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문제 정의
- 양식어민들이 감염어를 진단하기에는 생물학적인 지식이 부족하여 육안 진단법에 의존하고 있다[4]. 그러므로 우리는 연쇄상구균증을 진단하는데 있어 양식 어민들이 쉽게 활용할 수 있도록 LAMP를 접목시키고자 한다.
- 이는 별도로 온도 구배를 두지 않고도 주형 DNA를 증폭하기 때문에 고가의 PCR 장비를 필요로 하지 않으며, PCR 증폭법보다 신속하게 처리할 수 있으며 장소 구애를 받지 않고 어류질병의 병원체에 대한 진단이 가능한 장점을 지니고 있다. 따라서 본 논문에서는 LAMP 법을 SYBR-green I을 이용하여 시각화시켰으며, 기존의 PCR과 LAMP 법을 비교 분석하여 S. parauberis에 대한 신속하고 정확한 진단법을 확립하고자 한다.
- 총 5개의 random primer의 LAMP 반응을 확인하고자 하였다. 20 pM의 F3,B3 primer와 40 pM의 FIP,BIP primer, 시약 1× reaction mix (20 mM Tris-HCI (pH 8.
제안 방법
- 1.5% NaCl-BHIB를 이용하여 배양조건에 따라 24시간 배양한 뒤, 1.5 ml e-tube에 배양액 500 μl를 옮겨 담은 후 14240× g, 5분간 원심분리하여 상층액은 버리고 침전된 균체를 사용하여 DNA를 추출하였다.
- 20 pM의 F3,B3 primer와 40 pM의 FIP,BIP primer, 시약 1× reaction mix (20 mM Tris-HCI (pH 8.8), 10 mM (NH4)2SO4, 10mM KCI, 2 mM MgSO4, 0.4% Triton X-100, 6 mM MgSO4 (New England Bioabs, Beverly, MA), 0.8 M betaine (Sigma-Aldrich Corporation, USA), 400 μm dNTP (TaKaRa Biotechnology Co., Ltd)를 총 25 μl의 반응액으로 조성하였다.
- Betaine의 최적 농도 확립을 위해 0 M, 0.2 M, 0.4 M, 0.6 M, 0.8 M, 1.0 M 을 첨가하여 LAMP 반응을 수행하였다. betaine은 GC 영역의 이차구조의 형성을 감소시켜 DNA의 증폭을 향상시켜주며, DNA의 녹는점인 염기 쌍 조성의 의존성을 제거시켜 중합효소 연쇄반응의 특이성을 개선해주는 것이다.
- Bst DNA polymerase의 최적 농도 확립을 위하여 4 U, 8 U, 12 U, 16 U, 20 U을 첨가하여 LAMP을 수행하였다. 두개의 primer (28, 84)는 다양한 ladder pattern으로 다양한 크기로 관찰 되었으며, primer 28은 대체적으로 DNA 신장이 농도별로 잘 이뤄진 반면에, primer 84는 4 U에서 조금은 연하게 신장된 것을 확인할 수 있었다(Fig.
- LAMP법과 PCR법의 민감도 확인은 배양액을 단계 희석하여 1.0×101~1.0×108 CFU/ml의 농도로 조정 하여 측정하였다.
- LAMP법을 이용한 S. parauberis의 최적 반응 조건을 확립하기 위해 MgSO4, betaine, dNTP, Bst DNA polymerase의 최적 농도를 구하였다.
- LAMP법을 이용한 S. parauberis의 특이적인 검출을 위해 최적 반응 시간을 확인하였다. 혼합물은 20 pM F3, B3 primer, 40 pM FIP와 BIP primer, template genmic DNA, 8 U Bst DNA polymerase large fragment, 1× ThermoPol Reaction Buffer (20 mM Tris-HCI (pH 8.
- LAMP법을 이용한 S. parauberis의 특이적인 검출을 위해 최적 반응 온도를 확인하였다. 혼합물은 20 pM F3, B3 primer, 40 pM FIP와 BIP primer, template genmic DNA, 8 U Bst DNA polymerase large fragment, 1× ThermoPol Reaction Buffer (20 mM Tris-HCI (pH 8.
- LAMP법을 이용한 S. parauberis의 특이적인 검출을 위해 최적 반응 조건을 확인하였다. MgSO4의 농도를 확립하기 위해 각각 0 mM, 2 mM, 4 mM, 6 mM, 8 mM을 첨가하여 최적 반응 조건을 확인하였고, betain은 0 M, 0.
- LAMP법에 의한 DNA 증폭은 PCR법에 의한 증폭 방법과 다르게 ladder pattern 으로 나타나게 된다. LAMP의 반응 확인 결과 5개(5, 17, 28, 54, 84)의 random primer 중 확연한 ladder pattern이 확인된 두 개의 primer (28, 84)을 선택하였으며, 이들을 비교 분석 및 최적 조건 확립을 SYBR Green I 및 전기영동을 통하여 확인하였다(Fig. 2).
- parauberis의 특이적인 검출을 위해 최적 반응 조건을 확인하였다. MgSO4의 농도를 확립하기 위해 각각 0 mM, 2 mM, 4 mM, 6 mM, 8 mM을 첨가하여 최적 반응 조건을 확인하였고, betain은 0 M, 0.2 M, 0.4 M, 0.6 M, 0.8 M, 1.0 M 을 첨가하여 확인하였다. dNTP는 0 mM, 0.
- PCR primer는 S. parauberis 표준균주의 AroK 유전자 서열을 이용하여 제작하였다[7](Fig. 1). PCR 수행을 위해 primer는 각각 20 pM과 AccuPower PCR premix (1 U Taq DNA poly-merase, 250 μm dNTP, 10 mM Tris-HCI, 40 mM KCI, 1.
- PCR 수행을 위해 primer는 각각 20 pM과 AccuPower PCR premix (1 U Taq DNA poly-merase, 250 μm dNTP, 10 mM Tris-HCI, 40 mM KCI, 1.5 mM MgCI2, stabilizer and tracking dye : Bioneer., Korea), template genomic DNA, 총 볼륨 20 μl 의 반응액을 조성하였다[7].
- Primer set은 4개의 primer로 구성된 target sequence의 6개의 특정 영역을 인지할 수 있는 두 개의 다음 inner primer (FIP: Forward inner primer, BIP: Backward inner primer)는 S. parauberis sequence의 상보적인 염기서열과 loop를 형성하는 sequence의 부분 TTTT spacer로 합하여 제작하였다[8]. 다음 두 개의 outer primer (F3: Forward outer primer, B3: Backward outer primer)는 각각 inner primer의 바깥쪽에 위치하도록 설계하였다.
- S. parauberis의 DNA는 Genomic DNA Extraction Kit (Bioneer., Korea)를 사용하여 추출하였다. 1.
- 0 M 을 첨가하여 확인하였다. dNTP는 0 mM, 0.2 mM, 0.4 mM, 0.8 mM, 1.0 mM으로 조성하였고, Bst DNA polymerase는 4 U, 8 U, 12 U, 16 U, 20 U을 첨가하여 최적 반응 조건을 확립하였다[7]. 증폭된 산물은 SYBR Green I 및 1× TAE Buffer 가 첨가된 1.
- dNTP의 최적 농도를 확립하기 위하여 각 반응액에 0 mM, 0.2 mM, 0.4 mM, 0.8 mM, 1.0 mM으로 첨가하여 LAMP 반응을 수행하였다. 그 결과 두 개의 primer (28, 84)는 0.
- 그 후, 산물은 SYBR Green I 및 1× TAE buffer가 첨가 된 1.5% agarose gel을 이용하여 50 V에서 40분간 전기영동 실시하고 ethidium bromide로 염색한 후 UV illumination상에서 관찰하였다.
- 그리고 1× TAE buffer (Tris-acetate-EDTA Bioneer, korea)가 첨가 된 1.5% agarose gel을 이용하여 50 V에서 40분간 전기영동을 실시하고 ethidium bromide로 염색한 후 UV illumination상에서 관찰하였다.
- parauberis sequence의 상보적인 염기서열과 loop를 형성하는 sequence의 부분 TTTT spacer로 합하여 제작하였다[8]. 다음 두 개의 outer primer (F3: Forward outer primer, B3: Backward outer primer)는 각각 inner primer의 바깥쪽에 위치하도록 설계하였다. 총 5개의 primer들은 Bioneer (Korea)에 주문 의뢰하여 제작하였다(Table 1).
- 본 실험에서 LAMP를 위한 최적 반응 조건은 총 25 μl를 기준으로 2 mM MgSO4, 0.2 mM dNTP, 8 U Bst DNA polymerase를 LAMP 표준 조건으로 결정하였다.
- 등온증폭법은 기존의 PCR에서 사용되는 Taq DNA polymerase와는 다르게 Bst DNA polymerase를 사용하며, auto-cycling DNA 합성에 의존한다[7]. 본 연구에서는 S. parauberis의 LAMP용 primer 총 5개(5, 17, 28, 54, 84) 중 DNA의 신장이 높은 random primer (28, 84)를 선정하여 비교 및 분석 하였다. LAMP 최적 온도는 55℃~65℃로써 너무 낮거나 높은 온도에서는 신장되지 않는 것을 확인할 수 있었다(Fig.
- 분석을 위해 S. parauberis의 LAMP DNA oligonucleotide primer의 sigma 인자를 BLAST program [1]으로 species-specific gene sequences shikimate kinase AroK (GenBank accession number: CP002471.1)을 선택하였다. 다음 sequence는 LAMP primer designing software인 Primer Explorer version 3(https://www.
- 증폭된 산물은 SYBR Green I 및 1× TAE Buffer 가 첨가된 1.5% agarose gel을 이용하여 50 V에서 40분간 전기영동 실시하고 ethidium bromide로 염색한 후 UV illumination상에서 관찰하였다.
- 다음 두 개의 outer primer (F3: Forward outer primer, B3: Backward outer primer)는 각각 inner primer의 바깥쪽에 위치하도록 설계하였다. 총 5개의 primer들은 Bioneer (Korea)에 주문 의뢰하여 제작하였다(Table 1).
- 총 5개의 random primer의 LAMP 반응을 확인하고자 하였다. 20 pM의 F3,B3 primer와 40 pM의 FIP,BIP primer, 시약 1× reaction mix (20 mM Tris-HCI (pH 8.
- 최적 반응 시간 확립을 위해서 Bst DNA polymerase large fragment를 첨가 후, DNA 변형 합성의 시간을 0분, 20분, 40분, 60분, 80분, 100분으로 각각 조절하였다. 증폭된 산물은 SYBR Green I 및 1× TAE Buffer 가 첨가된 1.
- 최적 반응 시간 확립을 위해서 Bst DNA polymerase large fragment를 첨가하여 반응 시켰으며, polymerization 시간을 0분, 20분, 40분, 60분, 80분, 100분으로 각각 조절하였다. 확인한 결과 primer 28에 비해 primer 84는 40분에서 신장이 연했으며, 결과적으로는 최소 40분 이상의 반응에서 신장되는 것을 확인할 수 있었다(Fig.
- 최적 반응 온도 확립을 위해서 DNA 변형 합성의 최적 온도를 각각 45℃, 55℃, 60℃, 65℃, 70℃에서 1시간 동안 등온 조건하에서 LAMP를 수행하였다. 그 결과, 두 개의 primer는 55℃~65℃에서 신장되었으나, primer 28이 좀 더 뚜렷하게 신장되는 것을 확인할 수 있었다(Fig.
- 최적 온도의 확립을 위하여 DNA 변형 합성의 온도를 45℃, 55℃, 60℃, 65℃, 70℃사이로 각각 등온 조건하에 실시하였으며, 증폭된 산물은 SYBR Green I 및 1× TAE Buffer 가 첨가된 1.5% agarose gel을 이용하여 50 V에서 40분간 전기영동 실시하고 ethidium bromide로 염색한 후 UV illumination상에서 관찰하였다.
- 최적 조건을 확립 한 후, LAMP 검출법의 민감도는 S. parauberis 배양액을 단계 희석하여 1.0×101~1.0×108 CFU/ml의 농도로 조정하여 Genomic DNA Extraction Kit (Bioneer., Korea)을 사용하여 DNA 추출 후 LAMP 검출법과 PCR법의 검출 한계 값을 비교 하였다.
- 최종적으로 최적 반응 온도 60℃, 반응 시간 60분, 4 mM MgSO4, 0.2 mM dNTP, 8 U Bst polymerase 을 최적 조건으로 결정하였다. 본 연구에서 개발한 LAMP 검출법은 다른 분자생물학적 검출법보다 민감하고 특이성이 높으며, 실용적인 진단법으로서 가치가 있다고 사료된다.
- 5% NaCl-BHIB에 25℃에서 48시간 배양한 배양액을 연속적으로 희석하여 1×108 CFU/ml 의 농도로 조정하였다. 희석된 배양액으로부터 1 ml을 취하여 DNA를 분리한 후 LAMP법과 PCR법을 수행하여 검출 한계 값을 비교하였다[7].
대상 데이터
- 1)을 선택하였다. 다음 sequence는 LAMP primer designing software인 Primer Explorer version 3(https://www.primerexplorer.jp/lamp3.0.0/index.html)를이용하여 S. parauberis의 LAMP용 primer 총 5개(5, 17, 28, 54, 84)의 random primer을 선정하여 디자인 하였다[8]
- 실험에 사용한 표준 균주 Streptococcus parauberis KCTC 3651은 미생물자원센터 KCTC (Korean Collection for Type Culture)에서 분양 받았다. 시험 균주는 1.
이론/모형
- 1. Partial nucleotide sequence of Shikimate kinase AroK gene of S. parauberis (GenBank accession number CP002471.1) used for the LAMP primer design. Nucleotide sequences used for primer design are indicated by boxes and arrows[7].
성능/효과
- parauberis의 LAMP용 primer 총 5개(5, 17, 28, 54, 84) 중 DNA의 신장이 높은 random primer (28, 84)를 선정하여 비교 및 분석 하였다. LAMP 최적 온도는 55℃~65℃로써 너무 낮거나 높은 온도에서는 신장되지 않는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 3). 최적 반응 시간 확립은 최소 40분부터 신장되었으며, 너무 짧은 시간에서는 증폭되지 않은 것을 확인할 수 있었다(Fig.
- MgSO4 의 최적 농도를 위해서는 0 mM, 2 mM, 4 mM, 6 mM, 8 mM을 첨가하여 LAMP를 수행한 결과 두 개의 primer (28, 84)는 2 mM 에서 6 mM 일 때, 신장이 가장 잘 이뤄진다는 같은 결과를 나타내었다. 이는 과량의 MgSO4는 LAMP 반응을 저해한다는 것을 알 수 있었다(Fig.
- PCR의 경우에는 1.0×104 CFU/ml 농도까지만 검출 할 수있는 반면에, LAMP의 검출 한계를 측정한 결과, 1.0×108 CFU/ml의 농도까지 검출 할 수 있는 것으로 확인되었다(Fig. 9).
- Bst DNA polymerase는 80℃ 이상에서는 불활성 되기 때문에, 반응액을 얼음에 냉각한 후에 첨가시킨다. Primer 28, 84는 전체적으로 증폭이 잘 되었으나, primer 28이 좀 더 진하게 증폭된 것을 확인할 수 있었다(Fig. 8).
- 0 mM으로 첨가하여 LAMP 반응을 수행하였다. 그 결과 두 개의 primer (28, 84)는 0.2 mM에서 0.8 mM 일 때, DNA 신장이 가장 잘 이루어진 것을 확인할 수 있었으며, 첨가하지 않거나 다량의 dNTP 사용은 오히려 저해된다는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 7).
- 최적 반응 온도 확립을 위해서 DNA 변형 합성의 최적 온도를 각각 45℃, 55℃, 60℃, 65℃, 70℃에서 1시간 동안 등온 조건하에서 LAMP를 수행하였다. 그 결과, 두 개의 primer는 55℃~65℃에서 신장되었으나, primer 28이 좀 더 뚜렷하게 신장되는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 3).
- 그리고 기존의 PCR 방법은 1.0×104 CFU/ml 의 검출 한계를 갖는 것으로 LAMP법이 더 민감하고 특이성이 높다고 확인할 수 있었다(Fig. 7).
- Bst DNA polymerase의 최적 농도 확립을 위하여 4 U, 8 U, 12 U, 16 U, 20 U을 첨가하여 LAMP을 수행하였다. 두개의 primer (28, 84)는 다양한 ladder pattern으로 다양한 크기로 관찰 되었으며, primer 28은 대체적으로 DNA 신장이 농도별로 잘 이뤄진 반면에, primer 84는 4 U에서 조금은 연하게 신장된 것을 확인할 수 있었다(Fig. 8).
- 9). 이는 LAMP법은 일반 PCR법에 비해 보다 높은 검출 한계를 갖고 있는 것을 확인 할 수 있었다.
- 3). 최적 반응 시간 확립은 최소 40분부터 신장되었으며, 너무 짧은 시간에서는 증폭되지 않은 것을 확인할 수 있었다(Fig. 4). MgSO4는 2 mM~6 mM로 과량으로 첨가될 시, 신장을 저해하는 것을 확인할 수 있었다(Fig.
- 최적 반응 시간 확립을 위해서 Bst DNA polymerase large fragment를 첨가하여 반응 시켰으며, polymerization 시간을 0분, 20분, 40분, 60분, 80분, 100분으로 각각 조절하였다. 확인한 결과 primer 28에 비해 primer 84는 40분에서 신장이 연했으며, 결과적으로는 최소 40분 이상의 반응에서 신장되는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 4).
후속연구
- 2 mM dNTP, 8 U Bst polymerase 을 최적 조건으로 결정하였다. 본 연구에서 개발한 LAMP 검출법은 다른 분자생물학적 검출법보다 민감하고 특이성이 높으며, 실용적인 진단법으로서 가치가 있다고 사료된다.
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