Isofalvone reduactase 등병원성에 관련이 있는 단백질을 동정하였다(Kim et al. 2 00 4). 최근 식물과 곰팡이 상호작용에서 세포간극(apo plast)는 기주와 병원균이 직접 서로 상호작용을 하는 장소로 이 apo plast에서 분비되는 기주 및 병원균 유래 분비단백질체(Secretome) 연구의 중요성이 강조되고 있다(Agrawal GK et al.
- ).본 리뷰에서 성숙도 정도에 따른 각각의 토마토가 B. cin er ea와의 상호작용에 분비되는 단백질 체에 대한 반응을 알아보기 위한 연구에서는 S DS -PAG E만을 사용하였고 LC -MS/MS를 사용하여 총 58 8개의 처리 구별로 발현량의 차이가 나는 spo t을 분리 및 동정하였다(Shah et al. 2012). Gel을 기반으로 하는 분리 기법을 사용한 연구 외에도, Maytalman 등(2013)은 P.
- 토마토과실에 성숙도에 따라서 B. cinerea의 감염에 대한 반응을 비교하기 위해 접종 후 각각 Mature green (MG), red ripe (RR) wildtype, r ipening inhibited (rin) mut an t토마토 과실로부터 단백질체를 추출하여 동정 및 분석하였다.
대상 데이터
- 도열병을 접종한 도열병 저항성 품종과 이병성 품종잎의 in -planta 분비 단백질에 대해 프로테오믹스의 대규모 조사가 있었다. 2DE와 MudPIT가 MALDITO F-MS 및 또는 nESI-LC -MS/MS와 결부된 732개(rice 분비 단백질 291개, 도열병 분비 단백질 441개)를 동정하였다. 이 중에서 다수의 벼 분비 단백질은 방어기 작 관련 단백질과 관련된 si gn al peptide를 가지고 있었고 반면, 다수의 벼도 열병 분비단백질은 세포벽 가수분해와 관련된 sign alpeptide를 가지고 있는 것을 발견하였다.
- sp. F ra ga riae를 접종시킨 딸기 뿌리로부터 2-D E와 M A LD I-TOF/ TO F-M S/M S를 이용하여 접종 후 시간대별로 다르게 발현하는 단백질 79개를 동정하였다(Fang et al 2 01 3).이들 단백질은 이 차대사 산물, 단백질 합성 및 변성, 스트레스와 방어반응, 항산화물질 등에 관련이 있었다.
- gr amineau m과 상호작용하는 밀의 잎대로부터 추출한 단백질 체연구에서도 보여준다. 잎대로부터 추출한 단백질을 LC-hy brid MS/MS를 이용하여 총 637개의 단백질을 분리하였다(Gunnaiah et al. 2 01 2).
- 2 006). 최근 F. g ra minear um 에 대한 저항성에 밀Q (Fhb1 )이 기여하는지를 알아보기 위해 접종한 밀잎대로부터 단백질을 추출하였다(G un nai ah et al . 201 2). F.
이론/모형
- sp. Tritici (P. striiform is f. sp. Tritici) 에 감염된 밀잎은 M g/NP-40 추출용액(0.5 M Tris-HCl, pH 8 .3, 2 % v /v NP-4 0, 2 0 m M M gCl 2, 2% v/v beta-mercap to ethanol, 1 mM phenyl methy lsul fonyl fluoride (PMSF)와 1% w/v polyv inylpoly pyrrolidone (PVPP))에 분쇄된 가루를 균질화시킨 뒤 Acetone 침전법 또는 Phenol법을 사용하여 추출하였다(Mayt alman et al. 20 13 ; Ki m et al. 20 01 ; K imetal . 2004; Rampit schetal . 2006 ). Mg /N P-40 buffer를 이용한 추출 방법은 식물에서 High abund antprteins (HA Ps) 중 하나인 R ub is co 제거율을 높여 더 많고 다양한 단백질의 추출을 가능하게 한다(Kim et al.
- 이 리뷰에 사용된 13개의 연구는 다양한 방법으로 단백질이 추출되었음에도 분리하는 기술은 그 중 10개 연구에서 2-DE 기법을 선택하여 단백질 분리에 이용하였다.
성능/효과
- 1 3개의 단백질이 M. oryzae를 접종 시킨 후 발현량을 변화하는 것으로 확인 되었으며 이들 단백질의 부분적 아미노산 염기서열 분석 결과 β-1, 3-gl ucanas e, t haum at in-l ik e pro tein 그리고 PR-10 protei n 등으로 구성되어 있음을 확인했다.
- 1 86개의 단백질들이 red-ripe와 rin으로 부터 공통적으로 동정되었으며 m atu re green 토마토에서 방어반응 관련 단백질이 red -rin보다 2 5-3 3% 정도 더 많이 나왔다. 이와 대조적으로 분비 단백질 체의 분석에서는 큰 변화가 없음을 확인하였다.
- 2012 ). 33개의 단백질이 증가 패턴으로 발현되고 9개의 단백질이 감소되는 패턴으로 발현되고 있음을 확인하였다. 동정된 단백질들은 방어/스트레스 반응, 에너지/탄수화물 대사, 산화-환원 과정, 단백질의 접힘, 전환, 수리, 변성, 신호전달 그리고 세포 사멸 조절 등에 관련이 있었으며 이러한 결과는 벼에서 보이는 P tt에 대한 비기주식물 저항성(No n-host resistance, NHR )이 에너지 대사, 항균 활성의 증가, ph yt oalexi n 축적과 세포벽 강화, 항산화 그리고 식물세포 사멸의 방지의 강화 등을 포함하고 있는 것으로 보인다.
- tritici -repent is로부터 뽑아낸 toxi n, Pt r Tox B를 접종시킨 밀잎으로부터 뽑은 단백질은 2-D E를 거쳐 ESI-quadrup ole-TOF MS/M S를 통해 4 7개가 동정되었다. 47개의 동정된 단백질들은 광합성의 명반응, 캘빈 사이클 그리고 스트레스/방어반응에 관련되어 있는 단백질들을 포함하고 있었다. 광합성의 감소와 동정된 다양한 단백질들의 종류를 바탕으로 PtrTox B가 밀의 광합성과정을 신속하게 붕괴시키고 산화적 스트레스와 ROS생성을 야기시키는 것으로 이들 연구진은 보고했다.
- 이 IWF 추출에서 몇 개의 단백질들이 호환적이거나 비호한 적상호작용에 관련되어 있는 것을 확인했다. DUF2 6 domain 단백질은 접종된 지 12시간째에 풍부하게 발현되는 것을 확인하였으며 M. oryae에 의해 스트레스 반응 단백질들이 유도된 것을 확인하였다.
- 지금까지 총 12편의 작물(벼, 보리, 밀, 토마토, 딸기 등)-곰팡이병원 균에 대한 단백질 체연구 결과에서 주로 스트레스 및 방어 관련 단백질들(HSP, PR 1, 2, 3 , 그리고 5)과 항산화 관련 단백질들(superoxidedismu tase, GlutathioneS-trans ferase, Asco bate perox idase, Thiredoxin, Peroxi redoxin) 등이동정되었다. 결론적으로 작물에서 곰팡이병원균에 반응하는 중요한 지표로 ROS의 축적도가 변화하는 것을 확인했으며 식물조직 내에서 생산되는 ROS양이 병원균을 죽이기에 충분한지에 대해서는 확인되지 않는 것으로 보이지만 ROS의 생성과 제거 사이의 균형이 병원균에 대항하기 위한 식물에 저항성에 있어서 부분적으로 중요하다고 볼 수 있겠다. 따라서 프로테오믹스는 다양한 단백질들을 동정하고 그 기능을 이해하며 어떠한 특정 단백질들은 biomarker로서의 활용도 가능하게 만들며 이러한 이 점들은 식물병리학에 있어서 그 기작을 이해하고 더 나아가 신 품종 육성에도 기여를 할 것으로 사료된다.
- 33개의 단백질이 증가 패턴으로 발현되고 9개의 단백질이 감소되는 패턴으로 발현되고 있음을 확인하였다. 동정된 단백질들은 방어/스트레스 반응, 에너지/탄수화물 대사, 산화-환원 과정, 단백질의 접힘, 전환, 수리, 변성, 신호전달 그리고 세포 사멸 조절 등에 관련이 있었으며 이러한 결과는 벼에서 보이는 P tt에 대한 비기주식물 저항성(No n-host resistance, NHR )이 에너지 대사, 항균 활성의 증가, ph yt oalexi n 축적과 세포벽 강화, 항산화 그리고 식물세포 사멸의 방지의 강화 등을 포함하고 있는 것으로 보인다. 동정된 단백질 중 증가되는 패턴에 속한 단백질의 절반이 엽록체와 미토콘드리아에 관련이 되어 있으며 이는 NHR이 진행되는 동안에 이들 조직에 중요한 역할을 하는 것으로 보인다.
- 2012 ).동정된 단백질은 C innam yl alcoho l dehy drogenase, caffeoyl-C oA O -meth yl trns ferase, caffei cacid O-m et hy lt rans ferase, flavonoi d O -methyl tr ans ferase, agmatine coum a royltransferase 그리고 peroxidase 등과 같은 주로 대사 관련 단백질들이 증가하는 패턴을 보였다.
- 벼도열병 Gly coside hydrolase (GH ) 단백질 family의 In -planta에서 발현을 Bom bardment를 이용한 일시적 발현시스템에서 GH 단백질들이 Apo plast 내에서 effector로써 작용할 수 있다는 것을 보여주었다. 또한 일부 이들 사이에서 벼스트레스 반응, Reactive Oxygen Species (ROS) 그리고 에너지 대사에 관련된 단백질들이 분비되는 것으로 확인되었다. Shento n 2012 등은 M.
- 이 중에서 다수의 벼 분비 단백질은 방어기 작 관련 단백질과 관련된 si gn al peptide를 가지고 있었고 반면, 다수의 벼도 열병 분비단백질은 세포벽 가수분해와 관련된 sign alpeptide를 가지고 있는 것을 발견하였다. 벼도열병 Gly coside hydrolase (GH ) 단백질 family의 In -planta에서 발현을 Bom bardment를 이용한 일시적 발현시스템에서 GH 단백질들이 Apo plast 내에서 effector로써 작용할 수 있다는 것을 보여주었다. 또한 일부 이들 사이에서 벼스트레스 반응, Reactive Oxygen Species (ROS) 그리고 에너지 대사에 관련된 단백질들이 분비되는 것으로 확인되었다.
- 2 011 ).이들 결과는 기주 내에 prot eom ic l evel에서의 변화를 보이는 45개의 단백질이동정되었으며 동정된 단백질 중 5 6%가 에너지와 대사과정과 관련 있는 반면 2 9%는 스트레스와 방어에 관련이 있었다. 이 결과는 초기 방어 반응과 병원성을 극복하기 위한 힘이 충분치 않다는 것을 보여준다.
- 그 중에서 27개의 단백질들이기주식물의 단백질로 동정되었으며 다양한 생물학적 과정을 바탕으로 다섯 개의 그룹으로 나눌 수 있었다. 전신 획득 저항성을 위한 주요 소인 PR -1 , PR -4 , Glutathione Stransferase 등의 방어 관련 단백질들이 동정되었음을 확인했다.
후속연구
- 2008 ). 그러나 아직 식물 단백질체추출방법에 대한 최적화되고, 보편적으로 사용할 수 있는 추출용액은 없는 것으로 조사되지만, 향후 단백질 체 분석이 가능한 추출용액의 필요성은 많은 연구자들이 관심을 가지게 될 것이다.
- 이는 기존 단백질 체분리, 분석, 검출의 한계성 때문일 것이다. 따라서 새로운 저항성 단백질을 발굴하기 위해서는 감염 부위 특이적인 조직에서 단백질 분석 기술(예, laer microdiss ecti on 기술)과 과발현 단백질(예, R ubisco)을 효과적으로 제거할 수 있는 prefracti on ati on 분석 기술이 개발되어야 될 것이다. 또한 식물-미생물 상호작용 시 su bcel lu lar pro teom i cs (Ap op last , M it ochn od ria, ER , Nuclei, Chl oroplast ) 분석으로 병원균의 target site 별 단백질 발현의 차이를 정량 분석을 통하여 저항성 단백질 발굴이 필요하며 또한 대량 단백질-단백질 상호작용 단백질체(interactome) 분석 기술의 개발이 요구될 것이다.
- 또한 식물-미생물 상호작용에서 중요한 phosphop roteome연구 즉 posttranslational modi ficati on s(PTM s)된 단백질의 대량 분석 또한 중요한 병저항성 관련 단백질 체연구의 한 축이라고 할 수 있다. 따라서 식물-미생물 상호작용을 이해하기 위한 단백질 체적연구에서는 하나의 접근법보다는 위에서 언급한 다양한 분석기법과 접근법을 활용한 연구가 병 저항성기작을 이해하는데 아주 중요할 단서를 제공할 것이다.
- 2013). 따라서 아직 작물과 곰팡이 상호작용에서 단백질 체 분석에 대한 포괄적인 리뷰는 아직 정리된 사례가 없어 관련 연구자들에게 본 리뷰 논문이 많은 도움이 될 것으로 기대된다.
- 결론적으로 작물에서 곰팡이병원균에 반응하는 중요한 지표로 ROS의 축적도가 변화하는 것을 확인했으며 식물조직 내에서 생산되는 ROS양이 병원균을 죽이기에 충분한지에 대해서는 확인되지 않는 것으로 보이지만 ROS의 생성과 제거 사이의 균형이 병원균에 대항하기 위한 식물에 저항성에 있어서 부분적으로 중요하다고 볼 수 있겠다. 따라서 프로테오믹스는 다양한 단백질들을 동정하고 그 기능을 이해하며 어떠한 특정 단백질들은 biomarker로서의 활용도 가능하게 만들며 이러한 이 점들은 식물병리학에 있어서 그 기작을 이해하고 더 나아가 신 품종 육성에도 기여를 할 것으로 사료된다.
- 따라서 새로운 저항성 단백질을 발굴하기 위해서는 감염 부위 특이적인 조직에서 단백질 분석 기술(예, laer microdiss ecti on 기술)과 과발현 단백질(예, R ubisco)을 효과적으로 제거할 수 있는 prefracti on ati on 분석 기술이 개발되어야 될 것이다. 또한 식물-미생물 상호작용 시 su bcel lu lar pro teom i cs (Ap op last , M it ochn od ria, ER , Nuclei, Chl oroplast ) 분석으로 병원균의 target site 별 단백질 발현의 차이를 정량 분석을 통하여 저항성 단백질 발굴이 필요하며 또한 대량 단백질-단백질 상호작용 단백질체(interactome) 분석 기술의 개발이 요구될 것이다. 예로 immunoprecip itatio과 Bimolecular luores cence Com p lem ent ati on (B i FC ) assay을 통한 i nt eracto m e 및 B io in form at ics연구 등이 중요한 접근 방법 중의 하나이다.
- 예로 immunoprecip itatio과 Bimolecular luores cence Com p lem ent ati on (B i FC ) assay을 통한 i nt eracto m e 및 B io in form at ics연구 등이 중요한 접근 방법 중의 하나이다. 또한 식물-미생물 상호작용에서 중요한 phosphop roteome연구 즉 posttranslational modi ficati on s(PTM s)된 단백질의 대량 분석 또한 중요한 병저항성 관련 단백질 체연구의 한 축이라고 할 수 있다. 따라서 식물-미생물 상호작용을 이해하기 위한 단백질 체적연구에서는 하나의 접근법보다는 위에서 언급한 다양한 분석기법과 접근법을 활용한 연구가 병 저항성기작을 이해하는데 아주 중요할 단서를 제공할 것이다.
- 따라서 대부분 단백질 체 분석에서 단백질 동정에 사용되는 가장 보편적인 방법은 질량분석기를 이용한 단백질 동정기술이다. 최근 대사체학의 중요성이 강조되면서 단백질 뿐만이 아니라 대사체 분석에 질량분석기의 정확도와 대량동정을 위한 데이터베이스 구축은 향후 꾸준히 연구될 것으로 기대된다.
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