[논문]단백질 분해효소 생산 균주 분리

김기은

doi:10.4491/ksee.2014.36.4.265

단백질 분해효소 생산 균주 분리
Isolation of Protease Producing Microorganisms 원문보기

대한환경공학회지 = Journal of Korean Society of Environmental Engineers, v.36 no.4, 2014년, pp.265 - 270

초록
AI-Helper

영양 성분을 함유하고 있는 유기성 폐기물은 미생물에 의해 처리되어, 유용한 물질로 전환될 수 있다. 이러한 생물학적 공정에서 미생물 세포와 효소는 원료 물질인 기질과 함께 중요하다. 대규모화 공정에서도 미생물 세포와 효소는 공정 최적화에서 필수적인 요소이다. 본 연구에서는 이러한 생물학적 공정의 효율성을 높이는 목적으로 다량의 아미노산과 단백질을 함유하고 있는 많은 종류의 부패가 진전된 유기성 폐기물과 발효 식품에서 단백질 분해효소를 생산하는 미생물을 분리하였다. 단백질 분해 효소의 활성, 온도와 산도등 활성 조건과 활성 정도를 확인하여 선택된 균주들을 동정하였다. 산업적으로 저온에서 단백질을 분해하는 효소는 유기성 폐기물을 저온에서 처리할 수 있다. 저온에서 처리가 가능하다는 것은 폐기물의 처리 온도를 낮은 상태로 유지할 수 있어 그 만큼의 열(steam)비용을 줄일 수 있다. 또한 이 단백질 분해효소를 이용하여 단백질을 분해 후 다량의 아미노산을 생산할 수 있으므로 아미노산 생산 공정에도 적용이 가능하다. 이렇게 유기 폐기물을 처리하여 다양한 용도로 사용할 수 있으므로, 폐기물의 가치를 높일 수 있다. 다양한 활성 조건에서 단백질 분해효소를 다량으로 생산하는 균주를 분리하여 동정하고, 균주 배양 조건, 효소 생산의 최적 조건에 대한 연구를 수행하였다.

Abstract ▼ AI-Helper

Protease producing microorganisms were isolated from many kinds of food waste and fermented foods, which contains high amount and variable kinds of degraded substances. Several microorganisms were identified by 16S rRNA full sequencing analysis methods. The activity of protease was analyzed and identified in variable conditions for the application. For industrial use for biowaste treatment some proteases were isolated, identified and selected from microbial cells. And the tests were carried for the further use. The protein degrading activity at low temperature is useful for the treatment of organic waste, which contains much proteins. By the protein degradation process the organic waste can be utilized in variable fields, for example from feedstuff supplement to fertilizer for agriculture. Bacterial cells with protease activity at low temperature were isolated and identified. The optimal conditions for microbial cultivation and protease production were studied.

주제어

AI 본문요약
AI-Helper

* AI 자동 식별 결과로 적합하지 않은 문장이 있을 수 있으니, 이용에 유의하시기 바랍니다.

문제 정의

본 연구에서는 어류와 육류 폐기물 등 여러 가지 부패된 유기성 폐기물과 김치, 젓갈, 된장 등 발효 식품에서 단백질 분해력을 보유한 미생물들 중 여러 온도 조건에서 단백질분해력이 우수하였다. 또한, 효소도 빠르게 생산하고, 유해성이 없는, 된장에서 분리된 미생물들을 선택하였고, 의미있을 수 있다고 추정되는 균주들을 선택하여 동정하고 연구하였다.
본 연구실에서는 여러 가지 발효 제품에서 다양한 종류의 세균과 효모 등을 분리하였는데, 이들이 생산할 수 있는 효소들은 많은 가능성을 보이고 있다. 본 연구에서는 이들 효소들의 가능성을 확인하고 적용하는 데 필요한 결과를 확인하였다. 균주의 효소 생산성을 높이고, 적용 분야를 찾는 연구가 후속된다면 다양한 분야의 산업분야에 유용할 것으로 사료된다.
Table 3에는 균주 별 온도별 생성된 clear zone의 크기를 통해 단백질분해효소의 활성을 비교하였다. 본 연구의 목적은 여러 가지 온도조건에서 활성이 있는 단백질분해효소를 생성하는 미생물을 분리하여 다양한 산업분야에 적용하는 데에 있으므로, 균주와 활성 온도 조건에 중점을 두고 분석하였다.
즉 가장 빠른 시간 안에 단백질가수분해효소를 생산한다고 보인다. 이를 산업에 응용가능한 공학적 관점에서 보았다. 최종적인 diameter의 크기는 TH1-1, TH1-3, TH2-1 모두 14 mm전후이므로 활성도에는 별다른 차이가 없는 것을 확인할 수 있다.

제안 방법

spectrophotometer (UV1700 pharmaspec, Shimadzu)를 이용하여 660 nm에서 O.D값을 측정하고, glucose 분석키트(Bcs glucose kit-MF 0801, Bioclinical System Ltd.)를 이용하여 tube에 효소액 3 mL와 측정할 검체와 맹검(맹검은 3차수를 이용하여 대조군으로 하였다)을 20 µL을 넣고 37.9℃에서 중탕한 후 spectrophotometer를 사용하여 505 nm에서 glucose농도를 측정하였다.
단백질 분해 효소를 생산하는 균주들은 서울 지역의 일반 가정에서 발생된 단백질 함유 식품 폐기물을 수거하고, 동시에 3년 이상 발효가 진전된 다양한 종류의 된장과 간장 시료를 각각 3종씩 수집하고, 선택하여 균주들을 분리하였다. 시료들을 각각 멸균된 생리식염수로 희석하고 세균, 유산균, 효모와 곰팡이 종류를 분리하는 배지를 준비하고 희석단계를 거쳐 아가 배지에 각각 접종하였다.
본 연구에서는 어류와 육류 폐기물 등 여러 가지 부패된 유기성 폐기물과 김치, 젓갈, 된장 등 발효 식품에서 단백질 분해력을 보유한 미생물들 중 여러 온도 조건에서 단백질분해력이 우수하였다. 또한, 효소도 빠르게 생산하고, 유해성이 없는, 된장에서 분리된 미생물들을 선택하였고, 의미있을 수 있다고 추정되는 균주들을 선택하여 동정하고 연구하였다. 다른 식품폐기물에 Bacillus subtilis를 이용하여 발효를 실시하고, 그 발효산물의 특성을 파악하여 감귤 가공부산물을 기능성 소재로서의 활용가능성이 모색된 바 있다.
미생물 배양과정에서 효소 생산과정을 추적하기 위한 목적으로 접종 후 2시간마다 시료를 채취하여 실험 및 방법 2.2에 제시한 방법으로 단백질분해효소의 활성을 확인하는 실험을 실시하고, 활성도의 크기를 측정하였다. 이 방법은 기존의 방법⁹⁾을 변형하여 실시하였다.
종균들은 냉동보관을 위해 glycerol로 처리하여 -80℃에서 3개월마다 계대배양하였다. 분리된 균주들중 활성이 가장 좋은 균주들을 선택하여, 배양 후 (주) 마크로젠에 의뢰하여 16S rRNA full sequencing방법으로 균을 동정하였고, rRNA database (national center for biotechnology information, NCBI; ribosomal database project, RDP; European ribosomal RNA database, ERRD)와 비교하여 대상 미생물의 종류를 확인하였다.
본 논문에서는 여러 가지 발효 제품에서 단백질 분해효소를 생산하는 균주를 선별하였다. 산업적 이용가능성을 바탕으로 진행된 기초 실험으로 저온에서 활성화를 나타내는 균주를 찾고 이 균주에 대한 특성을 확인하였다.
단백질 분해 효소를 생산하는 균주들은 서울 지역의 일반 가정에서 발생된 단백질 함유 식품 폐기물을 수거하고, 동시에 3년 이상 발효가 진전된 다양한 종류의 된장과 간장 시료를 각각 3종씩 수집하고, 선택하여 균주들을 분리하였다. 시료들을 각각 멸균된 생리식염수로 희석하고 세균, 유산균, 효모와 곰팡이 종류를 분리하는 배지를 준비하고 희석단계를 거쳐 아가 배지에 각각 접종하였다.^6~8) 생성된 콜로니를 확인하고 각 시료 당 총균 수를 측정한 후 콜로니를 채취하여 액체배지에서 계속 배양하였다.
시료에서 분리된 균주 중 저온에서 활성도가 높은 단백질 분해효소가 생성하는 균주들을 선택하였고, 선택한 균주는 35℃, shaking incubator에서 120 rpm으로 배양하면서, 2시간마다 시료를 채취하였다. spectrophotometer (UV1700 pharmaspec, Shimadzu)를 이용하여 660 nm에서 O.
된장과 간장에서 단백질 분해효소를 생산하는 균주 27종을 분리하였다. 이들을 배양하여 단백질 분해효소를 가장 많이 생산하는 균주 3종을 분리하고, 이를 각각 TH1-1, TH1-3, TH2-1로 명명하였다. 가장 분해력이 우수한 효소를 생산하는 TH1-1을 동정한 결과 Bacillus subtilis일 확률이 99%인 것으로 도출되었다(Table 2).
다음 멸균된 배지에 멸균된 skim milk액을 추가하여 아가배지에서 고형배지화한다. 이렇게 제조된 skim plate 표면에 상등액이 흡착된 paper disc를 올려 놓고, 24시간에서 48시간 정도 여러 온도상에서 배양하고, clear zone의 생성여부를 통해 단백질 분해 정도, 단백질 분해효소의 작용을 확인하였다. 이 실험은 기존의 방법⁹⁾에 따라 실시하였다.

대상 데이터

본 논문에서는 여러 가지 발효 제품에서 단백질 분해효소를 생산하는 균주를 선별하였다. 산업적 이용가능성을 바탕으로 진행된 기초 실험으로 저온에서 활성화를 나타내는 균주를 찾고 이 균주에 대한 특성을 확인하였다.
우선 어류, 육류 폐기물 등 여러 가지 부패된 유기성 폐기물과 김치, 젓갈, 된장 등 발효 식품에서 단백질 분해력을 보유할 것으로 사료되는 미생물 십여 종을 분리하였다. 이중에서 여러 온도 조건에서 단백질분해력이 우수하고, 효소도 빠르게 생산하고, 유해성이 없는, 된장에서 분리된 미생물들을 선별하였다.

이론/모형

이렇게 제조된 skim plate 표면에 상등액이 흡착된 paper disc를 올려 놓고, 24시간에서 48시간 정도 여러 온도상에서 배양하고, clear zone의 생성여부를 통해 단백질 분해 정도, 단백질 분해효소의 작용을 확인하였다. 이 실험은 기존의 방법⁹⁾에 따라 실시하였다.

성능/효과

기존 연구에 의하면 적당량 액비를 사용하게 되면, 식물의 생장에 효과가 있다고 한다.⁵⁾ 또한 식물의 각 부위에 있는 질소는 대부분 단백질 분자 내에 있는 것이기 때문에 생장시기에 따른 질소 함량의 변화는 단백질의 분해와 합성의 정도를 반영하는 것이고, 잎에서는 단백질의 절반이 엽록체에 존재한다. 식물의 각 부위에 있는 질소는 대부분 단백질 분자 내에 있는 것이기 때문에 생장시기에 따른 질소 함량의 변화는 단백질의 분해와 합성의 정도를 반영하는 것이고, 잎에서는 단백질의 절반이 엽록체에 존재한다.
이들을 배양하여 단백질 분해효소를 가장 많이 생산하는 균주 3종을 분리하고, 이를 각각 TH1-1, TH1-3, TH2-1로 명명하였다. 가장 분해력이 우수한 효소를 생산하는 TH1-1을 동정한 결과 Bacillus subtilis일 확률이 99%인 것으로 도출되었다(Table 2). 16s rRNA full sequencing한 결과와 phylogenic tree는 각각 Fig.
각 온도별 균주의 protease활성을 비교해보면 25℃~40℃에서 TH1-1과 TH2-1의 클리어 존 크기가 가장 컸다(Fig. 3, 4). 이로서 분리된 균주 중 TH1-1의 protease활성이 가장 높다고 볼 수 있다.
본 연구실에서 분리된 미생물에는 단백질분해효소가 생산되고 있음이 확인되었다. 이러한 효소들은 유기성 폐기물을 분해하여 적용할 수 있는 비료산업 분야 등 여러 산업분야에서 수요가 높다.
비교한 결과는 clear zone의 크기가 배양온도 별 35℃ > 40℃ > 25℃ > 30℃ > 20℃의 순으로 결과가 확인되었다(Fig. 3).
우선 어류, 육류 폐기물 등 여러 가지 부패된 유기성 폐기물과 김치, 젓갈, 된장 등 발효 식품에서 단백질 분해력을 보유할 것으로 사료되는 미생물 십여 종을 분리하였다. 이중에서 여러 온도 조건에서 단백질분해력이 우수하고, 효소도 빠르게 생산하고, 유해성이 없는, 된장에서 분리된 미생물들을 선별하였다.
이를 산업에 응용가능한 공학적 관점에서 보았다. 최종적인 diameter의 크기는 TH1-1, TH1-3, TH2-1 모두 14 mm전후이므로 활성도에는 별다른 차이가 없는 것을 확인할 수 있다. 그러므로 산업적인 관점에서 TH2-1이 가장 빠른 시간 안에 목적물질을 빨리 생산할 수 있음을 나타내므로 산업화시키기에 가장 유용한 미생물로 생각된다.

후속연구

본 연구에서는 이들 효소들의 가능성을 확인하고 적용하는 데 필요한 결과를 확인하였다. 균주의 효소 생산성을 높이고, 적용 분야를 찾는 연구가 후속된다면 다양한 분야의 산업분야에 유용할 것으로 사료된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	단백질가수분해효소는 어떤 분야에서 활용되는가?	단백질가수분해효소는 단백질을 펩티드단위로 가수분해하며 산업, 의약, 식품, 피혁분야 등 다양한 분야에서 사용된다. 단백질가수분해효소는 산업분야에서 중요한 효소중의 하나이기에 시장규모가 매우 크다.
	미생물세포에 의해 생산되는 단백질분해효소는 어떻게 생산되며 산업적 측면에서 유용한 까닭은?	단백질분해효소는 모든 생물체에서 생성되며, 세균, 곰팡이, 효모 등 미생물 세포에 의해 다량 생산된다. 특히 미생물세포에 의해 생산되는 단백질분해효소는 세포의 대량배양을 통해 안정적으로 생산할 수 있으며, 공정을 최적화하여 생산성과 경제성을 높일 수 있으므로 산업적 측면에서 매우 유용하므로, 용도와 기능에 따라 지속적으로 개발되고 최적화되고 있다. 특히 세균은 단백질분해효소를 세포 밖으로 분비하고, 이는 공정상 여러 가지 장점을 가지고 있으므로 산업화를 목적으로 지속적으로 연구 개발되고 있다.
	단백질가수분해효소가 전체 효소 시장에서 차지하고 있는 비율은?	단백질가수분해효소는 산업분야에서 중요한 효소중의 하나이기에 시장규모가 매우 크다. 대략 전체 효소 시장의 60% 정도 되는 것으로 평가되고 있다.

참고문헌 (11)

An, T. H., Kang, J. Y., Park, S. Y., Jang, S. W. and Lee, Y. S., "Application of Liquid Amino-fertilizer for Greenup Promotion during Spring Season," Kor. Turfgrass Sci., 24(1), 36-44(2010).
Kim, K.-P., Kim, N.-H., Rhee, C.-H. and Woo, C.-J., "Isolation and Characterization of Protease Producing Bacteria from Soil," Kor. Soc. Food Sci. Nutr., 31(5), 754-759(2002).

원문보기 상세보기
Lim, S.-I. and Yoo, J.-Y., "Purification and Characteristics of Protease Produced by Syncephalastrum racemosum PDA 132-2 from Korean Traditional Meju/Seong-Il Lim J.," Kor. Soc. Food Sci. Nutr., 28(5), 1010-1016(1999).
Choi, B.-B., "Enzymatic properties of Serratia marcescens protease," Kor. J. Food Nutr., 16(2), 152-157(2003).
Hwang, J.-Y., Choi, S.-H., Lee, S.-K. and Kim, S.-M., "Optimal Conditions for the Production of Salt-tolerant Protease from Aspergillus sp. 101 and Its Characteristics," J. Kor. Soc. Food Nutr., 38(11), 1612-1617(2009).

원문보기 상세보기
Bos, S. J., Approaches to the isolation of an unidentified microbial product, In Verrall, M. S. 9 editor, Discovery and Isolation of Microbial Products. Ellis Horwood Publischers, Chichester, U.K., pp. 32-51(1985).
Cheetham, P. S. J., Microbial screening, selection and strain improvement. In:Bu'Lock, J. and B. Kristiansen (editors). Basic Biotechnology. Academic Press, London. pp. 217-251 (1987).
Vandamme, E. J,. Antibiotic search and production: an overview. In Vandamme, E. J. (editor) Biotechnology in industrial antibiotecs. Marcel Dekker, New York. pp. 3-31(1984).
Massaki, M., Hiromi, D., Toshifume, T., Satoru, M., Yasutsugu, S. and Tadayuki, I., "A new lipopeptide biosurvactant produced by Arthrobacter sp. Strain MIS38," J. Bacteriol., 175, 6459-6466(1993).

상세보기
Atkinson, B. and Mavituna, F., Biochemical Engineering and Biotechnology Handbook, 3nd ed., Stockton Press, New York (1991).
Bailey, J. E. and Ollis, D. F., Biochemical Engineering Fundamentals, 2nd ed., McGraw-Hill, New York(1986).

저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

내보내기 구분	파일저장 인쇄 메일전송
구성항목	기본정보 상세정보 관리번호, 논문명, 저널/프로시딩명, 저자 , 발행년, 권, 호, 시작페이지, 끝페이지, 발행기관 관리번호, 논문명, 대등논문명, 저자 , 저널/프로시딩명, 발행기관, 발행년, 발행언어, 권, 호, 시작페이지, 끝페이지, ISBN, ISSN, 주제분야, 키워드, 초록(한글), 초록(영문), 저자(소속기관)
저장형식	Text(ASCII format) Excel format RefWorks Direct Export RIS format (for Reference Manager, ProCite, EndNote), Scholar's Aids, Mendeley
메일정보	받는사람 (필수) @ 보내는사람 (선택) @ 제목 내용 KISTI 검색결과 이메일 서비스
안내	총 건의 자료가 검색되었습니다. 다운받으실 자료의 인덱스를 입력하세요. (1-10,000) 검색결과의 순서대로 최대 10,000건 까지 다운로드가 가능합니다. 데이타가 많을 경우 속도가 느려질 수 있습니다.(최대 2~3분 소요) 다운로드 파일은 UTF-8 형태로 저장됩니다. 파일의 내용이 제대로 보이지 않을실 때는 웹브라우저 상단의 보기 -> 인코딩 -> 자동선택 여부를 확인하십시오. ~ Text(ASCII format) Excel format

연합인증