김치의 가수분해효소로서 발효원으로 사용되고 균체증식에 필수적인 아미노산 생산에 관여하는 단백질분해호소를 생성하는 균주를 분리하여 동정하였다. 시판되는 풀무원 김치의 5종(전라도김치, 숙성김치, 열무김치, 포기김치, 맛김치)에서 단백질분해효소 활성을 지닌 균주 중 곰팡이와 효모를 제외하고 총 9주를 분리하여 whole cell protein pattern 및 API kit 으로 동정하여 각각의 균주들을 Lactobacillus sp. 1종, Leuconostoc sp. 1종, Bacillus sp. 6종, Brevibacillus sp. 1종으로 판정되었다. 분리된 9종과 단백질 분해효소 활성이 높은 표준균주인 Bacillus subtilis KCCM 12248와 Bacillus licheniformis KCCM 11851에 대해 단백질분해활성을 비교한 결과 김치에서 분리되는 K-2(Brevibacillus속)가 0.11 unit/mg으로 가장 높은 값을 보였다.
김치의 가수분해효소로서 발효원으로 사용되고 균체증식에 필수적인 아미노산 생산에 관여하는 단백질분해호소를 생성하는 균주를 분리하여 동정하였다. 시판되는 풀무원 김치의 5종(전라도김치, 숙성김치, 열무김치, 포기김치, 맛김치)에서 단백질분해효소 활성을 지닌 균주 중 곰팡이와 효모를 제외하고 총 9주를 분리하여 whole cell protein pattern 및 API kit 으로 동정하여 각각의 균주들을 Lactobacillus sp. 1종, Leuconostoc sp. 1종, Bacillus sp. 6종, Brevibacillus sp. 1종으로 판정되었다. 분리된 9종과 단백질 분해효소 활성이 높은 표준균주인 Bacillus subtilis KCCM 12248와 Bacillus licheniformis KCCM 11851에 대해 단백질분해활성을 비교한 결과 김치에서 분리되는 K-2(Brevibacillus속)가 0.11 unit/mg으로 가장 높은 값을 보였다.
Strains producing the protease, which is essential for growth of lactic acid bacteria and fermented kimchi, were screened and identified. Among five types of selected pulmuone kimchis (Jeonlado kimchi, ripened kimchi, yeolmu kimchi, kakdugi, and baechu kimchi), nine strains of bacteria were screened...
Strains producing the protease, which is essential for growth of lactic acid bacteria and fermented kimchi, were screened and identified. Among five types of selected pulmuone kimchis (Jeonlado kimchi, ripened kimchi, yeolmu kimchi, kakdugi, and baechu kimchi), nine strains of bacteria were screened and identified by whole cell protein pattern and API test. The nine strains consisted of one of Lactobacillus sp., one of Leuconostoc sp., six of Bacillus sp., and one of Brevibacillus sp. The protease activities of these strains were compared with known strains (Bac. subtilis KCCM 12248 and Bac. licheniformis KCCM 11851) producing protease. Among tested strains, K-2 (Brevibacillus sp.) showed the highest value (0.11 unit/mg) in protease activity.
Strains producing the protease, which is essential for growth of lactic acid bacteria and fermented kimchi, were screened and identified. Among five types of selected pulmuone kimchis (Jeonlado kimchi, ripened kimchi, yeolmu kimchi, kakdugi, and baechu kimchi), nine strains of bacteria were screened and identified by whole cell protein pattern and API test. The nine strains consisted of one of Lactobacillus sp., one of Leuconostoc sp., six of Bacillus sp., and one of Brevibacillus sp. The protease activities of these strains were compared with known strains (Bac. subtilis KCCM 12248 and Bac. licheniformis KCCM 11851) producing protease. Among tested strains, K-2 (Brevibacillus sp.) showed the highest value (0.11 unit/mg) in protease activity.
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제안 방법
Peptide hydrolase의 종류는 30여종이 보고되고 있으나 본 실험에서는 Azocasein을 기질로 하여 생성된 amino acid를 정 량함으로써 비 특이 적 단백 질분해 효소의 활성을 측정하였다. 효소의 촉매력은 일정한 효소단백질이 나타내는 활성에서 계산하므로 단백질함량과 활성의 측정결과는 Table 4와 같다.
김치의 가수분해 효소로서 발효원으로 사용되고 균 체증식에 필수적인 아미노산 생산에 관여하는 단백질분해효소를 생성하는 균주를 분리하여 동정하였다. 시판되는 풀무원 김치의 5종(전라도김치, 숙성김치, 열무김치, 포기김치, 맛김치) 에서단백질분해효소 활성을 지닌 균주 중 곰팡이와 효모를 제외하고 총 9주를 분리하여 whole cell protein pattern 및 API kit 으로 동정하여 각각의 균주들을 Lactobacillus sp.
5 cm 이상인 균주를 분리하여 동정하였다. 본 균주의 보관을 위하여 멸균된 glycerol stock solution을 사용하여 냉동 보관하고, 실험은 extracellular protease의 활성 유지를 위해 skim milk 배지에서 계대 배양하면서 사용하였다.
이에 분리된 9개의 균주들은 SDS-PAGE에 의해 whole cell protein pattern을 확인하고 비교하였다. 본 연구에서 분리된 균주의 whole cell protein pattern이 동일하게 보이는 균주를 같은 group으로 간주하여, Fig. 2에서 보는 바와 같이 3번 lane을 Group Ⅰ, 4번 lane을 Group Ⅱ, 5, 6, 7, 8, 9, 10번 lane을 Group Ⅲ, 11 번 lane을 Group Ⅳ로 총 4group으로 나누었다. 또한 그 단백질분해효소의 기작과 기능이 잘 알려져 있는 표준균주인Bacillus subtilis KCCM 1224&와 Bacillus licheniformis KCCM 11851 과의 유사성도 whole cell protein pattern을 통하여 확인해 보았으나, 김치에서 분리된 균주는 두 종의 표준균주와는 다른 whole cell protein pattern을 보여 동일한 균주가 아님을 유추할 수 있었다.
분리된 균주의 동정은 SDS-PAGE를 이용한 whole cell protein pattern과 API 50CH kit(Biomerieus, USA)를 사용하였으며 biomerieux의 database system의 결과를 토대로 상호비교 분석하였다.
선별된 균주는 NB broth(Difco, USA)에 배양하고 12,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 상등액을 조효소액으로 사용하 였다. 분리된 젖산균의 protease 활성은 Anson 방법을 변형 하여 측정하였다(15). 즉, 조효소액에 기질로 Azocasein을 30℃ 에서 30분간 반응시키고, 10% TCA를 첨가하여 반응을 정 지시킨 후 원심분리한 상등액에 10% NaOH를 첨가하여 550 nm에서 흡광도를 측정하였다.
유제품 유래 젖산균의 생육이 단백질분해시스템에 영향을 받는 것과 마찬가지로 김치유래 젖산균도 김치제조과정 중 첨가되는 젓갈이 함유하고 있는 단백질의 분해가 젖산균의 성장속도와 김치의 풍미에 큰 영향을 미칠 것으로 추정된다. 이에 본 연구에서는 김치에서 유래되는 protease 활성균주를 분리, 동정하였으며 그 기작과 기능이 밝혀져 있는 표준균주와의 활성 정도를 비교 분석하였다.
분류에 효과적이라고 보고되고 있다(20,21). 이에 분리된 9개의 균주들은 SDS-PAGE에 의해 whole cell protein pattern을 확인하고 비교하였다. 본 연구에서 분리된 균주의 whole cell protein pattern이 동일하게 보이는 균주를 같은 group으로 간주하여, Fig.
채취된 시료는 생리식염수 0.85%(w/v)로 희석하여 순차적 으로 skim milk agar 배 지 (skim milk 5 g/L, bacto tryp tone 10 g/L, yeast extract 5 g/L, NaCl 5 g/L, bacto agar 15 g/L)에 도말하고, 30P로 48시간 배양하여, extracellular pro-tease에 의해 분해되어 형성된 투명환(Clear zone or halo) 의크기가 직경 0.5 cm 이상인 균주를 분리하여 동정하였다. 본 균주의 보관을 위하여 멸균된 glycerol stock solution을 사용하여 냉동 보관하고, 실험은 extracellular protease의 활성 유지를 위해 skim milk 배지에서 계대 배양하면서 사용하였다.
대상 데이터
높은 단백질 분해효소를 생산하는 균종을 분리할 목적으로 풀무원에서 시판되는 5종의 김치(전라도김치, 숙성김치, 열무김치, 깍두기, 배추김치)를 샘플링하여 시료로 사용하였다. 채취된 시료는 생리식염수 0.
이론/모형
Bovine serum albumin을 표준단백질로 하여 Lowry법*에 "따라 측정하였다.
1 N NaOH의 양을 lactic acid의 양으로 환산하였다. NaCl 농도 측정은 염도계 (Atago, Japan)를 사용하였다.
시료김치를 waring blender로 마쇄한 후 거즈로 걸러 그 여 액을 일정량 취하여 pH는 pH meter(IQ Scientific, USA)로 측정하였으며, 산도는 AOAC의 방법(16)에 의하여 lOmL 김 치여액을 중화시키는데 소비된 0.1 N NaOH의 양을 lactic acid의 양으로 환산하였다. NaCl 농도 측정은 염도계 (Atago, Japan)를 사용하였다.
성능/효과
6종, BKevibaciUus sp. 1 종으로 판정되었다. 분리된 9종과 단백질 분해효소 활성이 높은 표준균주인 Bacillus subtilis KCCM 1224&와 Bacillus licheniformis KCCM 11851 에 대해 단백질분해활성을 비교한 결과 김치에서 분리되는 wibacillus속)가 0.
5종의 김치에서 채취한 시료를 생리식염수로 희석하여 순차적으로 skim milk가 함유된 배지에 도말한 뒤 투명환이 생성된 균주들 중에서 0.5cm 이상 되는 것을 1차 분리하 고(Fig. 1), 이들 균주 중에서 cell morphology에 의해 곰팡 이와 효모를 제외시킨 9종을 최종 선별하고, K-l, K-2, ~K9으로 명명하였다(Tablel). 분리된 9종은 젓갈이 많이 함유 된 전라도 김치에서 2주, 4℃에서 6개월간 숙성시킨 숙성김 치에서 1주, 열무김치 1주, 깍두기 4주, 배추김치에서 2주였 다.
2에서 보는 바와 같이 3번 lane을 Group Ⅰ, 4번 lane을 Group Ⅱ, 5, 6, 7, 8, 9, 10번 lane을 Group Ⅲ, 11 번 lane을 Group Ⅳ로 총 4group으로 나누었다. 또한 그 단백질분해효소의 기작과 기능이 잘 알려져 있는 표준균주인Bacillus subtilis KCCM 1224&와 Bacillus licheniformis KCCM 11851 과의 유사성도 whole cell protein pattern을 통하여 확인해 보았으나, 김치에서 분리된 균주는 두 종의 표준균주와는 다른 whole cell protein pattern을 보여 동일한 균주가 아님을 유추할 수 있었다.
1 종으로 판정되었다. 분리된 9종과 단백질 분해효소 활성이 높은 표준균주인 Bacillus subtilis KCCM 1224&와 Bacillus licheniformis KCCM 11851 에 대해 단백질분해활성을 비교한 결과 김치에서 분리되는 wibacillus속)가 0.11 unit/mg 으로 가장 높은 값을 보였다.
효소의 존재량은 촉매하는 반응속도를 측정하고 활성은 효소량에 비례하지만 같은 양이더라도 조건에 따라 다른 활성을 나타내며 효소의 반응속도는 여러가지 조건에 영향을 받기 때문에 기질에 대한 효소활성이 다르게 나타난다. 비효소 활성도는 Table 4와 같이 분리된 4 group의 균주 중에서 K-2가 0.11 unit/mg로 가장 높았고, 이는 단백질 분해효소 활성이 높은 표준균주인 Bacillus subtilis KCCM 12248 (0.03 unit/mg)보다 약 4배가량 높은 값이다. 김치의 부재료로 사용되는 새우젓과 멸치액젓은 이러한 균주에 의해서 단백질 성분을 아미노산으로 분해함으로써 조미료로서의 역할 뿐만이 아니라 발효에 필수적인 젖산균의 균체증식을 촉진하는 역할을 할 것으로 사료된다.
후속연구
03 unit/mg)보다 약 4배가량 높은 값이다. 김치의 부재료로 사용되는 새우젓과 멸치액젓은 이러한 균주에 의해서 단백질 성분을 아미노산으로 분해함으로써 조미료로서의 역할 뿐만이 아니라 발효에 필수적인 젖산균의 균체증식을 촉진하는 역할을 할 것으로 사료된다. 따라서 향후 protease 생성 균주 K-2는 김치제조시 starter로 사용되었을 경우 아미노산의 생성을 유도하여 김치의 풍미를 향상시켜 줄 것으로 기대되어 진다.
김치의 부재료로 사용되는 새우젓과 멸치액젓은 이러한 균주에 의해서 단백질 성분을 아미노산으로 분해함으로써 조미료로서의 역할 뿐만이 아니라 발효에 필수적인 젖산균의 균체증식을 촉진하는 역할을 할 것으로 사료된다. 따라서 향후 protease 생성 균주 K-2는 김치제조시 starter로 사용되었을 경우 아미노산의 생성을 유도하여 김치의 풍미를 향상시켜 줄 것으로 기대되어 진다.
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