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문제 정의
- 지금까지 많은 종속영양적 질산화 및 호기성 탈질균이 발견되었지만, 아직도 별도의 포기조와 무산소조가 운영되고 있음은 현장에서 그 효과를 검증 받지 못했기 때문이며 게다가 효율적인 균주의 개발이 아직 미흡하기 때문이다. 따라서, 본 연구를 통해 기존 알려진 유사 균주와의 비교를 통해 질소제거 능력을 비교하여 보았다.
- 본 연구에서는 암모니아를 제거하기 위한 미생물을 농화배양하는 과정에서 영양배지에서 암모니아를 제거하는 종속영양성 암모니아 산화세균을 분리하게 되었다. 분리세균의 생리학적 특성을 알아보는 과정에서 종속영양적 질산화 및 호기적 탈질이 진행되는 것을 알았으며, 분자생물학적 분석결과 분리된 미생물이 Stenotrophomonas sp.
제안 방법
- 9%)가스로 치환한 후 24시간 LB Broth배지에서 전배양한 CW-4Y균주를 syringe를 이용하여 5 mL씩 접종하였다. 30oC의 인큐베이터에서 정치배양을 한 후 접종 직후 그리고 24시간 간격으로 3 mL 분취하여 NH4+, NO2-, NO3-이온농도를 분석하였으며, pH, OD 측정을 하였다. 시료 채취 시는 혐기적 상태를 유지하기 위하여 syringe를 사용하여 분취하였다.
- CW-4Y균주를 호기적 조건의 5 L 용량의 반응기에서 NaNO3과 glucose를 첨가한 배지에서 성장을 측정하였다. Fig.
- 순수 분리된 Stenotrophomonas sp. CW-4Y의 암모니아 가스 분해 활성테스트를 위하여 인공적으로 배지에 질소원을 첨가한 후 확인하였다. 기본배지로써 황산암모늄 배지를 이용 하였고 [2], 증류수에 K2HPO4 14 g, KH2PO4 6 g, trisodium citrate dihydrate 17 g, (NH4)2SO4 2 g, MgSO47H2O 0.
- CW-4Y를 멸균된 LB Broth에 접종되어 30oC,180 rpm으로 24시간 전배양을 한 후, 5 mL를 분취하여 새로운 활성테스트 배지에 접종하였다. NH4+, NO3-, NO2-이온, pH, 및 OD 측정을 위해 접종 직후 그리고 24시간 간격으로 3 mL씩 분취하였으며 시간(일)의 경과에 따라 관찰하였다. 일정양의 황산암모늄에 다양한 농도의 탄소원을 첨가하여 C/N 비율을 5, 10, 20, 30에 맞추어 그에 따른 암모니아 및 질산염의 제거율을 알아보았다.
- NH4-N의 농도, NO2-N 및 NO3-N의 농도는 ㈜씨맥 (C-MAC) 사의 시약을 이용하여 분광광도계 (DR5000 UV; HACH, USA)를 이용하여 측정하였다. DO는 DO meter (KRK Co.
- 혈청병에 각각 황산암모늄과 질산암모늄을 넣은 합성 배지 100 mL을 분주한 후 butyl rubber stopper와 aluminum cap을 이용하여 밀봉하였다. 그 후 혐기적 조건을 조성하기 위하여 질소 (99.9%)가스로 치환한 후 24시간 LB Broth배지에서 전배양한 CW-4Y균주를 syringe를 이용하여 5 mL씩 접종하였다. 30oC의 인큐베이터에서 정치배양을 한 후 접종 직후 그리고 24시간 간격으로 3 mL 분취하여 NH4+, NO2-, NO3-이온농도를 분석하였으며, pH, OD 측정을 하였다.
- 배양 온도는 30oC로조절해주었다. 그리고 공급되는 에어의 양과 배지의 수면에 위치한 impeller의 교반 속도는 50 rpm에서 200 rpm 사이로 조절하여 공기중의 산소가 녹아 들게 하여 배지 내의 DO농도를 조절해주었다. Sampling port로부터 syringe를 이용하여 하루에 한번씩 5 mL의 가스를 취하여 분석하였다.
- Table 2에는 I 공단 내의 다양한 지역에서 채취한 슬러지를 LB배지에서 전배양한 후 두 개의 실험군으로 접종한 후의 암모니아 가스 제거율을 나타내었다. 두 실험군은 각각 0.1% Glucose를 넣은 것과 Glucose를 넣지 않은 것으로 구분하였다.
- 암모니아를 제거하는 균주를 분리하기 위하여 위의 시료 10 mL을 LB Broth배지 100 mL를 함유한 300 mL 삼각 플라스크에 접종한 후 30oC에서 180 rpm으로 24시간 진탕배양 하였다. 물과 혼합하였을 때 암모니아 가스가 발생되는 혼합유박 (질소전량 4%, 인산전량 2%, 가리전량 1%, 피마자박 57%, 채종박 25%, 미강박 18%, (주)케미칼) 0.2 g과 Glucose 0.1% 첨가된 증류수 10 mL에 LB Broth배지에서 전배양된 균주 1 mL을 70 mL용량의 바이얼에서 접종한 후 실리콘 스토퍼로 막고 농화배양 하였다 (Table 1). 이 배양액에서 발생되는 암모니아가스를 가스 검지관 (KITAGAWA, Japan)을 이용하여 측정하였다.
- 1% 함유한 증류수 10 mL에 균주 1 mL을 접종하였다. 배양 2일 째와 7일째 암모니아 가스 검지관 (KITAGAWA, Japan)을 이용하여 암모니아 가스의 농도를 측정하였다. 본 실험의 경우 배양온도는 30oC였고, 180 rpm으로 진탕배양을 실시하였다.
- 배지 내의 C/N비의 변화에 따라 분리균주 CW-4Y의 암모니아제거에 미치는 영향을 알아보았다 (Fig. 4). 일정량의 황산 암모늄이 첨가된 배지에 탄소원으로 이용되는 glucose의 양을 달리하여 C/N비를 각각 5, 10, 16, 20, 30으로 설정한 후 실험을 진행하였다.
-
6. 호기적 (진탕배양) 상태와 혐기적 (정치배양) 상태에 따른 암모니아 및 질산염의 분해
분리 균주 CW-4Y의 NH4+-N 와 NO3--N의 분해를 산소의 유무에 따라 확인하였다
. 호기적 배양과 혐기적 배양 모두 질소원으로는 질산암모늄을 이용하였으며, 탄소원으로는 glucose를 이용하였으며, C/N비는 16으로 맞춰주었다. - 30oC의 인큐베이터에서 정치배양을 한 후 접종 직후 그리고 24시간 간격으로 3 mL 분취하여 NH4+, NO2-, NO3-이온농도를 분석하였으며, pH, OD 측정을 하였다. 시료 채취 시는 혐기적 상태를 유지하기 위하여 syringe를 사용하여 분취하였다.
- -N의 제거능을 알아보았다. 실험은 진탕배양 조건으로 하였으며 실험초기의 C/N비는 참고문헌 등에 의거하여 10으로 설정하였으나, 이후 적절한 C/N비 조건을 찾은 후 16으로 다시 조절하였다.
- 암모니아 가스 분해 능력을 가진 균주의 암모니아 가스 분해 능력을 알아보기 위해 70 mL vial에 혼합유박 0.2 g을 넣고 glucose를 0.1% 함유한 증류수 10 mL에 균주 1 mL을 접종하였다. 배양 2일 째와 7일째 암모니아 가스 검지관 (KITAGAWA, Japan)을 이용하여 암모니아 가스의 농도를 측정하였다.
- 암모니아 가스 분해 효과가 있는 것으로 관찰된 순수 균주의 colony는 MACROGEN사에 의뢰하여 16S rDNA의 염기서열을 분석하였다. 이때 primer는 F27 (5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3')과 R1492 (5'-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3')를 사용하였다.
- , DO-5Z)을 이용하여 측정하였다. 액체 배양된 균의 광학밀도는 분광광도계 (DR5000 UV; HACH, USA)를 이용하여 660 nm에서 OD를 측정하었다.
- 1% 첨가된 증류수 10 mL에 LB Broth배지에서 전배양된 균주 1 mL을 70 mL용량의 바이얼에서 접종한 후 실리콘 스토퍼로 막고 농화배양 하였다 (Table 1). 이 배양액에서 발생되는 암모니아가스를 가스 검지관 (KITAGAWA, Japan)을 이용하여 측정하였다. 측정 후 암모니아 가스의 배출이 균주를 접종하지 않은 대조군에 비해 분해되는 배양액을 다시 5회에 걸친 계대과정 과정을 마친 후 LB Agar 배지에 도말하였다.
- 형성된 colony를 화염 멸균된 백금이로 streaking 하였다. 이러한 방법을 2~3회 반복한 후 독립된 단일 colony를 배양하여 위와 같은 방법으로 혼합유박과 glucose를 넣은 vial에 접종하여 암모니아가스가 대조군에 비해 분해되는 균주를 최종적으로 선택하였다.
- 9%로 나타났으며, 이는 모든 실험군에서 가장 우수한 제거율을 보여주는 것이었다. 이후 A 실험군에서 배지 종류를 다양하게 하여 순수분리를 하였다. 이로부터 분리된 CW-4Y균주의 암모니아가스 제거율은 3째 100%의 제거율을 보여주었다.
- 4). 일정량의 황산 암모늄이 첨가된 배지에 탄소원으로 이용되는 glucose의 양을 달리하여 C/N비를 각각 5, 10, 16, 20, 30으로 설정한 후 실험을 진행하였다. 일반적으로 미생물은 C/N비 10에서의 성장과 기질이용도가 높다고 잘 알려져 있다.
- NH4+, NO3-, NO2-이온, pH, 및 OD 측정을 위해 접종 직후 그리고 24시간 간격으로 3 mL씩 분취하였으며 시간(일)의 경과에 따라 관찰하였다. 일정양의 황산암모늄에 다양한 농도의 탄소원을 첨가하여 C/N 비율을 5, 10, 20, 30에 맞추어 그에 따른 암모니아 및 질산염의 제거율을 알아보았다.
- 질소원으로 (NH4)2SO4를 넣고 두 종류의 탄소원이 첨가된 조건에 따라 CW-4Y의 NH4+-N 와 NO3-N의 제거능을 알아보았다. 실험은 진탕배양 조건으로 하였으며 실험초기의 C/N비는 참고문헌 등에 의거하여 10으로 설정하였으나, 이후 적절한 C/N비 조건을 찾은 후 16으로 다시 조절하였다.
- 탄소원으로 glucose를 이용하고, 두 종류의 질소원에 대한 분리균주 CW-4Y의 활성을 호기적 진탕배양 조건에서 확인하였다 (Fig. 2). 일반적으로 미생물은 C/N비 10에서의 성장과 기질이용도가 높다고 잘 알려져 있다.
- 측정 후 암모니아 가스의 배출이 균주를 접종하지 않은 대조군에 비해 분해되는 배양액을 다시 5회에 걸친 계대과정 과정을 마친 후 LB Agar 배지에 도말하였다. 형성된 colony를 화염 멸균된 백금이로 streaking 하였다. 이러한 방법을 2~3회 반복한 후 독립된 단일 colony를 배양하여 위와 같은 방법으로 혼합유박과 glucose를 넣은 vial에 접종하여 암모니아가스가 대조군에 비해 분해되는 균주를 최종적으로 선택하였다.
- 호기적 탈질화 반응을 확인하기 위하여 유리재질의 6 L (17.5∅×25.5H)의 반응기 (Fig. 1)에 3L의 배지를 넣고 멸균한 후 전배양된 균주를 접종한 후 실험하였다.
- 혼합유박의 성분과 C, H, N, S조성은 Table 1에 나타냈으며, C, H, N, S 원소분석은 CHN/S Analyzer (LECO Corp., USA)을 이용하여 분석하였고, 미량원소에 대한 분석은 ICP-OES (Optima 5300DV, Perkinelmer, USA)로 분석하였다.
대상 데이터
- -N의 농도는 ㈜씨맥 (C-MAC) 사의 시약을 이용하여 분광광도계 (DR5000 UV; HACH, USA)를 이용하여 측정하였다. DO는 DO meter (KRK Co., DO-5Z)을 이용하여 측정하였다. 액체 배양된 균의 광학밀도는 분광광도계 (DR5000 UV; HACH, USA)를 이용하여 660 nm에서 OD를 측정하었다.
- 본 실험에 사용된 시료는 I시의 공단의 오염된 하천 슬러지를 이용하였으며, 채취한 시료는 직사광선의 차단을 위해 멸균한 1L 갈색 채수병에 넣은 후 4oC 냉장보관을 하여 실험실로 운반하였다.
- 이때 primer는 F27 (5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3')과 R1492 (5'-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3')를 사용하였다.
- 탄소원은 기본배지에서의 glucose 대신 구연산 (citrate)염이 사용하였으며, 질소원으로는 기본배지에서의 황산암모늄 ((NH4)2SO4) 대신에 질산암모늄 (NH4NO2)이 사용되었다. 기본배지 (100 mL)는 250 mL 삼각플라스크에 담았으며, 입구 부분은 실리스토퍼를 이용하여 막았다.
- -N의 분해를 산소의 유무에 따라 확인하였다. 호기적 배양과 혐기적 배양 모두 질소원으로는 질산암모늄을 이용하였으며, 탄소원으로는 glucose를 이용하였으며, C/N비는 16으로 맞춰주었다. NH4+-N의 경우 호기적 배양에서 6일간 총 148 mgNH4+-N/L를 분해하였다.
이론/모형
- 분석된 염기서열은 The National Center for Biotechnology Information (NCBI) web site의 Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) algorithm을 통해 Gen Bank database와 비교하여 분리된 미생물을 동정 하였다.
성능/효과
- CW-4P균주는 기질로 이용되는 NO3−-N를 하루 만에 91.3%를 제거할 수 있는 것을 알 수 있었다.
- CW-4Y 균주는 기존에 보고된 종속영양 호기적 탈질화를 하는 균주와 비교하여 최대로 약 23배 (호기적배양)~약 30배 (혐기적배양)의 높은 분해속도를 보이며, 탄소원으로 glucose 가 공급되었을 때 성장이 잘 이루어지고 C/N비 16 부근에서 최대 NH4+-N 제거율을 보인다.
- CW-4Y균주는 축산 및 축산폐수의 악취의 주요 원인물질인 암모니아가스를 분해하는 능력을 가졌으며, 종속영양세균으로서 호기적 질산화-탈질화를 하여 동시에 NH4+-N 및 NO3−-N를 제거하는 특이적 성질을 가졌다.
- 각 조건에서 총 237.8 mg/L와 234.7 mg/L의 유사한 양을 분해하였지만 최대제거속도는 호기적 배양에서 2일 동안 192 mg- N·L-1·d-1, 혐기적 배양에서 하루만에 253.3 mg- N·L-1·d-1의 제거 속도를 보여주었다.
- 각각의 최대제거 속도는 황산암모늄배지에서 NH4+-N이 74.3 mgN·L-1·d-1, NO3−-N이 3.3 mg-N·L-1·d-1이였고, 질산암모늄 배지에서 NH4+-N는 80 mg-N·L-1·d-1, NO3−-N이 192 mg- N·L-1·d-1로 높은 제거 속도를 보여주었다.
- 첫째로, 유기물과 산소를 이용할 수 있는 조건이 동일하여 동시에 질산화와 탈질이 한 반응기 내에서 일어날 수 있다. 둘째로 탈질과정이 진행되는 반응기 내의 pH의 변화를 균형있게 유지시켜서 질산화 과정 중에 일어나는 산성화 과정을 억제해 줄 수 있다. 마지막으로, 종속영양성 질산화의 최종 생성물 및 기질이 다양하기 때문에 다양한 미생물의 혼합배양을 할 수 있고 그 응용 범위도 넓게 확대될 수 있다 [17].
- 본 연구에서 얻은 암모니아 제거율을 시간단위로 환산할 경우, 3.1~3.33 mg-N·L-1·h-1의 제거율을 보이므로 초기 값이 기존 발표보다 약 3.8~9배 가량 높은 것을 감안하면 매우 효과적인 제거효율을 보이는 것을 알 수 있었다.
- 본 연구에서는 암모니아를 제거하기 위한 미생물을 농화배양하는 과정에서 영양배지에서 암모니아를 제거하는 종속영양성 암모니아 산화세균을 분리하게 되었다. 분리세균의 생리학적 특성을 알아보는 과정에서 종속영양적 질산화 및 호기적 탈질이 진행되는 것을 알았으며, 분자생물학적 분석결과 분리된 미생물이 Stenotrophomonas sp. CW-4Y으로 동정되었다.
- 실험 결과, 분리균 CW-4Y의 경우 C/N비가 5, 10, 16, 20, 30에서 암모니아의 분해속도가 각각 38.6 mg- N·L-1·d-1, 39 mg- N·L-1·d-1, 72 mgN·L-1·d-1, 24.3 mg- N·L-1·d-1, 25.8 mg- N·L-1·d-1으로 나타나 C/N비 16에서 가장 높은 것으로 나왔다.
- 이는 기존의 탈질화가 혐기적 조건 하에서 이루어진다는 결과와 같지만 CW-4Y는 호기적 조건 하에서도 NO3−-N를 분해하는 것을 확인할 수 있었다.
- 43 mg-N/L·h-1의 NH4-N 제거속도를 보여주었다[21]. 즉, 종속영양성 질소분해 세균의 경우 기질의 종류와 균주에 따라, C/N비가 6-15사이에서 최고의 암모니아분해 효율을 보임을 알 수 있었다.
- 4 ppm으로 조절하였을 경우 NO3−-N와 NO2−-N의 변화가 거의 없었다. 즉, 충분한 산소가 공급되지 않는 환경에서 질산화가 진행되지 않음을 알 수 있었다. 이후, DO농도를 4.
- 질산암모늄 (NH4NO3)을 질소원으로 넣어준 배지는 CW-4Y 를 접종 후 5일째 초기 농도인 NH4+-N 192 mg/L 중 평균 143.3 mg/L를 분해하였으며, NO3-N는 초기 농도인 282 mg/L를 2일째까지 256 mg/L을 분해하여 128 mg- N·L-1·d-1의 빠른 제거 속도를 보여주었다 (Fig.
- 종속영양성 질산화 및 호기적 탈질과정을 통한 질소제거기작은 다양한 측면에서 유리한 점이 있다. 첫째로, 유기물과 산소를 이용할 수 있는 조건이 동일하여 동시에 질산화와 탈질이 한 반응기 내에서 일어날 수 있다. 둘째로 탈질과정이 진행되는 반응기 내의 pH의 변화를 균형있게 유지시켜서 질산화 과정 중에 일어나는 산성화 과정을 억제해 줄 수 있다.
- 축산농가 내의 분뇨 슬러리, 주변 토양 및 하수처리장의 활성슬러지 등의 다양한 환경으로부터 채취한 총 7개의 실험군중 A 실험군에서 0.1%의 Glucose를 첨가한 경우, 3일째 암모니아가스의 제거율이 93.5%, 7일째 66.9%로 나타났으며, 이는 모든 실험군에서 가장 우수한 제거율을 보여주는 것이었다. 이후 A 실험군에서 배지 종류를 다양하게 하여 순수분리를 하였다.
후속연구
- 또한, 지금까지의 미생물을 이용한 폐수처리 연구들은 단순히 질산화 미생물과 탈질화 미생물을 각각의 반응조에 첨가하여 유기질소원을 제거하는 방식으로 이루어 졌다. 하지만 이 과정에서 다량의 악취가 발생하게 되고, 이로 인한 악취는 자극성의 정도에 따라 주민 생활에 직, 간접적으로 영향을 끼치는 대표적인 생활 공해 물질로서 이로 인한 민원이 끊이지 않고 있어 폐수처리장 악취제거는 시급한 문제인데 이를 CW-4Y균주를 이용하여 해결할 수 있을 것으로 기대된다.
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