은 나노입자 합성을 위한 Bacterial Cellulose 생산 세균의 분리 및 특성 Isolation and Characterization of Bacterial Cellulose-Producing Bacteria for Silver Nanoparticle Synthesis원문보기
환경친화적으로 항균성이 부여된 상처치료용 BC드레싱을 개발하기 위한 기초연구로서, 은 이온에 대해 내성이 있으면서 은 나노입자를 생합성할 수 있는 초산균을 분리 및 동정하였다. 나아가 실험균주에 의한 BC 생산 조건을 조사하였다. 부패된 포도껍질로부터 분리된 G7 균주는 0.1 mM $AgNO_3$ 존재 하에서 생육할 수 있었으며, 16S rRNA 유전자의 염기서열 분석에 의거하여 Acetobacter intermdius로 동정되었다. 탄소원으로 2% glucose, 질소원으로 2% yeast extract, 보조탄소원으로 0.115% acetic acid가 함유된 배지에서 BC 생산량이 최대였다. 최적배지에서 생성된 BC의 구조적 특성을 FT-IR 및 XRD를 사용하여 조사한 결과, 생성된 BC는 전형적인 천연 cellulose와 동일한 cellulose I인 것으로 확인되었다. G7 균주를 0.1 mM $AgNO_3$ 가 함유된 최적 배지에서 배양한 결과, 배양액의 색깔이 적갈색으로 변하였으며, 이것은 은 나노입자가 생성되었음을 의미한다. 은 나노입자의 합성유무를 UV-Vis 스펙트럼 분석에 의하여 확인한 바, 425 nm에서 은 나노입자의 고유한 흡수스펙트럼이 관찰되었다. 또한, 생성된 BC를 주사전자현미경으로 관찰한 결과, 표면과 기공에 은 나노입자가 생성되어 있음을 재확인하였다.
환경친화적으로 항균성이 부여된 상처치료용 BC 드레싱을 개발하기 위한 기초연구로서, 은 이온에 대해 내성이 있으면서 은 나노입자를 생합성할 수 있는 초산균을 분리 및 동정하였다. 나아가 실험균주에 의한 BC 생산 조건을 조사하였다. 부패된 포도껍질로부터 분리된 G7 균주는 0.1 mM $AgNO_3$ 존재 하에서 생육할 수 있었으며, 16S rRNA 유전자의 염기서열 분석에 의거하여 Acetobacter intermdius로 동정되었다. 탄소원으로 2% glucose, 질소원으로 2% yeast extract, 보조탄소원으로 0.115% acetic acid가 함유된 배지에서 BC 생산량이 최대였다. 최적배지에서 생성된 BC의 구조적 특성을 FT-IR 및 XRD를 사용하여 조사한 결과, 생성된 BC는 전형적인 천연 cellulose와 동일한 cellulose I인 것으로 확인되었다. G7 균주를 0.1 mM $AgNO_3$ 가 함유된 최적 배지에서 배양한 결과, 배양액의 색깔이 적갈색으로 변하였으며, 이것은 은 나노입자가 생성되었음을 의미한다. 은 나노입자의 합성유무를 UV-Vis 스펙트럼 분석에 의하여 확인한 바, 425 nm에서 은 나노입자의 고유한 흡수스펙트럼이 관찰되었다. 또한, 생성된 BC를 주사전자현미경으로 관찰한 결과, 표면과 기공에 은 나노입자가 생성되어 있음을 재확인하였다.
As a basic study for environment-friendly production of bacterial cellulose (BC) dressing with antimicrobial activity, we isolated and identified acetic acid bacteria which are resistant to silver ions and can biosynthesize silver nanoparticles. Furthermore, conditions of BC production by selected s...
As a basic study for environment-friendly production of bacterial cellulose (BC) dressing with antimicrobial activity, we isolated and identified acetic acid bacteria which are resistant to silver ions and can biosynthesize silver nanoparticles. Furthermore, conditions of BC production by selected strain were also investigated. Strain G7 isolated from decayed grape skin was able to grow in the presence of 0.1 mM $AgNO_3$ which was identified as Acetobacter intermedius based on 16S rRNA gene analysis. BC production was the highest in a medium containing 2% glucose as a carbon source, 2% yeast extract as a nitrogen source, and 0.115% acetic acid as a cosubstrate. Structural properties of BC produced in optimal medium were studied using Fourier-transform infrared spectroscopy and X-ray diffractometer, and it was found that BC produced was cellulose type I that was the same as a typical native cellulose. When strain G7 was cultured in an optimal medium containing 0.1 mM $AgNO_3$, the color of the culture broth turned into reddish brown, indicating that silver nanoparticles were formed. As a result of UV-Vis spectral analysis of the culture, it was found that a unique absorption spectrum of silver nanoparticles at 425 nm was also observed. Scanning electron microscopic observations showed that silver nanoparticles were formed on the surface and pores of BC membrane.
As a basic study for environment-friendly production of bacterial cellulose (BC) dressing with antimicrobial activity, we isolated and identified acetic acid bacteria which are resistant to silver ions and can biosynthesize silver nanoparticles. Furthermore, conditions of BC production by selected strain were also investigated. Strain G7 isolated from decayed grape skin was able to grow in the presence of 0.1 mM $AgNO_3$ which was identified as Acetobacter intermedius based on 16S rRNA gene analysis. BC production was the highest in a medium containing 2% glucose as a carbon source, 2% yeast extract as a nitrogen source, and 0.115% acetic acid as a cosubstrate. Structural properties of BC produced in optimal medium were studied using Fourier-transform infrared spectroscopy and X-ray diffractometer, and it was found that BC produced was cellulose type I that was the same as a typical native cellulose. When strain G7 was cultured in an optimal medium containing 0.1 mM $AgNO_3$, the color of the culture broth turned into reddish brown, indicating that silver nanoparticles were formed. As a result of UV-Vis spectral analysis of the culture, it was found that a unique absorption spectrum of silver nanoparticles at 425 nm was also observed. Scanning electron microscopic observations showed that silver nanoparticles were formed on the surface and pores of BC membrane.
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문제 정의
따라서 은 나노입자를 생합성할 수 있는 BC 생산균주를 확보할 수 있다면 보다 안전하게 2차 감염을 방지할 수 있는 상처 치료 BC 드레싱을 제조할 수 있을 것이다. 본 연구는 환경친화적으로 항균성이 부여된 상처치료용 BC 드레싱 개발을 최종목적으로 설계되었으며, 이에 따라 먼저 은 이온에 대해 내성이 있으면서 은 나노입자를 생합성할 수 있는 균주를 분리 및 동정한 후, 이 균주에 의한 BC 생산 최적조건 및 구조적 특성을 조사하였다.
현재 실험균주에 의한 은 나노입자 합성기전에 대한 실험을 수행 중에 있으며, 그 결과를 바탕으로 효율적인 상처 치료용 드레싱 개발을 위한 항균능 등 피부관련 생리활성을 확인하고자 한다.
환경친화적으로 항균성이 부여된 상처치료용 BC 드레싱을 개발하기 위한 기초연구로서, 은 이온에 대해 내성이 있으면서 은 나노입자를 생합성할 수 있는 초산균을 분리 및 동정하였다. 나아가 실험균주에 의한 BC 생산 조건을 조사하였다.
제안 방법
0.1 mM AgNO3가 함유된 최적 배지에 실험균주를 접종하여 배양하면서 배양시간 경과에 따른 은 나노입자 합성유무를 조사하였다. Fig.
0.1 mM의 AgNO3가 함유된 최적배지에 실험균주를 접종하여 배양하면서 배양액의 색깔변화를 관찰하였다. 7일동안 배양한 후, 배양액을 원심분리(9,200 ×g, 5분)하여 회수된 상등액의 은 나노입자 합성 유무를 조사하였다.
16S rRNA 유전자를 증폭하기 위하여 사용된 primers는 27F (5'-AGAGTTTGATCM TGGCTCAG-3') primer와 1492R (5'-TACGGY TACCTTGTTACGACTT-3') primer이었다. 16S rRNA 유전자의 염기서열을 결정한 후, GenBank DB의 유사균주들과 비교하였으며, Clustal X (version 1.81) program package를 이용하여 염기서열을 정렬한 후, neighbor-joining method에 의거하여 분리균주의 계통분류학적 위치를 확인하였다[15].
7일동안 배양한 후, 배양액을 원심분리(9,200 ×g, 5분)하여 회수된 상등액의 은 나노입자 합성 유무를 조사하였다.
BC 생산에 영향을 미치는 배지성분을 조사하기 위하여 탄소원, 질소원 및 보조탄소원에 따른 BC 생산량을 조사하였다. 전배양은 HS 평판배지에서 계대배양 후, 냉장보관 중인 실험균주를 한 백금이(one loop) 취하여 50 ml의 HS 배지에 접종하여 30℃에서 4일동안 정치배양하였다.
BC의 화학적 구조를 조사하기 위하여 FT-IR spectrophotometer (IRAffinity-1, Shimadzu Corp., USA)를 이용하여 400−4000 cm-1에서 측정하였다.
가정에서 전통적인 방법에 의하여 제조된 식초와 감, 사과, 감귤, 포도 등의 과일을 BC 생산균주를 분리하기 위한 시료로 사용하였다. 각 시료를 HS 배지에 접종하여 30℃에서 배양하면서 막(membrane) 형태의 BC 생성 유무를 관찰하였다. 생성된 BC를 생리식염수에 넣어 강하게 교반한 후, 현탁액을 HS 평판배지(0.
환경친화적으로 항균성이 부여된 상처치료용 BC 드레싱을 개발하기 위한 기초연구로서, 은 이온에 대해 내성이 있으면서 은 나노입자를 생합성할 수 있는 초산균을 분리 및 동정하였다. 나아가 실험균주에 의한 BC 생산 조건을 조사하였다. 부패된 포도껍질로부터 분리된 G7 균주는 0.
동결건조된 BC를 금으로 코팅한 후, 주사전자현미경(JEOL JSM-6390, JEOL TECHNIC Ltd., Japan)을 이용하여 3차원적 미세구조를 관찰하였다. BC의 화학적 구조를 조사하기 위하여 FT-IR spectrophotometer (IRAffinity-1, Shimadzu Corp.
이때, 은 나노입자 고유의 색깔 발현과 고유 흡수파장을 조사하여 은 나노입자의 합성을 확인하였다[10]. 또한, BC 막에 은 나노입자가 생성되었는지를 주사전사현미경을 통하여 관찰하였다.
분리균주를 동정하기 위하여 16S rRNA 유전자의 염기서열을 분석하였다. 16S rRNA 유전자를 증폭하기 위하여 사용된 primers는 27F (5'-AGAGTTTGATCM TGGCTCAG-3') primer와 1492R (5'-TACGGY TACCTTGTTACGACTT-3') primer이었다.
전배양은 HS 평판배지에서 계대배양 후, 냉장보관 중인 실험균주를 한 백금이(one loop) 취하여 50 ml의 HS 배지에 접종하여 30℃에서 4일동안 정치배양하였다. 생성된 BC로부터 세포를 유리시키기 위하여 5분간 강하게 진탕한 후, 멸균된 거즈로 여과하여 세균 현탁액을 조제하였다. 이 세균현탁액 5% (v/v)를 상기에서 보는 바와 같은 배양변수들이 각각 조절된 HS 배지 50 ml에 접종하여 30℃에서 7일간 정치배양하였다.
각 시료를 HS 배지에 접종하여 30℃에서 배양하면서 막(membrane) 형태의 BC 생성 유무를 관찰하였다. 생성된 BC를 생리식염수에 넣어 강하게 교반한 후, 현탁액을 HS 평판배지(0.0022% bromocresol green 함유)에 접종하여 배양하면서 배지의 색깔을 녹색에서 노란색으로 변화시키는 집락을 BC 생산균주로 선정하였다. 이 균주들을 대상으로 다양한 농도의 AgNO3가 함유된 HS 배지에 접종하여 배양함으로써 BC 생산이 가능한 AgNO3의 농도를 확인하였다.
0022% bromocresol green 함유)에 접종하여 배양하면서 배지의 색깔을 녹색에서 노란색으로 변화시키는 집락을 BC 생산균주로 선정하였다. 이 균주들을 대상으로 다양한 농도의 AgNO3가 함유된 HS 배지에 접종하여 배양함으로써 BC 생산이 가능한 AgNO3의 농도를 확인하였다. 실험에 사용된 HS 배지의 조성은 glucose 2%, yeast extract 0.
즉 BC를 40 kV, 30 mA 조건에서 Cu Kα radiation에 의한 반사식 측정법으로 2θ = 5°−40°, scan speed는 10°/min로 측정하였다.
5 NHCl을 이용하여 중성이 될 때까지 중화시켰다. 최종적으로 회수된 BC를 105℃에서 항량이 될 때까지 건조한 후, 데시케이터에서 방냉하여 건조중량을 측정하였다[17].
대상 데이터
16S rRNA 유전자를 증폭하기 위하여 사용된 primers는 27F (5'-AGAGTTTGATCM TGGCTCAG-3') primer와 1492R (5'-TACGGY TACCTTGTTACGACTT-3') primer이었다.
가정에서 전통적인 방법에 의하여 제조된 식초와 감, 사과, 감귤, 포도 등의 과일을 BC 생산균주를 분리하기 위한 시료로 사용하였다. 각 시료를 HS 배지에 접종하여 30℃에서 배양하면서 막(membrane) 형태의 BC 생성 유무를 관찰하였다.
전통식초, 사과, 감귤 및 포도 시료로부터 각각 23 균주, 11 균주, 7 균주 및 16 균주에 해당하는 BC 생산균을 분리하였다. 그 중 0.02 mM AgNO3가 함유된 HS 배지에서 BC를 생산하는 G7 균주를 최종 실험균주로 선정하였다. 이 균주는 부패된 포도껍질에서 분리되었다.
실험에 사용된 HS 배지의 조성은 glucose 2%, yeast extract 0.5%, polypeptone 0.5%, Na2HPO4· 12H2O 0.675% 및 citric acid monohydrate 0.115% (pH 6)이었다.
성능/효과
intermdius G7에 의해 생성된 환원제에 의해 발생했다는 것을 시사한다. 0.1 mM AgNO3가 함유된 HS 배지에서 생성된 BC 막은 표면과 기공에 은 나노입자가 잘 분산되어 형성됐음을 보여주는 반면(Fig. 6A), AgNO3가 함유되지 않은 배지에서 생성된 순수한 BC 막은 매끄럽고, 깨끗한 표면을 가진 수많은 nanofibrils로 이루어져 있음을 알 수 있었다(Fig. 6B).
질소원의 종류와 농도가 BC 생산에 미치는 영향을 조사한 결과, beef extract와 yeast extract를 질소원으로 사용하였을 때 BC 생산이 가장 좋았으며, 질소원의 첨가는 BC 생산에 필수적임을 알 수 있었다(Table 1). BC 생산에 최적인 beef extract와 yeast extract의 농도를 조사한 결과, 각각 1%와 2%로 나타났다(Fig. 3). 한편, Acetobacter xylinum을 이용한 BC 생산에 있어 다양한 질소원의 영향이 보고되었는데, casein hydrolyzate, peptone, yeast extract가 적합한 질소원임이 밝혀졌다[3].
탄소원의 종류와 농도가 BC 생산에 미치는 영향을 조사한 결과, glucose를 탄소원으로 사용하였을 때 BC 생산이 가장 우수하였다(Table 1). Glucose의 농도를 0%에서 3%까지 각각 달리하여 배양한 결과, 2%까지 탄소원의 농도 증가에 따라 BC 생산도 증가하였으며, 그 이상의 농도에서는 생산량이 일정하였다(Fig. 3). BC를 생산하는 초산균의 특성은 glucose로부터 BC 합성을 위한 전구체를 생성하는 uridine diphosphoglucose pyrophosphorylase 활성이 높다는 것이다[18].
보조탄소원의 첨가는 대사 구동력(metabolic driving force) 측면에서 BC 합성에 상당히 중요한 역할을 수행한다[3]. 따라서 각종 보조탄소원이 BC 생산에 미치는 영향을 조사한 결과, acetic acid, citric acid, lactic acid 및 ethanol을 첨가했을 때 우수한 BC 생산을 보여주었으며, 그 중 acetic acid에서 가장 높은 생산량을 나타내었다(Table 2). Acetic acid, lactic acid 및 ethanol은 초산균의 생육을 촉진하고, 동시에 BC 생산을 증가시킨다고 알려져 있다[19].
2). 따라서 실험균주를 A. intermdius G7로 명명하였다.
와 99%의 유전자간 상동성을 보였다. 또한 16S rRNA 유전자의 구조에 근거하여 유사균주들과의 계통학적 관련성을 조사하기 위하여 계통수를 작성한 결과, 실험균주는 A. intermdiusT와 동일한 계통학적 그룹에 속함을 알 수 있었다(Fig. 2). 따라서 실험균주를 A.
본 연구에서는 반응 혼합물의 SPR 밴드가 한 개 나타났으므로 구형의 은나노 입자가 합성되었음을 알 수 있었다. 또한 본 연구결과는 은 이온의 환원은 A. intermdius G7에 의해 생성된 환원제에 의해 발생했다는 것을 시사한다. 0.
은 나노입자의 합성유무를 UV-Vis 스펙트럼 분석에 의하여 확인한 바, 425 nm에서 은 나노입자의 고유한 흡수스펙트럼이 관찰되었다. 또한, 생성된 BC를 주사전자현미경으로 관찰한 결과, 표면과 기공에 은 나노입자가 생성되어 있음을 재확인하였다.
본 균주의 AgNO3 농도에 따른 BC 생산 유무를 조사한 결과, 0−0.1 mM AgNO3 범위에서 BC를 생산하였으나 AgNO3 농도 증가에 따라 BC생산량은 감소하였다.
Mie의 이론에 따르면, 구형 나노입자의 흡수 스펙트럼에서는 한 개의 SPR 밴드가 나타나지만 이방성 입자는 입자의 모양에 따라 둘 이상의 SPR 밴드를 발생시킬 수 있다[21]. 본 연구에서는 반응 혼합물의 SPR 밴드가 한 개 나타났으므로 구형의 은나노 입자가 합성되었음을 알 수 있었다. 또한 본 연구결과는 은 이온의 환원은 A.
나아가 실험균주에 의한 BC 생산 조건을 조사하였다. 부패된 포도껍질로부터 분리된 G7 균주는 0.1 mM AgNO3 존재 하에서 생육할 수 있었으며, 16S rRNA 유전자의 염기서열 분석에 의거하여 Acetobacter intermdius로 동정되었다. 탄소원으로 2% glucose, 질소원으로 2% yeast extract, 보조탄소원으로 0.
실험균주를 동정하기 위하여 16S rRNA 유전자의 염기서열을 분석한 결과, 본 균주는 Acetobacter intermdiusT와 99%의 유전자간 상동성을 보였다. 또한 16S rRNA 유전자의 구조에 근거하여 유사균주들과의 계통학적 관련성을 조사하기 위하여 계통수를 작성한 결과, 실험균주는 A.
전통식초, 사과, 감귤 및 포도 시료로부터 각각 23 균주, 11 균주, 7 균주 및 16 균주에 해당하는 BC 생산균을 분리하였다. 그 중 0.
따라서 glucose는 생육을 위한 에너지 생성에 이용되지 않고, 주로 BC 생산에 소비될 수 있다. 질소원의 종류와 농도가 BC 생산에 미치는 영향을 조사한 결과, beef extract와 yeast extract를 질소원으로 사용하였을 때 BC 생산이 가장 좋았으며, 질소원의 첨가는 BC 생산에 필수적임을 알 수 있었다(Table 1). BC 생산에 최적인 beef extract와 yeast extract의 농도를 조사한 결과, 각각 1%와 2%로 나타났다(Fig.
115% acetic acid가 함유된 배지에서 BC 생산량이 최대였다. 최적배지에서 생성된 BC의 구조적 특성을 FT-IR 및 XRD를 사용하여 조사한 결과, 생성된 BC는 전형적인 천연 cellulose와 동일한 cellulose I인 것으로 확인되었다. G7 균주를 0.
탄소원의 종류와 농도가 BC 생산에 미치는 영향을 조사한 결과, glucose를 탄소원으로 사용하였을 때 BC 생산이 가장 우수하였다(Table 1). Glucose의 농도를 0%에서 3%까지 각각 달리하여 배양한 결과, 2%까지 탄소원의 농도 증가에 따라 BC 생산도 증가하였으며, 그 이상의 농도에서는 생산량이 일정하였다(Fig.
후속연구
)용액에 BC를 침지시킨 후, 화학적으로 은 나노입자를 합성하는 방법이 보고되었으나 이 방법은 BC에 독성 용매가 잔류한다는 단점이 있다[14]. 따라서 은 나노입자를 생합성할 수 있는 BC 생산균주를 확보할 수 있다면 보다 안전하게 2차 감염을 방지할 수 있는 상처 치료 BC 드레싱을 제조할 수 있을 것이다. 본 연구는 환경친화적으로 항균성이 부여된 상처치료용 BC 드레싱 개발을 최종목적으로 설계되었으며, 이에 따라 먼저 은 이온에 대해 내성이 있으면서 은 나노입자를 생합성할 수 있는 균주를 분리 및 동정한 후, 이 균주에 의한 BC 생산 최적조건 및 구조적 특성을 조사하였다.
최근, 은 나노입자는 그 모재(parent material)와 달리 특이적으로 향상된 이 화학적 및 생물학적 성질을 가진다는 것이 밝혀졌고[7], 이에 따라 은 나노소재가 새롭게 주목받고 있다. 은 나노입자는 인체 무독성, 무자극성이며, 은 나노입자에 대한 내성균의 출현도 아직 보고된 바 없어 약제 내성균을 제거하는데 활용될 수 있을 것으로 기대된다[8]. 이러한 은 나노입자는 주로 화학적으로 합성되고 있는데, 독성이 높은 환원제와 안정제의 사용, 유해성 부산물의 배출 등 여러 가지 문제점을 가지고 있어[9] 다양한 분야로의 응용을 위해서는 무독성 물질을 이용한 환경친화적 합성법이 필요함을 알 수 있다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
세균 셀룰로오스는 무엇인가?
세균 셀룰로오스(bacterial cellulose, BC)는 미생물이 생산하는 다당류의 일종으로서, 나노 크기의 미세망상 구조, 높은 결정성, 강한 기계적 강도, 높은 수분 함량 및 우수한 생체적합성과 생분해성을 가지고 있다[1]. 또한, 식물성 셀룰로오스와 달리 BC는 리그닌, 헤미셀룰로오스, 펙틴과 같은 불순물을 함유하고 있지 않다[2].
세균 셀룰로오스는 어떤 특징을 가지고 있는가?
세균 셀룰로오스(bacterial cellulose, BC)는 미생물이 생산하는 다당류의 일종으로서, 나노 크기의 미세망상 구조, 높은 결정성, 강한 기계적 강도, 높은 수분 함량 및 우수한 생체적합성과 생분해성을 가지고 있다[1]. 또한, 식물성 셀룰로오스와 달리 BC는 리그닌, 헤미셀룰로오스, 펙틴과 같은 불순물을 함유하고 있지 않다[2].
세균 셀룰로오스는 식물성 셀룰로오스와는 어떤 차이를 보이는가?
세균 셀룰로오스(bacterial cellulose, BC)는 미생물이 생산하는 다당류의 일종으로서, 나노 크기의 미세망상 구조, 높은 결정성, 강한 기계적 강도, 높은 수분 함량 및 우수한 생체적합성과 생분해성을 가지고 있다[1]. 또한, 식물성 셀룰로오스와 달리 BC는 리그닌, 헤미셀룰로오스, 펙틴과 같은 불순물을 함유하고 있지 않다[2]. 이러한 독특한 특성 때문에 BC는 식품 산업, 하수 정화, 음향 및 광학, 의료 분야 등에서 활용 가능성이 높은 것으로 인정되고 있으며[3], 최근 상처치료 드레싱 재료, 인공 피부, 인공 혈관 등의 생체적합 분야에서 활발히 연구되고 있다[4].
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