충청 지역에서 분리된 대장균이 생성하는 Extended Spectrum β-Lactamase 유형의 검출 빈도 The prevalence of Extended Spectrum β-Lactamase type produced by Clinical Isolates of Escherichia coli from ChungCheong Area원문보기
장내세균 가운데서 가장 빈번하게 나오는 대장균에서 Extended-Spectrum ${\beta}$-Lactamase(ESBL)를 생성하는 효소의 검출빈도와 이들 균주의 ESBL 효소의 유형을 구분하는 것이 이 연구의 목적이다. 균주는 충청지역 (대전, 충남, 충북)병원에서 2013년 2월부터 7월까지 6개월간 282 대장균 균주 중 ESBL을 생성하는 74균주(26.2%)를 수집하였다. 충청지역에 ESBL 균주를 포함한 대장균의 항균제 내성률은 Aztreonam 30.8%, Cefotaxim 30.9%, 그리고 Ceftazidime 32.2%로 나타났으며 ESBL을 생성하는 균주는 ${\beta}$-lactam 항균제인 Aztreonam에 58.1%, Cefotaxim 100%, 그리고 Ceftazidime 63.5%의 내성률을 보였다. 동정된 ESBL 균의 CTX-M-2은 48 균주, CTX-M-8은 20 균주, PER-1 28 균주, 그리고 VEB-1 26 균주에서 나왔다. GES-1 형은 74균주 중 2균주가 충남에서만 유일하게 나타났다. ESBL 검출빈도와 유형의 정확한 파악은 병원감염관리와 항균제 처방에 도움이 될 것이다.
장내세균 가운데서 가장 빈번하게 나오는 대장균에서 Extended-Spectrum ${\beta}$-Lactamase(ESBL)를 생성하는 효소의 검출빈도와 이들 균주의 ESBL 효소의 유형을 구분하는 것이 이 연구의 목적이다. 균주는 충청지역 (대전, 충남, 충북)병원에서 2013년 2월부터 7월까지 6개월간 282 대장균 균주 중 ESBL을 생성하는 74균주(26.2%)를 수집하였다. 충청지역에 ESBL 균주를 포함한 대장균의 항균제 내성률은 Aztreonam 30.8%, Cefotaxim 30.9%, 그리고 Ceftazidime 32.2%로 나타났으며 ESBL을 생성하는 균주는 ${\beta}$-lactam 항균제인 Aztreonam에 58.1%, Cefotaxim 100%, 그리고 Ceftazidime 63.5%의 내성률을 보였다. 동정된 ESBL 균의 CTX-M-2은 48 균주, CTX-M-8은 20 균주, PER-1 28 균주, 그리고 VEB-1 26 균주에서 나왔다. GES-1 형은 74균주 중 2균주가 충남에서만 유일하게 나타났다. ESBL 검출빈도와 유형의 정확한 파악은 병원감염관리와 항균제 처방에 도움이 될 것이다.
The study aims primarily to evaluate the resistance of antibiotics and the prevalence of these enzymes among Escherichia coli the most frequent isolate of Enterobacteriaceae producing Extended-Spectrum ${\beta}$-Lactamase(ESBLs), to differentiate the types of enzymes in these isolates. To...
The study aims primarily to evaluate the resistance of antibiotics and the prevalence of these enzymes among Escherichia coli the most frequent isolate of Enterobacteriaceae producing Extended-Spectrum ${\beta}$-Lactamase(ESBLs), to differentiate the types of enzymes in these isolates. Total 74(26.2%) Strains of producing ESBLs among the 282 E. coli isolates were isolated from hospitals of Chungcheong area (Daejeon, Chungnam, and Chungbuk) during a 6 month-period from February to July, 2013. 282 E. coli isolates including ESBL shown resistance rates of aztreonam 30.8%, Cefotaxim 30.9%, and Ceftazidime 32.2%, 74 isolates producing ESBLs in E. coli were resistant rates to Aztreonam 58.1%, Cefotaxim 100%, and Ceftazidime 63.5% of ${\beta}$-lactam antibiotics. CTX-M-2 (48 isolates) was the most prevalent type of ESBLs identified. Followed the order of frequency by PER-1 (28 isolates), VEB-1 (26 isolates) and CTX-M-8 (20 isolates), of the 74 isolates, 2 isolates only showed GES-1 in Chungnam province. Accurate identification type of ESBLs would aid in hospital infection control. This would give aid to the physician to prescribe more appropriate antibiotics.
The study aims primarily to evaluate the resistance of antibiotics and the prevalence of these enzymes among Escherichia coli the most frequent isolate of Enterobacteriaceae producing Extended-Spectrum ${\beta}$-Lactamase(ESBLs), to differentiate the types of enzymes in these isolates. Total 74(26.2%) Strains of producing ESBLs among the 282 E. coli isolates were isolated from hospitals of Chungcheong area (Daejeon, Chungnam, and Chungbuk) during a 6 month-period from February to July, 2013. 282 E. coli isolates including ESBL shown resistance rates of aztreonam 30.8%, Cefotaxim 30.9%, and Ceftazidime 32.2%, 74 isolates producing ESBLs in E. coli were resistant rates to Aztreonam 58.1%, Cefotaxim 100%, and Ceftazidime 63.5% of ${\beta}$-lactam antibiotics. CTX-M-2 (48 isolates) was the most prevalent type of ESBLs identified. Followed the order of frequency by PER-1 (28 isolates), VEB-1 (26 isolates) and CTX-M-8 (20 isolates), of the 74 isolates, 2 isolates only showed GES-1 in Chungnam province. Accurate identification type of ESBLs would aid in hospital infection control. This would give aid to the physician to prescribe more appropriate antibiotics.
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문제 정의
ESBL은 나라마다 종류가 다양하게 보고되고 있으며 또한 그 나라의 지역 내에서도 효소의 종류, 작용과 염기서열에 따른 점 변이의 분포가 다르기 때문에 많은 연구가 되어 지고[8-10] 있으나 충청지역에는 최근 연구된 자료가 없어 이에 본 연구에서는 대전, 충남, 충북 지역의 종합병원에서 분리된 대장균 ESBL로 추정되는 균의 빈도, 항균제 감수성 그리고 유전자형의 종류 확인을 위해 중합효소 연쇄반응 검사를 실시하였다. 이는 ESBL 생성세균에 의한 예방 및 감시활동, 감염증의 치료에 도움이 될 것으로 사료 된다.
CLSI 디스크 확산법에 의한 ESBL생성 확인시험을 시행하였다. Mueller-Hinton 한천 배지(BBL Microbiology Systems, Cockeysville, MD, USA)에 McFarland 0.
)를 이용하여 cyclic sequencing하였다 (94℃ 5s, 50℃ 10s, 60℃ 4min;25cycles).Cyclic sequencing이 끝난 반응산물은 alcohol precipitation방법 혹은 Centri-Sep Column (Princeton SeparationsCo.) 을 이용하여 정제시킨 다음 speed vacuum에서 완전히 건조시켜 ABI 3100 automated sequencer를 이용하여 염기서열을 결정하였다.
5mM), 10× PCR buffer 2㎕, primer 10 pmol 각각 1㎕씩 넣었고, genomic DNA(25 ㎍) 1 ㎕, Taq DNA polymerase(2unit)1㎕, 최종 반응액은 증류수로 20㎕ 되게끔 실시하였다. DNA thermal cycler(Perkin Elmer, Wellesley, USA)에서 94℃에서 1분간 변성, 50℃에서 1분간 접합, 72℃에서 1분간 확장의 순서로 35회를 시행하고 72℃에서 10분간 최종확장 하였다.
DNA 염기서열은 자동염기서열 분석기 (Perkin Elmer:ABI373,LI-COR4200)를 이용하여 분석을 하였다.클로닝한 DNA에 대한 sequence primer는 pGEM-T 유전자 운반체에 있는 T7 primer (5'-GTAATACGACTC ACT ATA-3')와 Sp6 primer (5'-TAT AGTGTC ACC TAA AT-3')를 한 쌍으로 그리고 M13 forward (5'-GTA AAA CGA CGG CCA GT-3')와 M13 reverse primer (5'-AACAGCTAT GACCAT G-3')를 한 쌍으로 각각 primer에 형광을 표지 하여 사용하였다.
DNAstar computer program을 사용하여 염기서열을 정렬하였다. 먼저 염기서열이 밝혀져 있는 같은 유전자 코드와 비교하고 또 GenBank의 유전자 등록처에 등록되어 있는 염기 서열과 비교분석하였다.
CLSI 디스크 확산법에 의한 ESBL생성 확인시험을 시행하였다. Mueller-Hinton 한천 배지(BBL Microbiology Systems, Cockeysville, MD, USA)에 McFarland 0.5탁도의 균액을 바른 후 Cefotaxime (BBL, 30g)과 Cefotaxime/Clavulanicacid(CTC) (BBL, 30/10 g), Ceftazidime(BBL, 30g)과 Ceftazidime/Clavulanic acid(CZC) (BBL, 30/10g) 디스크를 놓고 35℃에서 16-18시간 배양 후 억제대를 측정하여 CTC 또는 CZC에 의한 억제대가 Cefotaxime과 Ceftazidime에 의한 억제대보다 5mm 이상 클 경우 ESBL 생성 양성 균주로 판정하였다.
Multiplex PCR을 위한 PCR 혼합액 dNTP(각기 2.5mM), 10× PCR buffer 2㎕, primer 10 pmol 각각 1㎕씩 넣었고, genomic DNA(25 ㎍) 1 ㎕, Taq DNA polymerase(2unit)1㎕, 최종 반응액은 증류수로 20㎕ 되게끔 실시하였다.
PCR 증폭산물을 2% agarose gel에 1× TAE buffer에 서 70volt, 100mA로 1시간 동안 전기영동을 실시한 다음, agarose gel을 Ethidium Bromide(0.5㎍/㎖)수용액에서 20분간 염색하고 증류수에 10분간 탈색하여 UV transilluminator로 관찰하고, polaroid camera로 사진 촬영 하였다.
PCR용 250㎕짜리 tube에 다음의 조성을 넣었다. Up stream primer: 0.5㎕ 100 pmol primer, Down stream primer: 0.5㎕ 100pmol primer,Template DNA:5㎕ (100ng), dNTP:5㎕ (2mM dNTP), MgCl2:2～3㎕ (25mM MgCl2),10 X reaction buffer:5㎕, Taq DNA polymerase:0.5㎕ (2.5unit), DW:30.5～31.5㎕, Total 50㎕ 되게 하였다. 1 cycle: denaturation 94℃, 180초 annealing 50℃ , 60초 polymerization 72℃ , 60초 2～30: denaturation 94℃, 60초 annealing 50℃, 60초 polymerization72℃, 60초 31:denaturation94℃, 60초 annealing50℃, 060초 polymerization 72℃, 180초 조건으로 시행하였다.
검체를 MacConkey배지에 배양하여 그람음성, 유당 분해하는 대장균으로 추정되는 균을 MacConkey배지에 계대 배양하여 35℃ 항온기에서 하룻밤 배양한 후, MicroScan Neg Breakpoint Combo Panel Type 44 (NBC44)카드를 이용하여 동정 검사와 항균제 감수성 검사를 실시하였다. 액체 배지 미량 희석법으로 상기 장비에 의한 최소억제농도(minimum inhibitory concentration,MIC)를 측정하였다[11].
DNAstar computer program을 사용하여 염기서열을 정렬하였다. 먼저 염기서열이 밝혀져 있는 같은 유전자 코드와 비교하고 또 GenBank의 유전자 등록처에 등록되어 있는 염기 서열과 비교분석하였다. GenBank에 등록된 염기서열들과의 유사성 비교를 위해서 NCBI (National Center for Biotechnology Information)에서 웹상에 제공하는 Blast-search BLAST 2.
분리 정제된 플라스미드, PCR증폭 산물, 제한효소로 절단한 DNA 등을 6X sample buffer (0.25% bromophenol blue, 0.25% xylene cyanol FF, 40% sucrose)와 혼합하여 경우에 따라 1에서 2% 사이의 아가 로즈 젤에 전기 영동하여 1X TAE electrophoresis buffer 에서 100V에서 30～40분간 전기영동하였다. 전기영동이 끝난 젤은 0.
25% xylene cyanol FF, 40% sucrose)와 혼합하여 경우에 따라 1에서 2% 사이의 아가 로즈 젤에 전기 영동하여 1X TAE electrophoresis buffer 에서 100V에서 30～40분간 전기영동하였다. 전기영동이 끝난 젤은 0.002% ethidium bromide에 10분간 담가두었다가 증류수로 씻어준 후 UV transilluminator에 옮겨 플라스미드 DNA와 PCR증폭산물의 유무와 크기를 관찰하고 polaroid 카메라로 (Type667, PolaroidCo.) 사진 촬영하였다.
클로닝한 DNA에 대한 sequence primer는 pGEM-T 유전자 운반체에 있는 T7 primer (5'-GTAATACGACTC ACT ATA-3')와 Sp6 primer (5'-TAT AGTGTC ACC TAA AT-3')를 한 쌍으로 그리고 M13 forward (5'-GTA AAA CGA CGG CCA GT-3')와 M13 reverse primer (5'-AACAGCTAT GACCAT G-3')를 한 쌍으로 각각 primer에 형광을 표지 하여 사용하였다. 증폭된 target gene이 삽입된 plasmid를 정제한후, BigDyeTM Terminator Cycle Sequencing Kit v. 2.0 (PE Biosystems Co.)를 이용하여 cyclic sequencing하였다 (94℃ 5s, 50℃ 10s, 60℃ 4min;25cycles).Cyclic sequencing이 끝난 반응산물은 alcohol precipitation방법 혹은 Centri-Sep Column (Princeton SeparationsCo.
클로닝한 DNA에 대한 sequence primer는 pGEM-T 유전자 운반체에 있는 T7 primer (5'-GTAATACGACTC ACT ATA-3')와 Sp6 primer (5'-TAT AGTGTC ACC TAA AT-3')를 한 쌍으로 그리고 M13 forward (5'-GTA AAA CGA CGG CCA GT-3')와 M13 reverse primer (5'-AACAGCTAT GACCAT G-3')를 한 쌍으로 각각 primer에 형광을 표지 하여 사용하였다.
대상 데이터
2013년 2월1일부터 2013년 7월 30일까지 대전, 충남, 충북지역의 종합병원 진단검사의학과 미생물 검사실에서 검체를 수집하였다.
검사실에서 분리된 282균주의 E. coli 중에서 MicroScan WalkAway 96 SI(Dade Behring Sacramento, Calif.)장비가 ESBL양성으로 추정하는 74균주를 분리하였으며 검체가 다르더라도 같은 환자인 경우에는 먼저 검출된 한 개만 수집하였다. 정도관리를 위해서 참조 균주는 E.
액체 배지 미량 희석법으로 상기 장비에 의한 최소억제농도(minimum inhibitory concentration,MIC)를 측정하였다[11]. 시험한 항균제는 Amikacin, Ampicillin, Aztreonam, Cefotaxime, Ceftazidime, Cefazolin, Cefepime, Cefoxitin, Ceftriaxone,Ciprofloxacin, Gentamicin,Imipenem, 및 Trimthoprim/sulfamethoxazole (SXT)등을 이용하였다.
)장비가 ESBL양성으로 추정하는 74균주를 분리하였으며 검체가 다르더라도 같은 환자인 경우에는 먼저 검출된 한 개만 수집하였다. 정도관리를 위해서 참조 균주는 E.coli ATCC 25922를 이용하였다.
데이터처리
먼저 염기서열이 밝혀져 있는 같은 유전자 코드와 비교하고 또 GenBank의 유전자 등록처에 등록되어 있는 염기 서열과 비교분석하였다. GenBank에 등록된 염기서열들과의 유사성 비교를 위해서 NCBI (National Center for Biotechnology Information)에서 웹상에 제공하는 Blast-search BLAST 2.0(www3.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)을 이용하여 유사성이 높은 유전자의 위치를 확인하고, 결정된 염기서열들은 Clustal X multiple alignment 프로그램을 사용하여 염기서열을 정렬하고 Bioedit, GenejockyII 등의 프로그램을 사용하여 유전자의 배열 순서, 유전자 좌위별 G+C 및 A+T content,염기서열의 치환 정도, codon usage pattern등)을 종합적으로 분석하였다.
이론/모형
Plasmid DNA는 Sambrook 등의 방법에 따라 추출하였다. 균주의 배양액을 microtube에 1.
검체를 MacConkey배지에 배양하여 그람음성, 유당 분해하는 대장균으로 추정되는 균을 MacConkey배지에 계대 배양하여 35℃ 항온기에서 하룻밤 배양한 후, MicroScan Neg Breakpoint Combo Panel Type 44 (NBC44)카드를 이용하여 동정 검사와 항균제 감수성 검사를 실시하였다. 액체 배지 미량 희석법으로 상기 장비에 의한 최소억제농도(minimum inhibitory concentration,MIC)를 측정하였다[11]. 시험한 항균제는 Amikacin, Ampicillin, Aztreonam, Cefotaxime, Ceftazidime, Cefazolin, Cefepime, Cefoxitin, Ceftriaxone,Ciprofloxacin, Gentamicin,Imipenem, 및 Trimthoprim/sulfamethoxazole (SXT)등을 이용하였다.
성능/효과
CTX-M-8은 총 37균주에서 검출 되었으며 이중 16균 주 (43.2%)가 충남지역에서 분리되어 대전 7.7% 및 충북 18.2% 보다 높은 경향을 보였다. TLA는 충남지역에서 분리된 5균주(13.
ESBL을 검출하기 위해 PCR을 실시하였고 이 산물을 염기서열 분석하여 유전형을 확인한 결과 CTX-M-2(64.9%)가 가장 높은 빈도로 검출되었다.
MicroScan Walkaway 장비에서 ESBL균주로 가능성을 추정한 대장균 74 균주 중에서 Cefotaxime와 Cefotaxime/Clavulanic에서는 71균주 (95.9%)가 양성을 보였고 Ceftazidime과 Ceftazidime/Clavulanic을 이용한 이중 디스크 검사에서는 42균주 (57.6%)가 양성으로 나왔다. 74균주 중에서 3균주는 이 시험에서 음성을 보여주었다[Table3].
2% 보다 높은 경향을 보였다. TLA는 충남지역에서 분리된 5균주(13.5%)에서 검출된 반면 대전지역에서 분리된 균주에서는 검출되지 않았고 GES-1은 충남에서 분리된 2균주(5.4%)에서만 검출되었다. 본 연구에서는 TEM형 및 SHV형 ESBL은 검출되지 않았다.
Ranellou K 등[19]에 따르면 그리스에서 녹농균에도 PER-1을 생성하는 균주가 있음을 확인했으며 염색체 위치는 절단된 트랜스포손의 일부로 오히려 수평 유전자 전달보다 클론으로의 확장을 주장했다. blaPER-1은 대전, 충남, 충북에서 모두 검출되었으며 ESBL 양성 74균주 중 28균주가 나와 37.8%를 보였다. 김 등[20]에 따르면 A.
대전과 충남지역에서 수집한 E.coli CTX-M-9검출 10균주에서 재확인을 위한 단독 프라이머를 사용하여 PCR검사를 시행한 결과 947bp크기의 CTX-M-9가 10개 모두에서 검출되었다[Fig.2].
본 연구에서는 ESBL를 포함한 대장균으로 동정된 항균제의 내성률은 Aztreonam 30.8%, Cefotaxim30.9%, 그리고 Ceftazidime 32.2%으로 나타났으며 ESBL을 생성하는 균주는 β-lactam 항균제인 Aztreonam에 58.1%, Cefotaxim 100%, 그리고 Ceftazidime 63.5%로 나타나 내성을 주도하는 것이 ESBL 균임을 알 수 있었다.
4%)에서만 검출되었다. 본 연구에서는 TEM형 및 SHV형 ESBL은 검출되지 않았다.
본연구에서는 대장균에서는 74균주 중 blaCTX-M-2가 48건이 나와 64.9%가 검출되고 blaGES-1 2건이 나와 2.7%이었고 충남에서만 유일하게 발견되었다.
항균제 감수성 검사에 Amikacin, Ampicillin, Aztreonam, Cefazolin, Cefepime, Cefoxitin, Ceftriaxone, Ciprofloxacin, Gentamicin, lmipenem, Piperacillin/Tazobactam, Tobramycin, Trimthoprim/Sulfamethoxazole (SXT)의 항균제를 이용하였는데 검사 결과를 살펴보면, ESBL을 생성하는 균주는 β-lactam 항균제인 Aztreonam에 58.1%, Cefepime에 55.4%의 내성을 보였으며, 심지어 aminoglycoside계통인 Gentamicin에도 52.7%의 내성을 보였다.
후속연구
1%를 보였고 충남북, 대전에서 고르게 나오고 있음을 보여 주고 있다. 아울러, 항균제 감수성 검사에서 내성률의 증가함을 알 수 있어 더욱 현실적이고 체계적인 병원감염관리와 지속적인 내성 유전자의이동 경로에 대한 추적검사가 이루어져야 할 것으로 사료된다
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
β-lactam 제의 용도는?
Extendedspectrum-lactamases(ESBL)생성균주는 penicillin,좁은 범위 및 넓은 범위의 제3세대 cephalosporin과 monobactam등 carbapenem을 제외한 β-lactam계 항균제 대부분에 내성을 보이고 aminoglycoside, trimethoprim sulfamethoxasole등 여러 항균제에 내성 인 경우가 많아 치료 약제를 선택하기가 어려우며 ESBL 유전자가 plasmid에 의해 다른 균종으로 전파될 수 있기 때문에 이들에 대한 신속,정확한 검사가 중요하다[1-3]. β-lactam 제는 감염증 치료에 많이 사용되는 항생제이나.근래 이들 약제가 임상에서 많이 사용되면서 이들의 오,남용 및 자연내성에 대한 약제에 대한 내성균의 증가가 문제로 대두되었다.
β-lactam 제의 문제점은?
β-lactam 제는 감염증 치료에 많이 사용되는 항생제이나.근래 이들 약제가 임상에서 많이 사용되면서 이들의 오,남용 및 자연내성에 대한 약제에 대한 내성균의 증가가 문제로 대두되었다.β-lactam 제제에 대한 내성기전은 여러 가지가 있는데,그 중 가장 중요한 것은 β -lactamase에 의한 약제에 불활성화이다[4].
ESBL 생성숙주의 특징은?
Extendedspectrum-lactamases(ESBL)생성균주는 penicillin,좁은 범위 및 넓은 범위의 제3세대 cephalosporin과 monobactam등 carbapenem을 제외한 β-lactam계 항균제 대부분에 내성을 보이고 aminoglycoside, trimethoprim sulfamethoxasole등 여러 항균제에 내성 인 경우가 많아 치료 약제를 선택하기가 어려우며 ESBL 유전자가 plasmid에 의해 다른 균종으로 전파될 수 있기 때문에 이들에 대한 신속,정확한 검사가 중요하다[1-3]. β-lactam 제는 감염증 치료에 많이 사용되는 항생제이나.
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