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문제 정의
- 그러나 현재 세균 셀룰로오스의 건조중량 증가요인에 대한 연구는 많이 이루어져 있으나 두께 증가에 영향을 미치는 요인에 대한 연구는 이루어지지 않고 있다. 따라서 본 연구에서는 세균 셀룰로오스 생산성이 높은 균주를 선정한 후, 정치배양에서 셀룰로오스 두께를 증가시킬 수 있는 배양변수들을 one variable at a time (OVT) 방법에 의하여 최적화함으로써 고부가가치 세균 셀룰로오스 소재 개발을 위한 기초자료를 획득하고자 하였다.
제안 방법
- 따라서 본 연구에서는 썩은 과일로부터 분리된 Acetobacter sp. F15를 실험균주로 선정하여 셀룰로오스 두께를 증가시킬 수 있는 정치배양조건을 조사하였다. 세균 셀룰로오스 두께 증가를 위한 최적 배지조성은 glucose 7%, soytone 12%, K2HPO4 0.
- 셀룰로오스 생산을 위한 최적조건을 알아보기 위하여 각종 탄소원, 질소원, 무기염, 보조탄소원, 온도및 pH에 따른 셀룰로오스 생산량을 조사하였다. 또한 확립된 최적조건에서 실험균주를 배양하면서 24시간 간격으로 셀룰로오스의 생산량을 측정하였다.
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3. 셀룰로오스 생성을 위한 최적 배양조건
배양온도 및 초기 pH가 셀룰로오스에 생성에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 20℃-36℃ 및 pH 4-8으로 조절된 조건에서 각각 배양하였으며, 그 결과는 Fig. 4에서 보는 바와 같이 32℃ 및 pH 6.5에서 가장 두꺼운 셀룰로오스를 생성하였다
. 대부분의 셀룰로오스 생성균주들은 28-30℃, pH 4-7에서 셀룰로오스 생 성능이 우수한 것으로 보고(Chawla 등, 2009)되어 있다. - 전배양은 50 ml의 기본배지가 함유된 250-ml 용량의 삼각 플라스크에 보존중인 균주를 한 백금이씩 접종하여 30℃에서 72시간 동안 정치배양하였다. 생성된 셀룰로오스 막 속에 존재하는 세포를 유리시키기 위하여 강하게 진탕한 후, 멸균된 거즈로 여과하였다. 유리된 세포가 함유된 여액 5%를 배지 50 ml가 함유된 100-ml 용량의 원통형 유리용기(표면적 =10.
- 셀룰로오스 생산을 위한 최적조건을 알아보기 위하여 각종 탄소원, 질소원, 무기염, 보조탄소원, 온도및 pH에 따른 셀룰로오스 생산량을 조사하였다. 또한 확립된 최적조건에서 실험균주를 배양하면서 24시간 간격으로 셀룰로오스의 생산량을 측정하였다.
- 실험균주에 의하여 생성된 셀룰로오스의 미세구조와 결정구조는 Son 등(2000)의 방법에 의하여 조사하였다. 즉, 셀룰로오스의 미세구조와 결정구조는 각각 주사전자현미경(JEOL JSM-6390, JEOL TECHNIC LTD., Japan)과 X-ray Diffractometer (Rigaku III, Rigaku Corp.,Japan)를 이용하여 분석하였다.
대상 데이터
- 44 mm로 가장 우수하였다. 따라서 F15 균주를 실험 균주로 선정하였다.
- 본 실험실에서 분리 및 동정되어 보존 중인 Acetobacter 속 균주(K2, K6, F5, F12, F15, V2, V7)들을 대상으로 셀룰로오스 생산성을 비교한 후, 생산성이 가장 높은 균주를 실험균주로 선정하였다. K2, K6 균주는 러시아 발효차인 콤퓨차(kombucha)에서, F5, F12, F15 균주는 썩은 과일에서, V2, V7 균주는 전통식초에서 분리한 균주들이다.
이론/모형
- 실험균주에 의하여 생성된 셀룰로오스의 미세구조와 결정구조는 Son 등(2000)의 방법에 의하여 조사하였다. 즉, 셀룰로오스의 미세구조와 결정구조는 각각 주사전자현미경(JEOL JSM-6390, JEOL TECHNIC LTD.
성능/효과
- 2에서 보는 바와 같다. Beef extract와 yeast extract는 3%에서 각각 5.09 mm, 4.05 mm의 셀룰로오스를 생성하였으며, 그 이상의 농도에서는 두께가 완만하게 감소하였다. Tryptone의경우, 농도에 비례하여 셀룰로오스의 두께가 증가하여 4%에서 4.
- Glucose, sorbitol 및 fructose의 순서로 두꺼운 셀룰로오스를 생성하였으며, lactose를 첨가했을 경우에는 셀룰로오스가 전혀 생성되지 않았다. 또한 셀룰로오스 생성에는 탄소원이 필수적임을 알 수 있었다. 최적 탄소원인 glucose의 농도에 따른 셀룰로오스 생성능을 조사한 결과, 7%에서 가장 두꺼운 셀룰로오스를 생성하였으며, 그 이상의 농도에서는 셀룰로오스 두께가 감소하였다(Fig.
- F15를 실험균주로 선정하여 셀룰로오스 두께를 증가시킬 수 있는 정치배양조건을 조사하였다. 세균 셀룰로오스 두께 증가를 위한 최적 배지조성은 glucose 7%, soytone 12%, K2HPO4 0.2%, NaH2PO4ㆍ2H2O 0.2%, lactic acid 0.05% 및 ethanol 0.3%이었다. 또한 초기 pH 6.
- 실험균주를 선정하기 위하여 기본배지에서 11일 동안 배양한 후, 각 균주들의 셀룰로오스 생산량을 비교한 결과는 Table 1에서 보는 바와 같이 썩은 과일에서 분리된 F15번 균주가 생성한 셀룰로오스의 두께가 5.44 mm로 가장 우수하였다. 따라서 F15 균주를 실험 균주로 선정하였다.
- 인산염의 종류와 농도가 셀룰로오스 생성능에 미치는 영향을 알아보기 위하여 기본배지에 포함되어 있던 Na2HPO4ㆍ12H2O를 포함한 4종의 인산염을 각각 1%씩 첨가하여 배양한 결과, K2HPO4 0.2%, NaH2PO4ㆍ2H2O 0.2%에서 가장 두꺼운 셀룰로오스를 생성하였다(미제시).
- 1%씩 첨가하여 배양한 결과는 Table 3에서 보는 바와 같다. 조사한 보조탄소원 중 acetic acid, lactic acid, maleic acid, succinic acid 및 n-butanol, methanol, ethanol을 첨가 했을 경우, 보조탄소원을 첨가하지 않은 대조군(6.35 mm)보다 두꺼운 셀룰로오스가 생성되었으며, 그 중 lactic acid와 ethanol이 효율적인 보조탄소원이었다. 그러나 citric acid, formic acid, fumaric acid, gluconic acid, 2-ketoglutaric acid 등의 보조탄소원은 대조군과 비교시 오히려 셀룰로오스 두께가 감소되었다.
- 3배 높은 것이었다. 주사전자현미경 관찰 결과, 생성된 셀룰로오스는 식물 셀룰로오스보다 더 조밀하며, 미세섬유로 구성된 망상구조임을 알 수 있었다.
- 6A 및 B는 트레이(19 cm × 26 cm) 를 이용하여 배양 및 생성된 셀룰로오스를 나타낸 것으로써, 흰 색의 두꺼운 막 형태임을 알 수 있다. 주사전자현미경을 이용하여 생성된 셀룰로오스 막의 미세 구조를 관찰한 결과, 셀룰로오스 섬유가 거미줄 형태로 서로 얽혀 있는 3차원 망상구조이며, 그 내부에 세포가 포획되어 있는 것이 관찰되었다(Fig. 6C). 이러한 망상구조로 인하여 세균 셀룰로오스는 식물 셀룰로오스보다 높은 신장강도와 영율(Young’s modulus) 을 가지는 것으로 보고되어 있다(Chawla 등, 2009).
- 또한 셀룰로오스 생성에는 탄소원이 필수적임을 알 수 있었다. 최적 탄소원인 glucose의 농도에 따른 셀룰로오스 생성능을 조사한 결과, 7%에서 가장 두꺼운 셀룰로오스를 생성하였으며, 그 이상의 농도에서는 셀룰로오스 두께가 감소하였다(Fig. 1). Cellulose 생성에 최적인 탄소원은 균주마다 다른 것으로 알려져 있다.
- 3). 한편, lactic acid와 두 번째로 셀룰로오스 생성능이 우수하였던 ethanol의 조합실험을 진행한 결과, lactic acid 0.05%, ethanol 0.3%에서 lactic acid 0.1%보다 두꺼운 셀룰로오스가 생성되었다(미제시). 본 연구결과는 acetic acid, lactic acid, succinic acid의 첨가는 셀룰로오스 생성량을 증가시키지만 그 외 다른 유기산들은 셀룰로오스 생성량을 증가시키지 않는다는 Chawla 등 (2009)의 보고와 비슷하였다.
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