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문제 정의
- 본 연구는 측면유동 면역 어세이 정량분석장치의 성능 향상을 위한 것으로서 그 동안 관련 분석장치에서 사용되지 않던 컬러 카메라를 이용하였으며 얻어지는 컬러 이미지를 각 요소(적색(red, R), 녹색(green, G), 청색(blue, B))로 분리하고, 이 중 시험라인의 신호정보 대역을 포함하고 있지만 잡음파장 대역은 포함하고 있지 않은 요소만을 이용하여 정량 분석함에 관한 것이다[11]. 대부분의 컬러 이미지 센서는 센서로 빛을 받아들여 이를 전기신호로 변환함에 앞서 이미 베이어 필터(Bayer filter)를 장착하고 있고 필터를 통과한 개별 색 요소가 별도로 저장, 이용가능하기 때문에 감도 향상을 위해 대역필터(band-pass filter) 추가 및 이를 위한 복잡한 이미지 처리과정이 필요치 않다.
- 그림 2의 (a)와 같이 다공성 나이트 로셀룰로우즈 맴브레인(porous nitrocellulose membrane, HF13504S00, Millipore, Billerica, MA, USA)에 도포장치(dispensing module, Matrix 1600, Kinematic Automation, Sonora, CA, USA)를 이용하여 폭이 1 mm, 도포 속도는 12 cm/sec, 유량은 1 ul/cm가 되도록 색을 띄고 있는 입자(particle, 0212, Carboxyl-Adembeads, Ademtech, Pessac, France) 용액을 뿌려준 후, 24시간 동안 건조시켰다. 이는 측면유동 면역 어세이의 시험라인 형성을 실제 항원을 포함한 샘플의 사용 없이 손쉽게 모사하기 위해 제작 된 것이며 본 연구에서 제안된 정량분석 리더 및 분석방법을 사전 검증하기 위해 사용되었다. 그림 2의 (b)와 같이 뿌려지는 입자의 농도는 0.
제안 방법
- 음성인 경우, 혈액 내 CK-MB의 농도는 CK농도의 5%보다 낮은 것으로 보고되었다[18-19]. 제조된 샘플 용액은 어세이의 샘플 주입구(sample inlet)를 통해 주입되었으며 완전한 항원-항체반응을 위해 어세이 사용 설명서에 명기된 바와 같이 15분 대기 후, 원래의 하우징(housing)에서 분리하여 그림 3(b)와 같이 본 연구를 위해 제작된 리더에 맞게 설계, 제작된 하우징에 조립되어 정량분석을 수행하였다.
- 단색 영상의 분석 및 이를 통한 레이블링 입자의 정량화를 위해서 획득된 이미지에서 시험라인을 포함한 관심영역(region of interest, ROI)을 지정, 해당 영역의 영상을 저장한 후, 이의 각 픽셀 강도(단색의 경우, 명암 강도)를 구하고 이의 평균값을 취했다. 반면에 컬러 영상의 분석은 획득된 이미지를 C++ 소프트웨어로 직접 코딩(coding)한 프로그램을 사용하여 각 색상요소로 분리(R, G, B color channel separation)한 후, 분리된 각 색상 요소의 이미지를 대상으로 앞서 설명한 단색 영상의 분석법을 똑같이 적용하였다.
- 그림 6은 그림 1의 정량분석 리더와 그림 2의 측면유동 면역 어세이 모사장치를 사용하여 단색 이미지와 컬러 이미지(이 중에서 입자의 농도변화에 가장 민감한 청색 분리 이미지)를 획득하고 각각 분석한 결과를 보여주고 있다. 또한 앞서 설명한 맴브레인의 배경과 시험라인에 대한 평균 픽셀 강도의 비율을 계산하는 방법을 적용하였다.
- 레이블링 입자를 다공성 멤브레인에 뿌려 제작된 측면유동 면역 어세이 모사(simulation)장치를 사용하여 고안된 정량분석방법을 사전 검증하였으며 급성심근경색(acute myocardial infarction, AMI)진단을 위한 상용화된 측면유동 면역 어세이를 이용하여 제안된 리더의 성능을 최종 검증하였다. 각 검증단계에 있어 컬러 이미지 센서를 이용한 정량 분석 결과를 기존의 단색 이미지 센서를 이용한 방법과 비교함으로써 성능의 향상 정도를 비교 평가하였다.
- 단색 영상의 분석 및 이를 통한 레이블링 입자의 정량화를 위해서 획득된 이미지에서 시험라인을 포함한 관심영역(region of interest, ROI)을 지정, 해당 영역의 영상을 저장한 후, 이의 각 픽셀 강도(단색의 경우, 명암 강도)를 구하고 이의 평균값을 취했다. 반면에 컬러 영상의 분석은 획득된 이미지를 C++ 소프트웨어로 직접 코딩(coding)한 프로그램을 사용하여 각 색상요소로 분리(R, G, B color channel separation)한 후, 분리된 각 색상 요소의 이미지를 대상으로 앞서 설명한 단색 영상의 분석법을 똑같이 적용하였다.
- 이는 상용화된 어세이로서 전혈(whole blood) 샘플에서 심근경색과 관련된 myoglobin과 CK-MB(creatine kinase(CK)-MB)를 정량 측정하기 위한 것이다[15-17]. 본 연구를 위해 전혈 샘플은 가용하지 않았으므로 혈청제(serum, 22000, SeraCare Life Sciences Inc., Milford, MA, USA)에 myoglobin(8M50, HyTest Ltd., Turku, Finland)과 CKMB(1-028, Biospecifics, Lynbrook, NY, USA)를 각각 53/107/214 ng/ml, 4/8/16 ng/ml가 되도록 제조하였다. 이와 같은 농도는 임상적인 양성(positive), 음성(negative) 판정의 기준을 반영한 것으로 심근경색과 관련하여 음성인 혈액의 myoglobin과 CK의 농도는 각각 6~85 ng/ml, 38~174 ng/ml이다.
- , Deajeon, Korea)를 통해 백색 LED(light emitting diode) 조명장치와 CCD(charge-coupled device) 카메라, 판넬 컴퓨터에 전원을 공급하였다. 앞서 서술한 바와 같은 각 검증 단계에서 컬러 CCD를 이용한 정량분석결과를 기존의 단색 CCD의 결과와 비교하기 위하여 같은 리더에 컬러(CMLN13S2C-CS, Sony ICX445AQ CCD installed, Point Grey Research, Richmond, BC, Canada), 단색(CMLN13S2M-CS, Sony ICX445AL CCD installed, Point Grey Research, Richmond, BC, Canada) CCD를 번갈아 장착하여 측정하였다. 시험라인의 영상을 획득함에 있어 적절한 배율과 초점 조정을 위해 렌즈(M1214-MP2, 12 mm focal length, Computar, Tokyo, Japan) 조립체(lens assembly)를 사용하였다.
- 즉 같은 농도의 샘플이라 하더라도 조명의 밝고 어두운 정도에 따라 시험라인의 픽셀 강도는 변화한다. 이를 보정해 주기 위해 본 연구에서는 다공성 맴브레인 배경의 픽셀 강도 평균값(I(b))과 시험라인의 픽셀 강도 평균값(I(t))의 비율(I(b)/I(t))을 계산하여 이를 측정목표물질의 농도로 변환하는 방식을 사용하였다. 이러한 비율 측정은 예를 들어 조명이 어두워질 경우, 픽셀 강도의 저하 정도가 배경과 시험라인에 동일한 정도로 반영되므로 비율 계산 시 서로 상쇄될 수 있어 이를 효과적으로 보정해 줄 수 있다.
- , Seoul, Korea)와 관련 소프트웨어가 측정의 제어를 위해 사용되었다. 전원공급장치(power circuit board, LVS-PN-2312, Cylod Inc., Deajeon, Korea)를 통해 백색 LED(light emitting diode) 조명장치와 CCD(charge-coupled device) 카메라, 판넬 컴퓨터에 전원을 공급하였다. 앞서 서술한 바와 같은 각 검증 단계에서 컬러 CCD를 이용한 정량분석결과를 기존의 단색 CCD의 결과와 비교하기 위하여 같은 리더에 컬러(CMLN13S2C-CS, Sony ICX445AQ CCD installed, Point Grey Research, Richmond, BC, Canada), 단색(CMLN13S2M-CS, Sony ICX445AL CCD installed, Point Grey Research, Richmond, BC, Canada) CCD를 번갈아 장착하여 측정하였다.
- 그림 5. 측면유동 면역 어세이 모사장치의 원본 컬러, 적색 분리, 녹색 분리, 청색 분리 이미지들의 픽셀 강도 프로파일 비교.
대상 데이터
- 본 연구에서는 정량 측면유동면역어세이 시스템의 성능향상을 위하여 컬러 카메라의 베이어 필터링된 이미지를 사용하였다. 특정 컬러 요소의 이미지를 사용하였을 경우, 기존의 단색 카메라를 사용한 방법보다 향상된 응답곡선의 기울기를 얻었고 이는 정량분석 시스템의 감도를 향상시켜 이를 이용한 면역진단기기의 성능 문제를 개선 할 수 있음을 보였다.
- 앞서 서술한 바와 같은 각 검증 단계에서 컬러 CCD를 이용한 정량분석결과를 기존의 단색 CCD의 결과와 비교하기 위하여 같은 리더에 컬러(CMLN13S2C-CS, Sony ICX445AQ CCD installed, Point Grey Research, Richmond, BC, Canada), 단색(CMLN13S2M-CS, Sony ICX445AL CCD installed, Point Grey Research, Richmond, BC, Canada) CCD를 번갈아 장착하여 측정하였다. 시험라인의 영상을 획득함에 있어 적절한 배율과 초점 조정을 위해 렌즈(M1214-MP2, 12 mm focal length, Computar, Tokyo, Japan) 조립체(lens assembly)를 사용하였다.
- 그림 1은 고안된 정량 측면유동 면역 어세이 리더를 보여주고 있다. 일반 용도의 판넬 컴퓨터(panel computer, CUPC-P70, Comfile Technology Inc., Seoul, Korea)와 관련 소프트웨어가 측정의 제어를 위해 사용되었다. 전원공급장치(power circuit board, LVS-PN-2312, Cylod Inc.
데이터처리
- 레이블링 입자를 다공성 멤브레인에 뿌려 제작된 측면유동 면역 어세이 모사(simulation)장치를 사용하여 고안된 정량분석방법을 사전 검증하였으며 급성심근경색(acute myocardial infarction, AMI)진단을 위한 상용화된 측면유동 면역 어세이를 이용하여 제안된 리더의 성능을 최종 검증하였다. 각 검증단계에 있어 컬러 이미지 센서를 이용한 정량 분석 결과를 기존의 단색 이미지 센서를 이용한 방법과 비교함으로써 성능의 향상 정도를 비교 평가하였다.
성능/효과
- 이는 측면유동 면역 어세이의 시험라인 형성을 실제 항원을 포함한 샘플의 사용 없이 손쉽게 모사하기 위해 제작 된 것이며 본 연구에서 제안된 정량분석 리더 및 분석방법을 사전 검증하기 위해 사용되었다. 그림 2의 (b)와 같이 뿌려지는 입자의 농도는 0.005%, 0.01%, 0.02%, 0.05%, 0.1%, and 0.2% (w/v)이며 입자용액의 농도가 낮아짐에 따라 각 농도 별 영상의 우측에 위치한 시험라인이 옅어지고 있다. 통상적인 측면유동 면역 어세이는 시험라인 이외에도 컨트롤 라인(control line)을 형성하는데 이는 샘플의 흐름이 시험에 적합하도록 완결되었는지를 확인(go or no go)하는 목적으로 사용되며 본 연구에서는 그림 2(b)에서 각 영상의 좌측에 보이는 바와 같이 동일한 입자농도로 제조되었으나 제작 완료된 모사장치를 이용한 이미지 분석은 시험라인만을 가지고 수행되었다.
- 001). 같은 분석을 그림 7(b)의 CK-MB 응답곡선에 적용했을 때, 0.0802에서 0.1141로 기울기가 개선되었으며 역시 픽셀강도 측정에 있어 사용된 녹색 채널 분석법은 공변량분석에 의해 유의미한 영향을 주고 있음을 알 수 있었다(F(1, 21) = 12.369, p = .002). 응답곡선에서 myoglobin 214 ng/ml, CK-MB 16 ng/ml의 결과를 보면 단색대비 컬러 이미지 분석방법에서 각각 157.
- 파장, 혹은 주파수 도메인(domain)에서의 광신호 분석을 통해 정량분석의 효율을 좋게 하려면 분광계(optical spectrometer) 등을 이용하여 단일 파장에서의 측정을 하면 되겠지만 이는 관련 정량분석 리더의 고가화, 대형화를 유도할 것이며 본래 측면유동 면역 어세이 시스템이 갖는 주요 목적인 현장진단(point-of-care), 신속측정(rapid detection)의 목적에 부합하지 않을 것이다. 따라서 본 연구에서 제안된 컬러 카메라와 이의 베이어 필터링된 이미지의 이용은 최소한의 관련 기구와 분석 프로세스(process)를 이용하여 기존의 방법에서 효과적으로 감도저하의 문제를 해결하고 있음을 알 수 있다.
- 또한 공변량분석에 따르면, 픽셀강도 측정에 있어 사용된 녹색 채널 분석법은 유의미한 영향을 주고 있음을 알 수 있었다(F(1, 21) = 46.683, p < .001).
- 002). 응답곡선에서 myoglobin 214 ng/ml, CK-MB 16 ng/ml의 결과를 보면 단색대비 컬러 이미지 분석방법에서 각각 157.6%, 142.9% 센서 출력 향상을 보였다. 그림 8(a)는 myoglobin 214 ng/ml 농도의 샘플을 사용한 어세이의 원본 컬러, 녹색 채널(녹색 채널 이미지를 그레이 스케일 이미지로 변환), 단색 이미지들을 보여주고 있으며, 그림 8(b)는 이들의 시험 라인 부분(흰색 점선의 사각형)의 픽셀 강도에 대한 그래프를 보여주고 있다.
- 본 연구에서는 정량 측면유동면역어세이 시스템의 성능향상을 위하여 컬러 카메라의 베이어 필터링된 이미지를 사용하였다. 특정 컬러 요소의 이미지를 사용하였을 경우, 기존의 단색 카메라를 사용한 방법보다 향상된 응답곡선의 기울기를 얻었고 이는 정량분석 시스템의 감도를 향상시켜 이를 이용한 면역진단기기의 성능 문제를 개선 할 수 있음을 보였다. 향후 본 기술은 전혈 샘플을 이용함에 있어 적혈구 분리 없이 측면유동분석을 하는 분야에 응용되어 적색의 혈액 색상을 효과적으로 분리하고 전혈과는 다른 색상의 레이블링 입자를 정량화하여 전체 어세이 단가의 절감에 응용될 수 있을 것이며 형광 레이블링 입자를 사용하는 분야에 있어 입자의 발광을 여기광원으로부터 효율적으로 분리할 수 있어 이를 이용한 정량분석 성능의 향상에도 기여할 수 있을 것으로 판단된다.
후속연구
- 측면유동 면역 어세이를 이용한 체외진단기기의 상용화를 위해서는 관련 법령 등이 규제하는 바와 같이 임상시험을 통한 진단기기 시스템의 통계적 분석 및 평가가 필요하다. 본 연구는 기존에 사용되는 단색 이미지 센서 기반의 정량분석 리더의 기술적 개선을 통해 전체 시스템의 성능향상을 위한 것이고 이를 상용화된 심근경색 진단 어세이에 적용하여 성능향상의 예를 보이고 있지만 향후 이를 이용한 상용화를 위해서는 심화된 통계적 분석이 선행되어야 할 것이다.
- 베이어 필터를 적용한 컬러 이미지 센서의 경우에는 4개의 개별 픽셀이 통상적으로 각각 적색 1개, 녹색 2개, 청색 1개의 필터가 적용되어 한 지점의 색상을 표현하므로 4 개의 인접한 픽셀이 서로 독립적인 같은 사양의 단색 이미지 센서와 비교하여 해상도 측면에서 성능이 저하된다고 볼 수 있으나 이러한 차이가 오히려 응답곡선의 기울기 증가에 기여했다고 보기는 어렵다. 본 연구에서 보인 감도 증가의 정도는 레이블링 입자의 최적화된 선택에 따라 더 개선될 수 있을 것으로 기대된다. 그 좋은 예는 적색, 녹색, 청색의 레이텍스(latex) 입자라고 볼 수 있으며 그 이유는 이들이 베이어 필터를 통과한 각 대역의 이미지의 최대 감도에 해당하는 색상이기 때문이다.
- 특정 컬러 요소의 이미지를 사용하였을 경우, 기존의 단색 카메라를 사용한 방법보다 향상된 응답곡선의 기울기를 얻었고 이는 정량분석 시스템의 감도를 향상시켜 이를 이용한 면역진단기기의 성능 문제를 개선 할 수 있음을 보였다. 향후 본 기술은 전혈 샘플을 이용함에 있어 적혈구 분리 없이 측면유동분석을 하는 분야에 응용되어 적색의 혈액 색상을 효과적으로 분리하고 전혈과는 다른 색상의 레이블링 입자를 정량화하여 전체 어세이 단가의 절감에 응용될 수 있을 것이며 형광 레이블링 입자를 사용하는 분야에 있어 입자의 발광을 여기광원으로부터 효율적으로 분리할 수 있어 이를 이용한 정량분석 성능의 향상에도 기여할 수 있을 것으로 판단된다.
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