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문제 정의
- 본 연구에서는 오배자, 우슬, 가자 및 감초가 공통적으로 전통적인 약재로 사용되며, 항산화, 항균 등의 효능을 갖고 있는 점에 착안하여 이들 혼합물질의 항균력과 항산화력을 조사함으로써 천연방부제로서의 활용 가능성을 검토하였다.
- 본 연구에서는 천연 항균소재를 탐색하기 위하여 오배자, 우슬, 가자, 감초의 ethanol 조추출물과 이의 혼합추출물에 대한 분획 추출물을 이용하여 S. aureus, S. epidermidis, P. aeruginosa, E. coli에 대한 항균효과를 알아보았다. 오배자, 우슬, 가자, 감초 단독으로 항균활성을 paper disc방법으로 알아본 결과 오배자 추출물에서 항균활성이 가장 뛰어난 항균 활성을 보였으며, 오배자, 우슬, 가자, 감초 추출물의 서로 다른 배합에 따른 항균활성은 오배자:우슬:가자:감초의 비율이 5:3:1:1의 비율로 혼합하였을 경우 가장 뛰어난 항균활성을 보였다.
제안 방법
- TBS, LB 또는 NB agar 배지에 균을 도말한 다음 멸균된 paper disc를 올리고 시료를 paper disc에 흡수시킨 후, 37℃ incubator에서 24시간 배양한 다음 디스크 주위의 생육 저해환 (Clear zone) 생성 유무를 확인하였다. MIC 값은 각 시료들을 각 농도별로 희석하고 여기에 균을 접종하고 충분히 배양한 후 균이 자라지 않은 최소저해 농도를 측정하였다. 오배자, 우슬, 가자, 감초의 혼합비율에 따른 항균활성을 확인하기 위해서 20가지 조건의 혼합 조성을 준비하였고 (Table 1), paper disc diffusion과 MIC 방법을 통하여 항균력을 테스트 하였다.
- TBS, LB 또는 NB agar 배지에 균을 도말한 다음 멸균된 paper disc를 올리고 시료를 paper disc에 흡수시킨 후, 37℃ incubator에서 24시간 배양한 다음 디스크 주위의 생육 저해환 (Clear zone) 생성 유무를 확인하였다.
- 세포를 96 well plate에 well 당 3×104 cells의 농도가 되도록 조절한 후 96 well microplate의 각 well에 분주하고 이것을 37℃, 5% CO2 세포배양기에서 24시간 배양하여 세포를 부착시킨 다음 추출물을 10 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL 농도가 되도록 배지에 희석하여 첨가하였다.
- 에탄올 조추출물 (샘플 18번, 오배자:우슬:가자:감초 5:3:1:1 혼합추출물) 및 분획추출물의 free radical 소거활성을 측정하였다. 양성대조군으로는 L-ascorbic acid와 BHA를 사용하였다.
- 에탄올 조추출물 (샘플 18번, 오배자:우슬:가자:감초 5:3:1:1 혼합추출물)과 이것의 분획 추출물이 인간 피부세포에 독성을 보이는지 여부를 조사하였다. 세포주는 human skin fibroblast인 CCD-986sk 세포주를 사용하였고, MTT assay를 통하여 측정하였다.
- 에탄올 조추출물의 각 분획은 n-hexane, chloroform, ethyl acetate 및 n-butanol을 사용하여 순차적으로 분획·추출하여 각 용매별 추출물과 물층을 얻었고 (Fig. 1), 감압 농축 후 동결건조하여 사용하였다.
- 2와 같다. 오배자, 우슬, 가자, 감초 단독처리군 (샘플 1~4번, Table 1)과 paper disc결과 상대적으로 효능이 좋은 그룹인 혼합조건 13~20번 샘플 (Table 1)의 항산화 활성을 확인하였다. 양성대조군으로는 L-ascorbic acid를 사용하였다.
- MIC 값은 각 시료들을 각 농도별로 희석하고 여기에 균을 접종하고 충분히 배양한 후 균이 자라지 않은 최소저해 농도를 측정하였다. 오배자, 우슬, 가자, 감초의 혼합비율에 따른 항균활성을 확인하기 위해서 20가지 조건의 혼합 조성을 준비하였고 (Table 1), paper disc diffusion과 MIC 방법을 통하여 항균력을 테스트 하였다.
- 오배자:우슬:가자:감초 5:3:1:1 혼합물의 에탄올 조추출물을 유기용매로 분획추출을 하여 활성을 알아보았다. 분획추출물의 수율은 ethyl acetate (39.
- 항균테스트와 항산화활성 측정 결과 18번 조합인 오배자:우슬:가자:감초 (5:3:1:1)의 조합이 다른 혼합 조건과 비교했을 때, 근소하지만 가장 높은 활성을 나타냄을 알 수 있었다. 이에 오배자:우슬:가자:감초를 5:3:1:1로 섞어 에탄올로 조추출한 후 용매의 극성차이를 이용하여 용매분획으로 각각 분리하였다 (Fig. 1). 에탄올 조추출물의 용매별 분획의 수율은 aqueous 분획과 극성이 낮은 ethyl acetate 분획에서 각각 38%, 39.
- 제조된 각각의 추출물을 표 1의 함량과 같이 혼합하여 천연방부제 조성물을 제조한 후, 페이퍼 디스크 확산법 (paper disc diffusion)에 의하여 대장균 (E. coli), 황색포도상구균 (S. aureus), 표피포도상구균 (S. epidermidis) 및 녹농균 (P. aeruginosa) 에 대하여 항균 활성을 측정하고, 그 결과를 표 2에 나타내었다. 각 조성물은 중량별로 혼합한 후 5 μg/mL 되도록 녹인 후 paper에 충분히 흡수시킨 후 실험을 진행하였다.
- 추출물의 항산화능은 1,1-Diphenyl-2-picryl hydrazyl (DPPH) 을 이용하여 라디컬 소거능을 확인하였다 [10,20]. 시료 60μL와 0.
대상 데이터
- CCD-986sk 인체 피부 섬유아세포는 ATCC (CRL-1947)에서 분양받아 사용하였다. CCD-986sk는 100 U/mL의 penicillin-streptomycin과 10% fetal bovine serum (GIBCO, USA)이 첨가된 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) 용액으로 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
- coli, CCARM 1238)를 이용하였다. 배지는 BD Science (USA)의 Nutrient Broth (NB), Try- ptic Soy Broth (TBS) 와 Luria Bertani Broth (LB) 배지를 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 4종의 천연물은 화순의 국산 한약재 판매장을 통하여 구입하였다. 4종의 천연물은 blender를 사용 60 mesh로 분쇄한 후 천연물 100 g에 ethanol 1 liter를 첨가한 후 80℃에서 4시간 동안 추출한 후 0.
- 에탄올 조추출물 (샘플 18번, 오배자:우슬:가자:감초 5:3:1:1 혼합추출물)과 이것의 분획 추출물이 인간 피부세포에 독성을 보이는지 여부를 조사하였다. 세포주는 human skin fibroblast인 CCD-986sk 세포주를 사용하였고, MTT assay를 통하여 측정하였다. 오배자, 우슬, 가자, 감초 추출물들이 다양한 세포에서 세포독성을 보이지 않는 것으로 보고 되었지만, 인간 피부유래의 CCD-986sk 세포에서의 독성 여부는 아직까지 확인되지 않았다 [26,28-30].
- 오배자, 우슬, 가자, 감초 단독처리군 (샘플 1~4번, Table 1)과 paper disc결과 상대적으로 효능이 좋은 그룹인 혼합조건 13~20번 샘플 (Table 1)의 항산화 활성을 확인하였다. 양성대조군으로는 L-ascorbic acid를 사용하였다. DPPH의 결과 각각의 추출물과 혼합추출물에서 농도 의존적으로 DPPH radical 소거능이 증가함을 볼 수 있었다.
- 에탄올 조추출물 (샘플 18번, 오배자:우슬:가자:감초 5:3:1:1 혼합추출물) 및 분획추출물의 free radical 소거활성을 측정하였다. 양성대조군으로는 L-ascorbic acid와 BHA를 사용하였다. 에탄올 조추출물 (샘플 18번)의 free radical 소거 활성은 L-ascorbic acid보다는 낮지만 BHA보다는 높은 활성을 가지고 있음을 알 수 있었다 (Fig.
- 항균활성 측정 시험에 사용한 균주는 한국미생물보존센터 (KCCM)로부터 분양 받았으며, Staphylococcus aureus (S. aureus, KCCM 11764), Staphylococcus epidermidis (S. epidermidis, KCCM 21205), Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa, KC CM 11952)와 Escherichia coli (E. coli, CCARM 1238)를 이용하였다. 배지는 BD Science (USA)의 Nutrient Broth (NB), Try- ptic Soy Broth (TBS) 와 Luria Bertani Broth (LB) 배지를 사용하였다.
이론/모형
- Toxicity of crude ethanolic extract (#18, 5:3:1:1 mixture of medicinal herbs as described in Table 1) and its five different subfractions in CCD-986sk human skin cell. Cell viability was assessed by MTT assay. Hex: n-Hexane fraction, Ch: Chloroform fraction, EA: Ethyl-acetate fraction, BuOH: Butanol fraction, Aqu: Aqueous fraction.
- Paper disc법에 의하여 항균성이 우수하다고 평가되는 조합인 14~20번 혼합조건 (Table 1)의 항균활성을 최소저해농도 (MIC) 측정법을 이용하여 추가 확인하였다 (Table 3). S.
- epidermidis, p. aeruginosa, E. coli에 대한 항균활성은 paper disc diffusion 방법과 Minimum inhibitory concentration (MIC) 방법을 사용하였다 [2,23]. TBS, LB 또는 NB agar 배지에 균을 도말한 다음 멸균된 paper disc를 올리고 시료를 paper disc에 흡수시킨 후, 37℃ incubator에서 24시간 배양한 다음 디스크 주위의 생육 저해환 (Clear zone) 생성 유무를 확인하였다.
- 분획추출물의 항균활성은 paper disc법으로 측정하였다 (Table 5). 분획추출물의 항균활성을 보면 S.
- CCD-986sk는 100 U/mL의 penicillin-streptomycin과 10% fetal bovine serum (GIBCO, USA)이 첨가된 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) 용액으로 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 세포독성은 MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) assay를 통해 확인하였다. MTT assay는 세포의 생육상을 측정하는 방법으로서 살아있는 세포의 미토콘드리아 내의 dehydrogenase가 황색 수용성 물질인 MTT에 의해 dark blue formazan을 생성하는 원리를 이용한 것이다.
성능/효과
- aeruginosa의 항균활성은 5번, 18번 혼합조건에서 항균 활성이 가장 우수하게 나타났다. 4가지 균주에 대한 항균활성이 전체적으로 뛰어나게 나타난 혼합비율은 오배자:우슬:가자:감초의 비율이 5:3:1:1로 혼합된 18번 혼합조건이었으며 실험에 사용한 균주 모두에 대해 inhibition zone이 12 mm 이상 나타나 우수한 항균활성을 보였다 (Table 2).
- 양성대조군으로는 L-ascorbic acid를 사용하였다. DPPH의 결과 각각의 추출물과 혼합추출물에서 농도 의존적으로 DPPH radical 소거능이 증가함을 볼 수 있었다. 100 μg/mL 농도의 단독 처리군 (샘플 1~4번)에서는 오배자 추출물 (샘플 1번)이 가장 높은 항산화 활성 (46%)을 나타냈으며, 우슬 31%, 감초 26%, 가자 20%의 순으로 높은 항산화 활성을 나타냈다.
- epidermidis 균주에 대해서는 n-butanol 분획이 가장 뛰어난 활성을 나타냈으며, 다음으로 aqueous, chloroform, ethyl acetate, n-hexane층 순으로 항균활성이 나타났다. E. coli 균주에 대해서는 n-butanol 분획이 가장 뛰어난 활성을 나타냈으며, 다음으로 chloroform, n-hexane, ethyl acetate, aqueous층 순으로 항균활성이 나타났다. P.
- Human fibroblast cell line인 CCD-986sk 세포주에서 세포 독성 확인 결과 에탄올 조추출물과 분획추출물 모두에서 세포독성은 보이지 않았다.
- coli 균주에 대해서는 n-butanol 분획이 가장 뛰어난 활성을 나타냈으며, 다음으로 chloroform, n-hexane, ethyl acetate, aqueous층 순으로 항균활성이 나타났다. P. aeruginosa 균주에 대해서는 ethyl acetate, n-butanol, chloroform, n-hexane, aqueous층 순으로 항균활성이 나타났다. 전체적인 항균 활성을 보면 n-butanol 분획 추출물에서 다양한 균에 대한 항균활성이 가장 뛰어나고 다음으로 ethyl acetate 분획 추출물에서 높은 항균활성이 나타남을 알 수 있었다.
- Paper disc법에 의하여 항균성이 우수하다고 평가되는 조합인 14~20번 혼합조건 (Table 1)의 항균활성을 최소저해농도 (MIC) 측정법을 이용하여 추가 확인하였다 (Table 3). S. aureus에 대한 항균 활성의 경우는 15번과 18번 혼합조성이 0.1%의 매우 낮은 농도에서도 항균활성을 보였으며, E. coli에 대해서는 14~20번 혼합조성 모두 1%의 동일한 MIC 효과를 보였다. S.
- aureus 균주에 대해서는 n-butanol, chloroform, ethyl acetate, n-hexane 분획이 우수한 항균활성을 나타내었고, aqueous 분획도 약간 낮은 수준이지만 비교적 우수한 항균활성을 보였다. S. epidermidis 균주에 대해서는 n-butanol 분획이 가장 뛰어난 활성을 나타냈으며, 다음으로 aqueous, chloroform, ethyl acetate, n-hexane층 순으로 항균활성이 나타났다. E.
- 3). 다섯 가지 분획 추출물의 free radical 소거활성은 ethyl acetate (EA) 분획물에서 가장 높게 나타났고, 다음으로 n-butanol (BuOH), chloroform (Ch), nhexane (Hex), aqueous (Aqu) 순으로 나타났다 (Fig. 3). 이는 오배자와 우슬의 분획 추출물 중 ethyl acetate와 n-butanol의 분획물의 항산화 활성이 높게 나타난 기존의 연구 결과와 일치한다 [15,25].
- 분획별 항산화 활성은 ethyl acetate 분획 층에서 가장 뛰어난 활성을 보였고, 다음으로 n-butanol, chloroform, n-hexane, aqueous층 순으로 나타났다. 분획별 항균활성은 S. aureus, S. epidermidis, E. coli에서는 n-butanol 분획 층에서 P. aeruginosa에 대한 항균활성은 ethyl acetate 분획 층에서 가장 높게 나타났다.
- 8%), n-hexane (6%), chloroform (3%) 순으로 ethyl acetate와 aqueous 분획 층에서 수율이 매우 높게 나왔다. 분획별 항산화 활성은 ethyl acetate 분획 층에서 가장 뛰어난 활성을 보였고, 다음으로 n-butanol, chloroform, n-hexane, aqueous층 순으로 나타났다. 분획별 항균활성은 S.
- 오배자:우슬:가자:감초 5:3:1:1 혼합물의 에탄올 조추출물을 유기용매로 분획추출을 하여 활성을 알아보았다. 분획추출물의 수율은 ethyl acetate (39.4%), aqueous (38%), n-butanol (6.8%), n-hexane (6%), chloroform (3%) 순으로 ethyl acetate와 aqueous 분획 층에서 수율이 매우 높게 나왔다. 분획별 항산화 활성은 ethyl acetate 분획 층에서 가장 뛰어난 활성을 보였고, 다음으로 n-butanol, chloroform, n-hexane, aqueous층 순으로 나타났다.
- 분획추출물의 항균활성은 paper disc법으로 측정하였다 (Table 5). 분획추출물의 항균활성을 보면 S. aureus 균주에 대해서는 n-butanol, chloroform, ethyl acetate, n-hexane 분획이 우수한 항균활성을 나타내었고, aqueous 분획도 약간 낮은 수준이지만 비교적 우수한 항균활성을 보였다. S.
- 오배자, 우슬, 가자, 감초 단독으로 항균활성을 paper disc방법으로 알아본 결과 오배자 추출물에서 항균활성이 가장 뛰어난 항균 활성을 보였으며, 오배자, 우슬, 가자, 감초 추출물의 서로 다른 배합에 따른 항균활성은 오배자:우슬:가자:감초의 비율이 5:3:1:1의 비율로 혼합하였을 경우 가장 뛰어난 항균활성을 보였다. 서로 다른 혼합 비율에 따른 MIC방법을 이용한 항균활성과 DPPH assay를 통한 항산화 활성에서도 5:3:1:1의 비율로 혼합하였을 경우 가장 뛰어난 활성을 보였다.
- 오배자, 우슬, 가자, 감초 추출물들이 다양한 세포에서 세포독성을 보이지 않는 것으로 보고 되었지만, 인간 피부유래의 CCD-986sk 세포에서의 독성 여부는 아직까지 확인되지 않았다 [26,28-30]. 세포독성 측정 결과 에탄올 조추출물과 그것의 분획 추출물 5종류 모두 CCD-986sk 세포 생존율에 영향을 주지 않았으며, 인간 피부 세포에 독성을 보이지 않는 안전한 것으로 확인하였다 (Fig. 4).
- 양성대조군으로는 L-ascorbic acid와 BHA를 사용하였다. 에탄올 조추출물 (샘플 18번)의 free radical 소거 활성은 L-ascorbic acid보다는 낮지만 BHA보다는 높은 활성을 가지고 있음을 알 수 있었다 (Fig. 3). 다섯 가지 분획 추출물의 free radical 소거활성은 ethyl acetate (EA) 분획물에서 가장 높게 나타났고, 다음으로 n-butanol (BuOH), chloroform (Ch), nhexane (Hex), aqueous (Aqu) 순으로 나타났다 (Fig.
- 1). 에탄올 조추출물의 용매별 분획의 수율은 aqueous 분획과 극성이 낮은 ethyl acetate 분획에서 각각 38%, 39.4%로 높게 나타났으며, chloroform, n-hexane, n-butanol 분획은 각각 3%, 6%, 6.8%의 수율을 보였다 (Table 4).
- 감초 추출물의 경우에는 기존의 연구에서처럼 안정적으로 고른 항균활성을 보였다 [24]. 에탄올 조추출물의 혼합조건에 따른 균주에 대한 저해환의 크기를 살펴보면 S. aureus의 항균활성은 18번 혼합 조건에서 항균 활성이 가장 뛰어나게 나타났으며, E. coli의 항균활성은 15번 혼합 조건에서 S. epidermidis의 항균활성은 14, 17, 18, 19번 혼합조건에서 P. aeruginosa의 항균활성은 5번, 18번 혼합조건에서 항균 활성이 가장 우수하게 나타났다. 4가지 균주에 대한 항균활성이 전체적으로 뛰어나게 나타난 혼합비율은 오배자:우슬:가자:감초의 비율이 5:3:1:1로 혼합된 18번 혼합조건이었으며 실험에 사용한 균주 모두에 대해 inhibition zone이 12 mm 이상 나타나 우수한 항균활성을 보였다 (Table 2).
- coli에 대한 항균효과를 알아보았다. 오배자, 우슬, 가자, 감초 단독으로 항균활성을 paper disc방법으로 알아본 결과 오배자 추출물에서 항균활성이 가장 뛰어난 항균 활성을 보였으며, 오배자, 우슬, 가자, 감초 추출물의 서로 다른 배합에 따른 항균활성은 오배자:우슬:가자:감초의 비율이 5:3:1:1의 비율로 혼합하였을 경우 가장 뛰어난 항균활성을 보였다. 서로 다른 혼합 비율에 따른 MIC방법을 이용한 항균활성과 DPPH assay를 통한 항산화 활성에서도 5:3:1:1의 비율로 혼합하였을 경우 가장 뛰어난 활성을 보였다.
- aeruginosa에 대해서는 15번, 16번 조성이 5%, 14번과 17~20번 혼합 조성은 1%의 MIC를 보였다. 전체적으로 paper disc에 의한 저해환 실험의 결과와 마찬가지로 18번 혼합조건이 가장 광범위하게 뛰어난 항균활성을 나타냄을 확인하였다.
- aeruginosa 균주에 대해서는 ethyl acetate, n-butanol, chloroform, n-hexane, aqueous층 순으로 항균활성이 나타났다. 전체적인 항균 활성을 보면 n-butanol 분획 추출물에서 다양한 균에 대한 항균활성이 가장 뛰어나고 다음으로 ethyl acetate 분획 추출물에서 높은 항균활성이 나타남을 알 수 있었다. 분획추출물별 항균활성은 오배자, 우슬은 ethyl acetate, 가자는 n-butanol, 감초는 ethyl acetate 분획층에서 항균활성이 가장 뛰어나게 나타났다고 보고되어져 유사한 결과가 나왔다[11,14,26,27].
- 항균테스트와 항산화활성 측정 결과 18번 조합인 오배자:우슬:가자:감초 (5:3:1:1)의 조합이 다른 혼합 조건과 비교했을 때, 근소하지만 가장 높은 활성을 나타냄을 알 수 있었다. 이에 오배자:우슬:가자:감초를 5:3:1:1로 섞어 에탄올로 조추출한 후 용매의 극성차이를 이용하여 용매분획으로 각각 분리하였다 (Fig.
- 100 μg/mL 농도의 단독 처리군 (샘플 1~4번)에서는 오배자 추출물 (샘플 1번)이 가장 높은 항산화 활성 (46%)을 나타냈으며, 우슬 31%, 감초 26%, 가자 20%의 순으로 높은 항산화 활성을 나타냈다. 혼합추출물의 경우는 모든 샘플에서 농도 의존적으로 높은 항산화 효과를 나타냈고, 그 중에서 항균활성이 가장 뛰어난 18번 조합에서 단독 추출물을 처리한 결과에 비하여 가장 뚜렷하게 상승된 항산화 효과를 보여주었다.
후속연구
- 본 연구를 통하여 기존의 화학방부제를 대신하여 천연 한방 추출물인 오배자, 우슬, 가자, 감초 추출물로 이루어진 혼합물을 이용하여 천연항산화제 및 항균활성을 가진 기능성 소재개발이 가능할 것으로 사료된다.
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