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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 돈육으로 인한 식중독 예방에 대한 기초자료를 제공하고자 hblA와 hblD 유전자의 검출법(Ankolekar 등 2009)을 이용하여 돼지 분변에서 분리한 B. cereus 균주에서 설사 유발 용혈 성장 독소(hemolytic enterotoxin) 생성의 유·무 및 항균제 감수성 시험을 수행하였다.
- cereus에 대하여 항균성을 가지며, rutin을 동시에 사용하는 경우 항균 활성을 더 높이는 것으로 보고한 바 있다. 따라서 이와 같은 항생제에 대한 감수성 시험을 추후 수행하고자 한다.
제안 방법
- β-용혈성과 장 독소를 생성하는 B. cereus BY06를 돼지 분변에서 병원성 미생물로 간주하여 이 균주에 대한 항균제 최소억제농도와 항균제 감수성 시험을 실시하였으며, breakpoint를 적용하여 해석한 바 cephalothin, vancomycin, clindamycin, fusidic acid, gentamicin, ciprofloxacin, tetracycline 및 rifampin에 대해서는 감수성, penicillin G에 대해서는 내성을 나타내었다(Table 3).
- BY12의 hblA gene segment 의 PCR 증폭산물을 agarose gel에 전기영동한 후 band를 통하여 장 독소의 생성 유·무를 확인하였다(Fig. 2).
- PCR에 의한 증폭산물 5 ㎕를 2% agarose gel(Promega, Madision, WI, USA)의 홈에 넣고 20분간 전기영동하여 band 유·무를 확인하였다.
- 장 독소 생성의 유무의 확인은 Kim 등(2005)의 방법에 따라서 hemolysin BL(hblA) 유전자를 이용하여 PCR법으로 시험하였다. 동정한 균주를 Mueller-Hinton agar(Difco, USA)에 접종하여 37℃에서 하룻밤 배양한 집락을 증류수 50 ㎕에 부유시키고, 98℃에서 20분간 가열하여 DNA를 추출하였다. hblA 유전자 동정을 위해서 universal primer(forward primer의 서열은 5’-CGG GCG TTC TAG GGC ATA TTG AG-3’, reverse primer의 서열은 5’-GCG AGT AGT TTA TTA GGG ATT TTT TTC A-3’)를 사용하여 PCR 증폭하였다(Mantynen & Lindstrom 1998).
- 염기서열 분석을 통하여 얻은 각 균주의 염기서열은 blast network service를 이용하여 NCBI GenBank database의 염기서열과 비교하여 계통분류학적 유연관계를 분석하였으며, ClustalW multiple sequence alignment 프로그램을 이용하여 phylogenetic tree를 분석하였다. 또한, 더 정확하게 결과를 확인하기 위하여 분리된 두 균주의 생화학적 특성을 API 50CHB kit(Biomereux Co., France)를 사용하여 분석하였다. 탄수화물 이용능과 생화학적 특성을 판별하고, APIWEB(apiweb.
- 분리된 균주의 gyrase B(gyrB) 유전자 염기서열에 기초한 분자계통분류학적 분석을 이용하여 동정을 실시하였다. gyrB 유전자의 primer인 forward primer(5’-CCC AAG CTT AAC TGC ACT GGG AAA TYG THG AYA AYA G-3`) gyrB135와 reverse primer(5’-CGG AAT TCG GAT CCA CRT CGG CRT CBG TCA TRA T-3’) gyrB1510을 제작하였다(Yamada 등 1999; Wu & Ahn 2011).
- 배양 후, 혼탁한 환과 분홍색 집락을 나타낸 lecithinase 양성 코로니를 분리하였다(Cho 등 2008). 분리된 균주의 생화학적 특성을 조사하기 위해 API 50CHB kit (Biomereux Co., France)를 사용하여 탄수화물 이용능과 생화학적 특성을 시험한 후 APIWEB(apiweb.biomerieux.com)에 입력하여 조사하였다(Lee 등 2006).
- 5, 1, 2, 4, 8 및 16 ㎍/㎖)로 시험하였다. 시험균주 B. cereus 집락을 TSB에 혼탁시킨 후, McFarland 0.5관 탁도에 맞추어 10배로 희석한 후 steers replicator를 사용하여 접종하였고, 접종된 평판은 37℃에 18시간 배양 후 MIC를 판정하였다. 항균제 감수성 시험의 정도 관리를 위하여 Staphylococcus aureus(ATCC 33591)와 Escherichia coli(ATCC 25992)을 동시에 시험하였다(Kim 등 2008).
- 적리를 동반하는 돼지 분변에서 용혈성 균주를 분리 동정한 후, 장 독소 생성 유·무 및 항생제 감수성 시험을 수행하였다.
- PCR은 94℃에 4분간 예비가열한 후 94℃에서 1분간 열변성반응, 58℃에서 1분간 재결합반응, 72℃에서 1분간 중합반응의 과정을 30회 반복한 후 72℃에서 10분간 증폭시켰다. 증폭된 DNA 밴드는 agarose gel extraction kit(Intron biotechnology, Korea)를 이용하여 정제하였고, 얻어진 PCR 산물을 통해 염기서열 분석을 코스모진텍 유전자 해석 센터(Seoul, Korea)에 의뢰하였다. 염기서열 분석을 통하여 얻은 각 균주의 염기서열은 blast network service를 이용하여 NCBI GenBank database의 염기서열과 비교하여 계통분류학적 유연관계를 분석하였으며, ClustalW multiple sequence alignment 프로그램을 이용하여 phylogenetic tree를 분석하였다.
- , France)를 사용하여 분석하였다. 탄수화물 이용능과 생화학적 특성을 판별하고, APIWEB(apiweb.biomerieux.com)에 입력하여 조사하였다(Lee 등 2006).
- cereus 균주에 대한 최소억제농도(minimum inhibitory concentration, MIC) 항균제 감수성 시험은 National Committee for Clinical Laboratory Standards(NCCLS, 2002) 한천희석법으로 하였다. 항균제는 cephalothin, clindamycin, erythromycin, gentamicin, penicillin G, rifampin, tetracycline, vancomycin(Sigma, USA), ciprofloxacin(Miles Pharmaceuticals, USA) 및 fusidic acid (Dong Wha, Korea)로 총 10종류를 각 농도별(0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8 및 16 ㎍/㎖)로 시험하였다. 시험균주 B.
대상 데이터
- gyrB 유전자의 primer인 forward primer(5’-CCC AAG CTT AAC TGC ACT GGG AAA TYG THG AYA AYA G-3') gyrB135와 reverse primer(5’-CGG AAT TCG GAT CCA CRT CGG CRT CBG TCA TRA T-3’) gyrB1510을 제작하였다(Yamada 등 1999; Wu & Ahn 2011).
데이터처리
- 증폭된 DNA 밴드는 agarose gel extraction kit(Intron biotechnology, Korea)를 이용하여 정제하였고, 얻어진 PCR 산물을 통해 염기서열 분석을 코스모진텍 유전자 해석 센터(Seoul, Korea)에 의뢰하였다. 염기서열 분석을 통하여 얻은 각 균주의 염기서열은 blast network service를 이용하여 NCBI GenBank database의 염기서열과 비교하여 계통분류학적 유연관계를 분석하였으며, ClustalW multiple sequence alignment 프로그램을 이용하여 phylogenetic tree를 분석하였다. 또한, 더 정확하게 결과를 확인하기 위하여 분리된 두 균주의 생화학적 특성을 API 50CHB kit(Biomereux Co.
이론/모형
- gyrB 유전자의 primer인 forward primer(5’-CCC AAG CTT AAC TGC ACT GGG AAA TYG THG AYA AYA G-3`) gyrB135와 reverse primer(5’-CGG AAT TCG GAT CCA CRT CGG CRT CBG TCA TRA T-3’) gyrB1510을 제작하였다(Yamada 등 1999; Wu & Ahn 2011). gyrB 유전자를 클로닝하기 위한 polymerase chain reaction(PCR) 반응은 Lee 등(2008) 방법에 의해 수행하였다. PCR은 94℃에 4분간 예비가열한 후 94℃에서 1분간 열변성반응, 58℃에서 1분간 재결합반응, 72℃에서 1분간 중합반응의 과정을 30회 반복한 후 72℃에서 10분간 증폭시켰다.
- 균주의 분리는 Fricker 등(2007)의 방법에 따라서 실시하였고, 시료는 출혈을 동반하는 돼지 5마리의 설사 분변을 이용하였다. 즉, 돼지 분변 10 g을 멸균수 100 ㎖에 현탁시킨 후, 한 마리당 2개씩 총 10개의 mannitol egg yolk polymyxin(MYP) agar(Becton Dickinson, USA)에 도말하여 37℃에서 24시간 배양하였다.
- 분리한 B. cereus 균주에 대한 최소억제농도(minimum inhibitory concentration, MIC) 항균제 감수성 시험은 National Committee for Clinical Laboratory Standards(NCCLS, 2002) 한천희석법으로 하였다. 항균제는 cephalothin, clindamycin, erythromycin, gentamicin, penicillin G, rifampin, tetracycline, vancomycin(Sigma, USA), ciprofloxacin(Miles Pharmaceuticals, USA) 및 fusidic acid (Dong Wha, Korea)로 총 10종류를 각 농도별(0.
- 장 독소 생성의 유무의 확인은 Kim 등(2005)의 방법에 따라서 hemolysin BL(hblA) 유전자를 이용하여 PCR법으로 시험하였다. 동정한 균주를 Mueller-Hinton agar(Difco, USA)에 접종하여 37℃에서 하룻밤 배양한 집락을 증류수 50 ㎕에 부유시키고, 98℃에서 20분간 가열하여 DNA를 추출하였다.
- 5관 탁도에 맞추어 10배로 희석한 후 steers replicator를 사용하여 접종하였고, 접종된 평판은 37℃에 18시간 배양 후 MIC를 판정하였다. 항균제 감수성 시험의 정도 관리를 위하여 Staphylococcus aureus(ATCC 33591)와 Escherichia coli(ATCC 25992)을 동시에 시험하였다(Kim 등 2008).
성능/효과
- 1). API 50CHB kit를 이용한 생화학 테스트 결과, 균주 BY06는 Bacillus cereus와 99%의 상동성을, BY12 균주는 Bacillus cereus와 85.3%의 상동성을 나타내어(Table 2) gyrB 유전자 염기서열에 기초한 분석 결과와 유사함을 확인할 수 있었다.
- cereus BY06는 장 독소 분비 양성으로 판정됨에 따라 설사형 식중독균임이 확인되었다. B. cereus BY06를 이용한 항균제의 감수성 시험 결과, penicillin G에는 내성을 나타낸 반면 cephalothin, vancomycin, clindamycin, fusidic acid, gentamicin, ciprofloxacin, tetracycline 및 rifampin에 대하여 감수성을 나타냈다. 본 연구를 통해 돼지 분변에서 분리된 B.
- 그 결과, Bacillus spp. BY12는 인체에 유해한 장 독소를 생성하지 않았으며, B. cereus BY06은 549 bp에서 band가 선명하게 나타난 결과로부터 장 독소를 생성하는 것으로 확인되었다. 이 hblA gene은 B.
- Bacillus속 중 용혈성을 나타낸 두 균주의 gyrB 유전자염기서열에 기초한 분석을 실시한 결과, BY06와 BY12 균주는 Bacillus cereus와 99% 및 91%(Table 1)의 유사성을 나타내었으며, 이들의 계통분류학적 유연관계를 나타내는 phylogenic tree는 Fig. 1과 같다. Drancourt 등(2000)의 보고에 의하면 유전자가 99%의 상동성을 나타내면 동일한 species로 분류될 수 있으므로, 분리균주 BY06는 B.
- 돼지 분변에서 분리된 Bacillus속 균주 13개를 sheep blood agar plate에 37℃에서 24시간 동안 배양한 결과, 용혈성 균주 2종(BY06, BY12)을 분리하였으며, BY06 균주는 β-용혈성을 나타내었다.
- cereus BY06를 이용한 항균제의 감수성 시험 결과, penicillin G에는 내성을 나타낸 반면 cephalothin, vancomycin, clindamycin, fusidic acid, gentamicin, ciprofloxacin, tetracycline 및 rifampin에 대하여 감수성을 나타냈다. 본 연구를 통해 돼지 분변에서 분리된 B. cereus 균주는 설사를 유발하는 장 독소를 분비하며, penicillin G에 대한 내성을 확인하였다.
- 5 ㎍/㎖의 농도범위에서 감수성을 나타낸다고 보고한 바 있다. 본 연구에서도 선행 연구자의 연구 결과와 유사하게 B. cereus BY06에 대하여 항생제에 대한 항균 활성은 clindamycin, gentamicin, ciprofloxacin, rifampin에서 상대적으로 높게 나타났다. Lee 등(2002)은 B.
- 적리를 동반하는 돼지 분변에서 용혈성 균주를 분리 동정한 후, 장 독소 생성 유·무 및 항생제 감수성 시험을 수행하였다. 분리된 용혈성 균주 B. cereus BY06의 gyrB 유전자 염기서열을 분석한 결과, B. cereus와 99% 유사성을 나타내었다. PCR법에 의한 장 독소 유전자 검출 시험에서 B.
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