본 연구에서는 농약에서 제브라피쉬를 이용한 발생독성시험 가능성을 탐색하고자 사용양이 많은 농약 중 어독성이 보고된 제초제 alachlor 및 butachlor와 어독성이 높고 꿀벌위해성 등이 보고된 살충제 fipronil을 시험물질로 선정하였고, 농도와 노출시기를 달리하여 제브라피쉬 배아에 노출시켜 발생에 미치는 영향을 측정하였다. 그 결과, alachlor에 의한 제브라피쉬 배아의 부화율 및 이상율은 24-48 hpf 군이 높았고, $40{\mu}M$ 이상 농도에 노출된 모든 군의 치어에서 꼬리휨, 부종 및 활동성 저하의 증상이 관찰되었다. Butachlor의 경우 24-48 hpf 군의 부화율과 이상율이 다른 시기에 노출된 군에 비해 높았고, $40{\mu}M$ 이상 농도에서 부화전 치사율이 높았으며, 48 hpf 군 제브라피쉬 배아는 부화 전 모두 치사되었다. 생존한 모든 치어에서 꼬리휨, 부종 등 증상이 관찰되었다. Fipronil에 의한 제브라피쉬 배아의 부화율 및 생존율은 다른 농약에 비해 높았으나 생존한 대부분의 치어에서 꼬리휨 증상이 관찰되었다. 따라서, 농약 3종을 농도와 시기를 달리하여 제브라피쉬 배아의 발생에 미치는 영향을 측정한 결과, 모든 농약이 발생에 미치는 영향은 농도에 비례하였고, 형태이상 및 이상증상은 농도 뿐 아니라, 노출시기에 따라 다르게 나타났다.
본 연구에서는 농약에서 제브라피쉬를 이용한 발생독성시험 가능성을 탐색하고자 사용양이 많은 농약 중 어독성이 보고된 제초제 alachlor 및 butachlor와 어독성이 높고 꿀벌위해성 등이 보고된 살충제 fipronil을 시험물질로 선정하였고, 농도와 노출시기를 달리하여 제브라피쉬 배아에 노출시켜 발생에 미치는 영향을 측정하였다. 그 결과, alachlor에 의한 제브라피쉬 배아의 부화율 및 이상율은 24-48 hpf 군이 높았고, $40{\mu}M$ 이상 농도에 노출된 모든 군의 치어에서 꼬리휨, 부종 및 활동성 저하의 증상이 관찰되었다. Butachlor의 경우 24-48 hpf 군의 부화율과 이상율이 다른 시기에 노출된 군에 비해 높았고, $40{\mu}M$ 이상 농도에서 부화전 치사율이 높았으며, 48 hpf 군 제브라피쉬 배아는 부화 전 모두 치사되었다. 생존한 모든 치어에서 꼬리휨, 부종 등 증상이 관찰되었다. Fipronil에 의한 제브라피쉬 배아의 부화율 및 생존율은 다른 농약에 비해 높았으나 생존한 대부분의 치어에서 꼬리휨 증상이 관찰되었다. 따라서, 농약 3종을 농도와 시기를 달리하여 제브라피쉬 배아의 발생에 미치는 영향을 측정한 결과, 모든 농약이 발생에 미치는 영향은 농도에 비례하였고, 형태이상 및 이상증상은 농도 뿐 아니라, 노출시기에 따라 다르게 나타났다.
This study is aimed to search the possibility of developmental toxicity test using the zebrafish from the pesticide. We selected herbicides alachlor and butachlor, reported for fish toxicity, and insecticide fipronil reported for the high fish toxicity and the honey bee risk among the pesticides wit...
This study is aimed to search the possibility of developmental toxicity test using the zebrafish from the pesticide. We selected herbicides alachlor and butachlor, reported for fish toxicity, and insecticide fipronil reported for the high fish toxicity and the honey bee risk among the pesticides with high usability for the examples of the pesticides in this experiment. In this study, we showed those effects on the zebrafish embryo development by exposing different kinds of pesticide with different concentration and exposed time periods. As a result, the rates of hatching and abnormality of the zebrafish embryo after treatments of alachlor were increased in 24-48 hpf group, and the juvenile fishes in every group exposed to $40{\mu}M$ or more of alachlor displayed sever morphological changes such as bent tails, edema and activity failures. In case of the butachlor, the rates of hatching and the abnormality in 24-48 hpf group were higher than the other groups exposed in different time periods. The fatality before hatching was high in $40{\mu}M$ or more of butachlor treatment, and entire zebrafish embryos in 48 hpf group died before hatching. All the living juvenile fishes showed morphological changes as like as the treatment of alachlor. The rate of hatching and the survival of the zebrafish embryo by the fipronil were higher than other pesticides. However, morphological changes such as bent tails were observed from the most of living juvenile fishes. Therefore, the effects of three different pesticides with different concentrations and exposing time periods on the development of zebrafish embryos showed that all the pesticides effects were proportional to the concentration, and exposing time periods may cause the morphological abnormality.
This study is aimed to search the possibility of developmental toxicity test using the zebrafish from the pesticide. We selected herbicides alachlor and butachlor, reported for fish toxicity, and insecticide fipronil reported for the high fish toxicity and the honey bee risk among the pesticides with high usability for the examples of the pesticides in this experiment. In this study, we showed those effects on the zebrafish embryo development by exposing different kinds of pesticide with different concentration and exposed time periods. As a result, the rates of hatching and abnormality of the zebrafish embryo after treatments of alachlor were increased in 24-48 hpf group, and the juvenile fishes in every group exposed to $40{\mu}M$ or more of alachlor displayed sever morphological changes such as bent tails, edema and activity failures. In case of the butachlor, the rates of hatching and the abnormality in 24-48 hpf group were higher than the other groups exposed in different time periods. The fatality before hatching was high in $40{\mu}M$ or more of butachlor treatment, and entire zebrafish embryos in 48 hpf group died before hatching. All the living juvenile fishes showed morphological changes as like as the treatment of alachlor. The rate of hatching and the survival of the zebrafish embryo by the fipronil were higher than other pesticides. However, morphological changes such as bent tails were observed from the most of living juvenile fishes. Therefore, the effects of three different pesticides with different concentrations and exposing time periods on the development of zebrafish embryos showed that all the pesticides effects were proportional to the concentration, and exposing time periods may cause the morphological abnormality.
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문제 정의
따라서 본 연구에서는 사용량이 많은 농약 중 제초제 alachlor 및 butachlor와 살충제 fipronil을 시험물질로 선정하였고, zebrafish의 배아에 발달단계를 달리하여 노출시켰으며 zebrafish 발생에 미치는 영향 및 발생독성시험의 가능성을 모색해 보았다.
제안 방법
3종의 시험물질을 zebrafish 발생배에 노출시켜 24시간마다 치사율을 측정하였고, 120시간째의 치사율로 LC50 값을 산출하였다(Chapin et al., 2008)
노출 24-168시간까지 24시간 간격으로 치사율, 부화율 등을 측정하였고, 120시간째 morphology를 현미경(TE2000-U, Nikon Co., Japan)으로 확인하여 이상개체를 관찰하였다. 이상율은 부화후 생존한 zebrafish 치어를 관찰하여 측정하였으며, 색소이상, 부종, 척추휨을 이상형태로 판단하였다.
노출시기는 3단계로 수정 후-24시간(24 hpf ; houres postfertilization), 수정 후 24-48시간(24-48 hpf), 수정후-48시간(48 hpf)에 각각 zebrafish 배아를 노출시켜 발생에 미치는 영향을 측정하였고, 각 농약의 노출농도는 0, 20, 40, 80, 160, 320 µM였다.
대조군과 시험군으로 나누어 시험하였으며, 시험군은 시험물질의 농도 및 노출시기를 달리하여 시험하였다(Hong et al., 2009; Chapin et al., 2008). 노출시기는 3단계로 수정 후-24시간(24 hpf ; houres postfertilization), 수정 후 24-48시간(24-48 hpf), 수정후-48시간(48 hpf)에 각각 zebrafish 배아를 노출시켜 발생에 미치는 영향을 측정하였고, 각 농약의 노출농도는 0, 20, 40, 80, 160, 320 µM였다.
시험용수는 24시간동안 기포기를 사용하여 공기공급 후 사용하였고, pH meter (Orion Star A216., Thermo Electron Coporation., USA)와 DO meter(Orion 4-Star pH/DO meter., Thermo Electron Coporation., USA)로 pH 및 용존산소량을 측정하였다.
알과 성어를 분리하기 위한 망을 설치한 수조에 암컷과 수컷 성어를 1:2의 비율로 넣고 18-24시간 후 zebrafish 알을 채취하였다. 채취 후 20.
그 결과, 치사율은 농도의존적이었다. LC50 값은 alachlor 24 hpf는 128.
0 mg/L 이상이면 embryo medium의 적정범위라 하였다. 따라서 본 시험에서 zebrafish 및 zebrafish 배아 배양시 사용될 용수의 pH값 및 용존산소량의 범위가 적정 범위임을 확인 할 수 있었다.
따라서 본 연구에서 사용된 시험물질 alachlor, butachlor 및 fipronil을 zebrafish 배아 발생단계에 따라 노출시켜 관찰결과, 꼬리휨, 척추휨, 부종 등의 기형현상이 나타났으며, 이는 시험물질이 zebrafish 신경계에 영향을 미쳐 발생된 결과라 사료된다. 또한, 향후 더 전문적인 다양한 연구를 통해, 기형발생기전 규명연구가 이루어져야 할 것이라 사료된다.
또한, 각 시험물질의 치사율과 LC50 값이 zebrafish 배아의 수정 후부터 체절형성이후(48 hpf)까지 긴 시간 시험물질에 노출되었을 때 LC50 값이 가장 낮았고, 체절형성이후(24-48 hpf)가 체절형성이전(24 hpf)보다 LC50 값이 낮았다. 따라서, 노출시간이 길수록, 체절형성이전에 비해 체절형성이후 시기에서 유해성이 크다고 사료된다.
후속연구
따라서 본 연구에서 사용된 시험물질 alachlor, butachlor 및 fipronil을 zebrafish 배아 발생단계에 따라 노출시켜 관찰결과, 꼬리휨, 척추휨, 부종 등의 기형현상이 나타났으며, 이는 시험물질이 zebrafish 신경계에 영향을 미쳐 발생된 결과라 사료된다. 또한, 향후 더 전문적인 다양한 연구를 통해, 기형발생기전 규명연구가 이루어져야 할 것이라 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
Alachlor란 무엇인가?
Alachlor는 선택성 제초제로 신초 및 뿌리에 의해 흡수되어 식물체로 이동되고 축적되는 물질로, 단백질합성차단에 의한 세포분열 억제 및 뿌리발육을 저해하고, elongase 억제하며, geranylgeranyl pyrophosphate (GGPP) 고리화효소, 지베렐린 경로의 일부를 억제한다(Tomlin, 2009), 국내에서는 3품목 등록되어 있다(Korea Crop Protection Association, 2013). Butachlor는 chloroacetamider계의 제초제로, 벼재배용으로 가장 많이 사용되고 있으며, 국내 Butachlor 10품목 등록되어 사용되고 있다((Korea Crop Protection Association, 2013) 또한, Fipronil은 흡즙성, 저작성 해충에 대해 높은 살충효과를 갖는 phenylpyrazole계열의 살충제로 γ-amino butylic acid (GABA) 수용기에 길항제로 작용하고 GABA유래의 Cl-채널을 차단하여 과도한 흥분상태를 유발하여 살충효과를 나타내며(Kim et al.
Butachlor란 무엇인가?
Alachlor는 선택성 제초제로 신초 및 뿌리에 의해 흡수되어 식물체로 이동되고 축적되는 물질로, 단백질합성차단에 의한 세포분열 억제 및 뿌리발육을 저해하고, elongase 억제하며, geranylgeranyl pyrophosphate (GGPP) 고리화효소, 지베렐린 경로의 일부를 억제한다(Tomlin, 2009), 국내에서는 3품목 등록되어 있다(Korea Crop Protection Association, 2013). Butachlor는 chloroacetamider계의 제초제로, 벼재배용으로 가장 많이 사용되고 있으며, 국내 Butachlor 10품목 등록되어 사용되고 있다((Korea Crop Protection Association, 2013) 또한, Fipronil은 흡즙성, 저작성 해충에 대해 높은 살충효과를 갖는 phenylpyrazole계열의 살충제로 γ-amino butylic acid (GABA) 수용기에 길항제로 작용하고 GABA유래의 Cl-채널을 차단하여 과도한 흥분상태를 유발하여 살충효과를 나타내며(Kim et al., 2009; Kang et al.
Zebrafish가 질병관련 유전자 탐색 및 발생독성시험에 사용되고 있는 이유는?
Zebrafish는 유전자종류가 인간과 매우 유사한 척추동물로 발생배의 대량채취가 가능하다. Zebrafish는 10 hpf (수정 후 10시간. hpf; hours post fertilization) 동안 낭배가 형성되고, 10-24 hpf(수정 후 10시간부터 24시간)에는 체절이 형성되며, 2 dpf (수정 후 2일. dpf; day post fertilization)에는 부화 3 dpf에는 내장형성이 완성된다(Kwon et al., 2006; Kimme, 1995) 이처럼 개체발생 및 기관형성과정이 매우 빠르게 진행되고, 배아가 투명하여 in vivo imaging이 가능하여 발생과정에서 일어나는 cellular process의 변화 관찰이 용이하여 질병 및 돌연변이 형성과정을 실체현미경에서 쉽게 관찰할 수 있어 질병관련 유전자 탐색 및 발생독성시험에 사용되고 있다(Kim et al., 2005; Kwon et al.
참고문헌 (36)
Amatruda, J. F., J. L. Shepard and H. M. Stern (2002) Zebrafish as a cancer model system. Cancer cell. 1:229-231.
Brand, M., M. Granato and C. Nuslein-Volhard (2002) 'Keeping and raising zebrafish' in Nuslein-Volhard & Dahm Zebrafish - A Practical Approach Oxford University Press, Oxford, UK.
Chapin, R., K. A. R. Beyer, B. G. Daston, R. Finnell, T. Flynn, S. Hunter, A. M. Piersma, D. Sandler and P. Vanparrys (2008) State of the art in developmental toxicity screening methods and way forward: A meeting report addressing embryonic stem cell, whole embryo culture, and zebrafish. Birth defects research (Part B) 83:446-456.
Cole, L. M., R. A. Nicholson and J. E. Casida (1993) Action of phenylpyrazole insecticedes at the GABA-gated chloride channel. Pestic Biochem Physiol. 46:47-54.
Dwivedi, S., Q. Saquib, A. Al-Khedhairy and J. Musarrat (2012) Butachlor induced dissipation of mitochondrial membrane potential, oxidative DNA damage and necrosis in human peripheral blood mononuclear cells. Toxicology 302:77-87.
Engeszer, R. E., L. B. Patterson, A. A. Rao and D. M. Parichy (2007) Zebrafish in the wild: a review of natural history and new notes from the field' Zebrafish 4:21-38.
Hong, S. H., H. G. Song, K. J. Jeong, K. I. Ko and M. K. Yeo (2009) Effects of Silver Nanoparticles Exposed in Somite Stage on Zebrafish Development. J. Environ Toxicol. 24:17-23.
Kang, S. H., C. G. Myung, J. S. Lee, Y. D. Yoon and M. K. Kim (2004) Effects of alachlor and endosulfan on the survival and malformation of bombina orientalis embryos. Korean J. Environ. Bio. 22:300-307.
Kang, S. M., C. H. Lee, O. J. Park, J. H. In, H. J. Yoon and O. K. Kuyen (2002) Efficacy of Fipronil-applied Canine Hair against House Dust Mites. 19:215-218.
Kim, B. S., Y. J. Yang, Y. K. Park, M. H. Jeong, A. S. You, K. H. Park and Y. J. Ahn (2009) Risk Assessment of fipronil on Honeybee (Apis mellifera). Korean J. Pestic. Sci. 13:39-44.
Kim, K. W., J. C Ann and J. A Park (2005) Using zebrafish and future research trends. Biowave 7:1-12.
Kimme, W., S. Ballard, B. K. Ullman and T. Schilling (1995) Stages of embryonic development in zebrafish, Developmental Dynamics 203:253-310.
Liu, W. Y., C. Y. Wang, T. S. Wang, G. M. Fellers, B. C. Lai and Y. C. Kam (2011) Impacts of the herbicide butachlor on the larvae of a paddy field breeding frog (Fejervarya limnocharis) in subtropical Taiwan. Ecotoxicology 20:377-384.
Lee, C., H. M. Kim, J. Yoon, S. H. Song, J. Ryu, E. K. Kim, C. Y. Yang, Y. H. Chung, K. Choi and M. S. Lee (2007) Ecological Risk Assessment of Alachlor Using Medaka (Oryzias latipes) and Earthworm (Eisenia fetida). Korean J. Environ. Biol 25:1-7.
Lee, C. J., S. Y. Ryu, K. Park, S. H. Choi, J. G. Jeon and D. G. Rhee (2004) Effect of alachlor on the early development and induction of estrogen-responsive genes. Organohalogen compounds 66:2951-2957.
Lee, J. B., Y. K. Park, Y. W. Chio, B. S. Kim, H. Y. Kwon, Y. D. Jin, G. J. Im and K. Y. Kang (2012) Evaluation of endocrine disrupting effect of the herbicide Alachlor on Japanese Medaka using short term reproduction assay. Korean J. Pestic. Sci. 16:187-193.
Moffat, A. S. (1993) New Chemicals seek to outwit insect pests. Science (Wash., DC) 22:495-504.
National Institute of Environmental Research (1999) Comprehension and Reaction of Endocrine Disrupting Chemicals.
Park, Y. K., C. H. Bae, B. S. Kim, J. B. Lee, A. S. You, S. S. Hong, K. H. Park, J. S. Shin, M. K. Hong, K. S. Lee and J. H. Lee (2009) The risk assessment of butachlor for the freshwater aquatic organism. Korean J. Pestic. Sci. 13:1-12.
Roth, M. (1991) Campomelic syndrome: experimental models and pathomechanism. Pediatr. Radiol. 21:220-225.
Sanchez-Camazona, M. L., F. Lorenzo and M. J. Sanchez-Martin (2005) Atrazine and alachlor inputs to surface and ground waters in irrigated corn cultivation areas of Castilla-Leon, Spain. Environ monit Assess. 105:11-24.
Selderslaghs, I. W. T., A. R. V. Rompay, W. D. Coen and H. E. Witters (2009) Development of a screening assay to identify teratogenic and embryotoxic chemicals using the zebrafish embro. Reproductive Toxicology. 28:308-320.
Stehr, C. M., T. L. Linbo, J. P. Incardona and N. L. Scholz (2006) The Developmental Neurotoxicity of Fipronil: Notochord Degeneration and Locomotor Defects in Zebrafish Embryos and larvae. Toxicological sciences. 92: 270-278.
Vryzas, Z., C. Alexoudis, G. Vassiliou, K. Galanis and E. Papadopoulou-Mourkidou (2011) Determination and aquatic risk assessment of pesticide residue in riparian drainage canals in Northeastern Greece. Ecotoxicol Environ Saf. 74:174-181.
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