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문제 정의
- PCC-LAMP의 특이적 검출을 위하여 반응 최적 온도를 확인하고자 하였다. 조성은 PCC-pBX437 클론 1 ng/μl과 20 pM 내부 프라이머(inner primers), 10 pM 외부 프라이머(outer primers), 8 U Bst DNA polymerse large fragment (New England Biolabs, USA), 1× ThermoPol Reaction Buffer [20 mM Tris-HCl, 10 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4, 0.
- 본 연구는 배추에 무름병을 일으키는 PCC를 보다 간단한 방법으로 검출하기 위하여 loop-mediated isothermal amplification (LAMP)를 이용한 진단법을 개발하였다. PCC-LAMP로 명명된 본 진단법은 PCC의 lytic murein transglycolase 유전자의 일부를 포함하는 클론을 제작하여 최적조건이 확립되었으며 61℃에서 최적 반응을 보이는 것으로 확인되었다.
- 본 연구에서는 현장 적용성이 높은 LAMP법을 이용하여, 보다 신속하고 간편하게 배추의 세균성 무름병을 유발하는 PCC를 검출할 수 있는 진단법을 새로이 개발하고자 하였다.
제안 방법
- 4개의 프라이머에 대한 PCC-LAMP의 특이성을 확인하기 위하여 프라이머를 하나 또는 두 개를 제외하여 조성한 후 실험을 수행하였다. 4개의 프라이머가 모두 포함된 positive control을 제외하고는 모두 증폭이 이루어지지 않았다(Fig.
- 5% agarose gel을 이용하여 100 V에서 25분간 전기영동(Mupid-one, Advance, Japan)하였다. Agarose gel은 ethidium bromide (Sigma Chemical Co.)로 염색하여 UV상에서 관찰하였다.
- 이후 1시간 동안 DNA 변형합성을 진행하였고, 80℃에서 10분간 반응시킨 후 종료하였다. DNA 변형 합성의 최적 온도 측정은 50.0℃-65.0℃ 사이에서 각기 등온조건하에서 실시하였으며, 각 LAMP 반응이 끝난 후 증폭산물들은 1.5% agarose gel을 이용하여 100 V에서 25분간 전기영동(Mupid-one, Advance, Japan)하였다. Agarose gel은 ethidium bromide (Sigma Chemical Co.
- ExicyclerTM Quantitative Thermal Block (Bioneer)을 이용하여 Real-time LAMP를 수행하였다. 이는 이중가닥에 결합하여 형광을 나타내는 SYBR Green I을 이용함으로써 증폭산물을 형광을 통해서 쉽게 확인하기 위함이다.
- PCC-LAMP에서는 네 개의 특이 프라이머에 의한 염기서열 특이성이 요구되므로 4개의 프라이머 중 하나 혹은 두 개 이상을 제외시켜 조성하고 정상적인 증폭산물과 비교하여 프라이머의 특이성을 확인하였다. LAMP 조건은 본 연구에서 확립된 표준조건으로 수행하였다.
- 이는 이중가닥에 결합하여 형광을 나타내는 SYBR Green I을 이용함으로써 증폭산물을 형광을 통해서 쉽게 확인하기 위함이다. LAMP 조건은 확립된 표준조건을 따르며, 60분의 반응 동안 1분 간격으로 형광 값을 측정하였다. 또한 반응이 끝난 tube를 UV하에서 관찰하여 육안으로도 형광을 확인하였다.
- LAMP 프라이머 디자인 소프트웨어인 Primer Explorer (http://primerexplorer.jp/e/index.html)를 이용하여 PCC 특이 LAMP용 프라이머를 제작하였다. PCC-LAMP의 forward 프라이머인 Inner F는 PCC anti-sense sequence의 상보적인 염기서열(inner-sense)과 TTTT spacer 그리고 loop를 형성하는 염기서열(loop-sense)의 부분을 합한 것으로 설계되었으며, 이에 따라 44 nt의 long-nucleotide로 제작되었다.
- PCC-LAMP가 PCC에 특이적인지 확인하기 위하여, PCC가 아닌 다른 균주들의 Genomic DNA를 주형으로 사용하여 각기 PCC-LAMP를 수행하였다. 사용된 균주는 Xanthomonas oryzae pv.
- PCC-LAMP에서는 네 개의 특이 프라이머에 의한 염기서열 특이성이 요구되므로 4개의 프라이머 중 하나 혹은 두 개 이상을 제외시켜 조성하고 정상적인 증폭산물과 비교하여 프라이머의 특이성을 확인하였다. LAMP 조건은 본 연구에서 확립된 표준조건으로 수행하였다.
- PCC-LAMP의 검출한계를 확인하기 위하여 PCC-pBX437 클론을 1×106부터 1×102 copy수까지 단계적으로 희석하여 실험을 수행하였다.
- PCC-LAMP의 기질 특이성을 분석하기 위하여 PCC 외의 병원균의 genomic DNA를 주형으로 하여 실험을 수행하였다. Positive control을 제외하고 다른 병원균에서는 PCC-LAMP 가 반응하지 않은 것을 확인하였다(Fig.
- PCC-LAMP의 증폭산물을 전기영동 과정 없이 형광으로 확인하기 위하여 SYBR Green I을 포함하여 real-time LAMP를 수행하여 형광도를 측정하였고, 반응이 끝난 tube는 UV하에서 육안으로 형광 검출 여부를 확인하였다(Fig. 6A). Real-time LAMP의 형광 증가 그래프 상에서는 positive control, 즉 프라이머와 template가 모두 존재할 때 증폭이 이루어짐이 확인되었다(Fig.
- PCC-LAMP의 최적 반응온도를 확인하기 위하여 반응 온도를 50.0℃-65.0℃으로 각기 등온조건을 유지하고 실험을 수행하였다. 50.
- PCC-LAMP의 최적조건을 확인하기 위하여 ERB3 F/R 프라이머를(9) 이용하여 PCR을 수행하였고(Table 2), 이 PCR 생성물을 삽입시킨 PCC 클론을 제작하였다. 본 클론은 PCC의 lytic murein transglycolase 유전자의 일부인 437 bp가 pBX vector에 포함되어 있도록 제작되었으며, PCC-pBX437라 명명하였고, 클론 PCC-pBX437는 최적조건 확인, 민감도 확인 등의 실험에 PCR 주형으로 사용되었다.
- PCC-pBX437 클론을 1×106부터 1×102까지 단계적으로 희석하여 주형으로 사용하였으며, LAMP 조건은 본 연구에서 확립된 표준조건으로 수행하였다.
- PCC를 검출함에 있어 PCC-LAMP의 검출한계를 측정하기 위하여 초기 기질 양에 따른 PCC-LAMP를 각기 수행하였다. PCC-pBX437 클론을 1×106부터 1×102까지 단계적으로 희석하여 주형으로 사용하였으며, LAMP 조건은 본 연구에서 확립된 표준조건으로 수행하였다.
- larvae (ATCC25748), Escherichia coli (ATCC29552)이며 Genomic DNA를 추출하여 같은 조건하에 1 ng/μl로 각각 주형가닥으로 하여 실험을 수행하였고, 이를 positive control과 비교하였다.
- 균주의 genomic DNA 추출은 AccuprepⓇ Genomic DNA Extraction kit (Bioneer Inc., Korea)를 사용하였다. 추출방법은 제조사의 지시를 따라 수행하였으며, 추출된 Genomic DNA 시료는 분광광도계(Eppendorf, Germany)를 이용하여 정량하였다.
- Reverse 프라이머인 Inner R도 마찬가지로 PCC sense sequence의 상보적인 염기서열 (inner-antisense)과 TTTT spacer, loop를 형성하는 sequence (loop-antisense)의 부분으로 설계되었으며, 이에 따라 역시 44 nt의 long-nucleotide로 제작되었다. 또한 Outer F와 Outer R 프라이머는 각각 inner 프라이머의 바깥쪽에 위치하도록 설계하였으며 각기 19 nt의 크기로 제작하였다. 이 프라이머들은 Bionics 사(Korea)에 주문 의뢰하여 제작하였으며 inner 프라이머들에 대해서는 PAGE 정제 된 것을 사용하였다(Fig.
- 또한 PCC의 5균주(KACC10371, KACC10401, KACC10408, KACC10566, KACC13960)의 Genomic DNA 1 ng/μl를 각각 주형으로 하여 실험을 수행하여 PCC에 대한 PCC-LAMP의 반응성을 확인하였다.
- 5A). 또한 PCC의 5균주의 genomic DNA를 주형으로 하여 실험을 수행함으로써 PCC에 대한 PCC-LAMP의 반응성을 확인하였다. PCC-pBX437클론으로 실험을 수행했을 때와 마찬가지로 PCC genomic DNA에서도 높은 반응성을 보이는 것을 확인하였다(Fig.
- LAMP 조건은 확립된 표준조건을 따르며, 60분의 반응 동안 1분 간격으로 형광 값을 측정하였다. 또한 반응이 끝난 tube를 UV하에서 관찰하여 육안으로도 형광을 확인하였다.
- 6B). 또한 육안으로 확인했을 때, template를 포함하지 않은 negative control (tube1)에서 약간의 형광이 나타나는 것이 확인되었지만 프라이머를 포함하지 않은 negative control (tube2)의 경우에서 봤을 때 프라이머의 비특이적 dimer 형성으로 인한 형광으로 판단하였다. 특히 SYBR Green I에 의한 육안 판별은 굳이 real-time LAMP를 위해 고가의 장비를 사용하지 않더라도 LAMP 반응 후, tube에 직접 SYBR Green I을 첨가해주는 것만으로도 확인이 가능함을 확인하였다(자료 미제시).
- 실험실에서 배양된 균주가 아닌 실제 시료에서도 PCC-LAMP 적용이 가능한지 알아보기 위하여 무름병 증상을 보이는 배추의 genomic DNA를 PCC-LAMP로 진단하였고, 무름병에 걸리지 않은 배추와 감자의 genomic DNA를 PCC-LAMP로 진단한 결과와 비교하였다. 무름병에 걸리지 않은 배추와 감자는 증폭되지 않은 반면, 무름병 증상을 보이는 배추는 PCC-LAMP에 의해 증폭됨을 확인하였다(Fig.
- 실험실에서 배양된 균주가 아닌, 실제 시료에서도 PCCLAMP가 적용가능한지 확인하기 위하여, 무름병 증상을 보이는 배추의 genomic DNA를 추출하여 PCC-LAMP를 수행하였다. 동시에 무름병에 걸리지 않은 배추와 감자의 genomic DNA를 주형으로 하여 PCC-LAMP를 수행함으로써 실험 결과를 비교· 분석하였다.
- , Korea)를 사용하였다. 추출방법은 제조사의 지시를 따라 수행하였으며, 추출된 Genomic DNA 시료는 분광광도계(Eppendorf, Germany)를 이용하여 정량하였다.
대상 데이터
- 조성은 PCC-pBX437 클론 1 ng/μl과 20 pM 내부 프라이머(inner primers), 10 pM 외부 프라이머(outer primers), 8 U Bst DNA polymerse large fragment (New England Biolabs, USA), 1× ThermoPol Reaction Buffer [20 mM Tris-HCl, 10 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4, 0.1% Triton X-100, New England Biolabs, USA], 10 mM dNTP, 5% DMSO, DW로 총 25 μl의 반응액을 조성하였다.
데이터처리
- 동시에 무름병에 걸리지 않은 배추와 감자의 genomic DNA를 주형으로 하여 PCC-LAMP를 수행함으로써 실험 결과를 비교· 분석하였다.
성능/효과
- 0℃으로 각기 등온조건을 유지하고 실험을 수행하였다. 50.4℃부터 63.9℃의 범위에서 증폭이 가능함을 확인되었다. 특히 50.
- 본 연구는 배추에 무름병을 일으키는 PCC를 보다 간단한 방법으로 검출하기 위하여 loop-mediated isothermal amplification (LAMP)를 이용한 진단법을 개발하였다. PCC-LAMP로 명명된 본 진단법은 PCC의 lytic murein transglycolase 유전자의 일부를 포함하는 클론을 제작하여 최적조건이 확립되었으며 61℃에서 최적 반응을 보이는 것으로 확인되었다. 또한 최적 조건 하에서 PCC-pBX437 클론의 1×103copy수의검출한계를 확인하였다.
- 또한 PCC의 5균주의 genomic DNA를 주형으로 하여 실험을 수행함으로써 PCC에 대한 PCC-LAMP의 반응성을 확인하였다. PCC-pBX437클론으로 실험을 수행했을 때와 마찬가지로 PCC genomic DNA에서도 높은 반응성을 보이는 것을 확인하였다(Fig. 5B).
- 본 연구에서는 현장에서 신속하게 진단하기 위해 loop-mediated isothermal amplification법을 이용하여 1시간 내에 등온에서 검출 가능한 진단법을 개발하였으며, 이를 PCC-LAMP법이라 명명하였다. PCC의 lytic murein transglycolase 유전자를 특이적으로 증폭시키는 4개의 프라이머를 제작하였으며 최적 온도가 61℃임을 확인하고 최적 조건을 확립하였다. 최적 조건을 바탕으로 4개의 프라이머가 1×103copies까지 검출하는 민감성을 확인할 수 있었다.
- PCC-LAMP의 기질 특이성을 분석하기 위하여 PCC 외의 병원균의 genomic DNA를 주형으로 하여 실험을 수행하였다. Positive control을 제외하고 다른 병원균에서는 PCC-LAMP 가 반응하지 않은 것을 확인하였다(Fig. 5A). 또한 PCC의 5균주의 genomic DNA를 주형으로 하여 실험을 수행함으로써 PCC에 대한 PCC-LAMP의 반응성을 확인하였다.
- 6A). Real-time LAMP의 형광 증가 그래프 상에서는 positive control, 즉 프라이머와 template가 모두 존재할 때 증폭이 이루어짐이 확인되었다(Fig. 6C). 이는 전기영동 상에서도 동일한 결과를 나타내었다(Fig.
- enterica, Paenibacillus larvae subsp. larvae, Escherichia coli의 5균주에 음성 반응이 확인된 PCC-LAMP는 PCC 배양 균주의 genomic DNA를 추출하였을 때와 실제 무름병 증상을 보이는 배추 시료에서의 양성 반응을 확인하여 PCC에 대한 특이성과 높은 반응성이 증명되었다.
- 그 결과, copy수가 적어질수록 반응성이 단계적으로 낮아지는 것을 확인하였으며 1×106부터 1×103 copy수까지 증폭이 이루어졌음을 확인하였다(Fig. 4).
- 무엇보다도 PCC-LAMP은 실험실 내의 환경에서 검출뿐만 아니라 현장 적용에 초점을 맞추었다. 등온 증폭이라는 특징을 가지는 LAMP법을 도입함으로써 고가의 장비가 필요 없어 항온수조 등의 간단한 장비만을 가지고 PCC 검출이 가능함을 확인하였다. 또한 SYBR Green I을 이용함으로써 형광 발현을 통하여 증폭산물을 확인할 수 있어, 전기영동 과정을 생략할 수 있어 더욱 간단한 진단이 가능함이 입증되었다.
- 3). 따라서 PCC-LAMP는 프라이머에 특이성이 높아 반응을 위해서는 4개의 프라이머가 모두 필요함을 확인하였다.
- 7). 따라서 실제 시료에서도 PCC-LAMP가 적용 가능함이 확인되었다.
- 등온 증폭이라는 특징을 가지는 LAMP법을 도입함으로써 고가의 장비가 필요 없어 항온수조 등의 간단한 장비만을 가지고 PCC 검출이 가능함을 확인하였다. 또한 SYBR Green I을 이용함으로써 형광 발현을 통하여 증폭산물을 확인할 수 있어, 전기영동 과정을 생략할 수 있어 더욱 간단한 진단이 가능함이 입증되었다. 다만 SYBR Green I은 UV 하에서만 관찰이 가능하므로, 만일 육안으로 증폭산물을 확인 할 수 있는 방법이 좀 더 개발된다면 PCC-LAMP는 현장에서의 PCC 검출에 매우 유용한 진단법으로 응용될 수 있을 것으로 기대된다.
- 실험실에서 배양된 균주가 아닌 실제 시료에서도 PCC-LAMP 적용이 가능한지 알아보기 위하여 무름병 증상을 보이는 배추의 genomic DNA를 PCC-LAMP로 진단하였고, 무름병에 걸리지 않은 배추와 감자의 genomic DNA를 PCC-LAMP로 진단한 결과와 비교하였다. 무름병에 걸리지 않은 배추와 감자는 증폭되지 않은 반면, 무름병 증상을 보이는 배추는 PCC-LAMP에 의해 증폭됨을 확인하였다(Fig. 7). 따라서 실제 시료에서도 PCC-LAMP가 적용 가능함이 확인되었다.
- 최적 조건을 바탕으로 4개의 프라이머가 1×103copies까지 검출하는 민감성을 확인할 수 있었다. 본 연구에서 개발된 PCC-LAMP법은 특이성 검사를 통해 PCC만이 특이적으로 검출됨을 확인하였으며, 이는 실제 시료에서도 적용 가능함을 확인하였다. PCC-LAMP법을 통하여 PCC를 신속하고 정확하게 검출함으로써 현장에서 유용하게 적용될 수 있을 것으로 사료된다.
- 최적 조건을 바탕으로 4개의 프라이머가 1×103copies까지 검출하는 민감성을 확인할 수 있었다.
- 또한 육안으로 확인했을 때, template를 포함하지 않은 negative control (tube1)에서 약간의 형광이 나타나는 것이 확인되었지만 프라이머를 포함하지 않은 negative control (tube2)의 경우에서 봤을 때 프라이머의 비특이적 dimer 형성으로 인한 형광으로 판단하였다. 특히 SYBR Green I에 의한 육안 판별은 굳이 real-time LAMP를 위해 고가의 장비를 사용하지 않더라도 LAMP 반응 후, tube에 직접 SYBR Green I을 첨가해주는 것만으로도 확인이 가능함을 확인하였다(자료 미제시). 프라이머 이합체(primer dimer)에 의한 형광은 증폭산물에 의한 형광에 비교했을 때 비교적 약하기 때문에, SYBR Green I을 이용한다면 전기영동 과정 없이 쉽게 LAMP 증폭산물을 확인할 수 있을 것으로 사료된다.
후속연구
- 본 연구에서 개발된 PCC-LAMP법은 특이성 검사를 통해 PCC만이 특이적으로 검출됨을 확인하였으며, 이는 실제 시료에서도 적용 가능함을 확인하였다. PCC-LAMP법을 통하여 PCC를 신속하고 정확하게 검출함으로써 현장에서 유용하게 적용될 수 있을 것으로 사료된다.
- 또한 SYBR Green I을 이용함으로써 형광 발현을 통하여 증폭산물을 확인할 수 있어, 전기영동 과정을 생략할 수 있어 더욱 간단한 진단이 가능함이 입증되었다. 다만 SYBR Green I은 UV 하에서만 관찰이 가능하므로, 만일 육안으로 증폭산물을 확인 할 수 있는 방법이 좀 더 개발된다면 PCC-LAMP는 현장에서의 PCC 검출에 매우 유용한 진단법으로 응용될 수 있을 것으로 기대된다.
- 특히 SYBR Green I에 의한 육안 판별은 굳이 real-time LAMP를 위해 고가의 장비를 사용하지 않더라도 LAMP 반응 후, tube에 직접 SYBR Green I을 첨가해주는 것만으로도 확인이 가능함을 확인하였다(자료 미제시). 프라이머 이합체(primer dimer)에 의한 형광은 증폭산물에 의한 형광에 비교했을 때 비교적 약하기 때문에, SYBR Green I을 이용한다면 전기영동 과정 없이 쉽게 LAMP 증폭산물을 확인할 수 있을 것으로 사료된다.
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