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문제 정의
- 본 연구에서는 야관문 추출물의 elastase와 collagenase 저해 활성도를 평가하여 피부재생능력을 알아보고, 창상을 유발한 실험동물 모델에서 창상 치유 효과를 검증하여 창상 치료용 소재로의 개발 가능성을 평가하고자 한다.
제안 방법
- 이것을 37℃에서 30분간 반응시킨 후 25 mM citric acid 1 mL를 가하여 반응을 정지시키고 ethyl acetate 5 mL를 가하여 혼합한 후 320 nm에서 유기용매 층의 흡광도를 측정하였다. Collagenase 저해 활성도 대조군으로 BHA를 사용하였으며 동일한 방법으로 실험하여 흡광도를 측정하였다.
- 다시 25℃에서 20분간 배양한 다음 냉침으로 반응을 정지시키고 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. Elastase 저해 활성도 대조군으로 BHA(butylated hydroxy anisole)를 사용하였으며 동일한 방법으로 실험하여 흡광도를 측정하였다.
- , Tokyo, Japan)를 이용, 각 군별로 일정거리에서 촬영하여 상처의 변화를 육안으로 관찰하였다. 또한 객관적 지표로 나타내기 위하여 microcaliper(Mitutoyo Co., Tokyo, Japan) 제품으로 창상의 면적을 측정하였다.
- 상처 치료의 진행 과정을 관찰하기 위해 창상유발 후 7일 간격으로 digital camera(CAMEDIATM, Olympus Co., Tokyo, Japan)를 이용, 각 군별로 일정거리에서 촬영하여 상처의 변화를 육안으로 관찰하였다. 또한 객관적 지표로 나타내기 위하여 microcaliper(Mitutoyo Co.
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실험군 분류 및 창상실험
실험군은 Table 1과 같이 비처리군(Normal control; NO), 창상 후 용매(1% CMC) 도포군(Control; CO), 창상 후 후시딘 나트륨(DongWha Pham, Seoul, Korea)을 도포한 양성대조군(Positive control; PC), 창상 후 저농도의 야관문 1% 도포군(Lespedeza cuneata 1%; LCL), 창상 후 중간농도의 야관문 3% 도포군(Lespedeza cuneata 3%; LCM), 창상 후 고농도의 야관문 5% 도포군(Lespedeza cuneata 5%; LCH)으로 각각 5마리씩 총 6개의 실험군으로 나누어 실험하였다. 도포액은 가피가 탈각될 때까지 매일 1회씩 창상 입은 부위가 덮일 정도로 충분히 도포하여 외부 공기와의 접촉을 최소화하였다.
- 야관문 잎 추출물을 이용한 도포 연고로 만들기 위하여, 점성이 있으며 피부자극이 없는 1% carboxy methyl cellulose(CMC) 현탁액에 1, 3, 5% 농도로 제조하였다.
- 야관문 추출물의 피부재생능력을 알아보고, 창상을 유발한 실험동물 모델에서 창상 치유 효과를 검증하고자 6개 군(NO, CO, PC, LCL, LCM, LCH)으로 나누어 5주간 실험하였다. Elastase 저해 활성을 평가한 결과 LCM군에서 항산화제인 BHA보다 2.
- 실험동물은 체중 200∼300 g의 4주령 수컷 Sprague-Dawley(OrientBio, Tokyo, Japan)를 분양받아 온도 21±2℃, 상대습도 55±10%를 유지하고 밤과 낮의 길이를 12시간씩 인공조명으로 조절하여 사육하였으며, 사료와 물은 충분히 공급하였다. 일주일간 적응시킨 후 ether 마취하에 배(背)부의 털을 면도한 다음 요오드팅크를 사용하여 표피를 소독한 후 피혁용 펀치(biopsy punch; 8 mm)를 이용하여 좌우대칭의 원형 절제 창을 4개소 만들어 창상을 유발하였다.
- 창상유발 당일에서 창상유발 후 28일 경과시점까지 창상유발군에서 무작위 선택한 개체의 창상부분을 7일 간격으로 촬영하여 상처면적 변화를 관찰하였으며(Fig. 2), 창상부분의 크기를 7일 간격으로 microcaliper로 측정하여 나타내었다(Table 3). Fig.
- 60(250 μm 이하)을 통과한 것을 -20℃ 이하의 암소에 보관하면서 추출용 시료로 사용하였다. 추출조건은 시료 20 g에 대한 용매 비를 20 mL/g으로 하여 추출온도 80℃, 추출시간 6.6시간, 에탄올 농도 53%의 추출조건으로 실험을 수행하였다.
대상 데이터
- 실험동물은 체중 200∼300 g의 4주령 수컷 Sprague-Dawley(OrientBio, Tokyo, Japan)를 분양받아 온도 21±2℃, 상대습도 55±10%를 유지하고 밤과 낮의 길이를 12시간씩 인공조명으로 조절하여 사육하였으며, 사료와 물은 충분히 공급하였다.
- 야관문은 대구약령시에서 구입하여 본 실험에 사용하였으며, 시료는 분쇄기(J-NCM, Jisico, Seoul, Korea)로 분쇄한 후 표준체 No.60(250 μm 이하)을 통과한 것을 -20℃ 이하의 암소에 보관하면서 추출용 시료로 사용하였다.
데이터처리
- 모든 실험결과는 평균과 표준편차로 나타내었으며, 각 그룹 및 평균간 통계적 유의성은 SPSS 12.0(SPSS Inc, Chicago, IL, USA)을 이용하여 t-test로 분석하였다. 통계적 유의수준은 0.
이론/모형
- Collagenase 저해 활성은 Sawabe 등(14)의 방법에 준하여 측정하였다. 즉 희석한 시료에 collagenase(5 μg)와 PZ-peptide(4-phenylazobenzyloxycarbonyl-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg monohydrate)(0.
- James 등(13)의 방법에 따라 시료를 0.2 M Tris-HCl buffer(pH 8.0)로 희석배수에 따라 희석(10~1,000 μg/mL)하고 희석된 시료 20 μL에 buffer 200 μL를 가한 다음, 0.8 mM의 N-succinyl-(Ala)3-ρ-nitroanilide 20 μL를 가하였다.
성능/효과
- 3% 용량에서는 단일 항산화물질인 BHA보다 오히려 야관문의 collagenase 저해율이 약 7%(35.19±7.80 vs 37.68±2.91) 더 높은 활성을 나타내었으며 통계적으로도 유의하였다(Fig. 1).
- Elastase 저해 활성 측정 결과는 야관문 잎 추출액 1, 3 및 5% 농도에서 21.63%, 52.39% 및 65.10%로 나타났으며, 대조군으로 사용한 BHA의 1, 3 및 5% 농도에서는 28.12%, 53.88% 및 67.85%로 나타났다(Table 2). 야관문 추출액은 항산화제인 BHA와 비교하였을 때 3%와 5% 용량에서 2.
- Elastase 저해 활성을 평가한 결과 LCM군에서 항산화제인 BHA보다 2.7%(52.39±4.52 vs 53.88±1.85) 낮은 수치를 나타내었으며, collagenase 저해 활성을 평가한 결과 LCM군에서 BHA보다 7%(37.68±2.91 vs 35.19±7.80) 더 높은 활성을 나타내었다.
- 그러나 콜라겐 합성과 축적이 지나치면 비후성 반흔이 발생하게 되는데(24), 이러한 반흔 형성을 감소시키려는 많은 연구가 보고되고 있다(25-27). 본 연구에서는 상처유발 3주 경과 후 야관문 추출군은 PC군 왼쪽 반흔의 크기 10.44 mm보다 반흔 면적이 각각 34%, 33% 및 29% 줄어든 것으로 나타났으며 오른쪽은 각각 24%, 23% 및 17% 줄어든 것으로 나타났다. Sen 등(28)의 연구에서는 항산화제의 상처 치유 효과를 보고하고 있으며, 항산화제는 창상으로 인한 세포나 조직의 손상을 방어하여 피부재생을 돕는다고 할 수 있다.
- 야관문 추출액에 대한 collagenase 활성 저해 능을 측정한 결과는 야관문의 추출물 함량 정도에 따라 용량 비례적으로 높은 저해 활성을 나타내었다. 3% 용량에서는 단일 항산화물질인 BHA보다 오히려 야관문의 collagenase 저해율이 약 7%(35.
- 특히 창상유발 7일 경과 후 용매만 도포한 CO군에서 다른 군에 비하여 염증성 삼출액의 양이 많아 이물질이 상처에 많이 부착되었다. 이에 반해 fucidin 처리군(PC)과 야관문 추출물 도포군(LC)은 염증반응이 억제되어 딱지가 생기고 CO군에 비하여 현저히 상처반경이 감소하면서 회복되는 것을 확인할 수 있었다. 또한 과도한 창상구축은 반흔을 크게 형성하는 것으로 알려져 있는데(21) 본 실험에서도 창상유발 후 21일에서는 반흔의 모양을 관찰할 수 있었으며 CO군에 비하여 PC, LCM, LCH군에서 반흔의 반경이 크게 감소하였음을 관찰할 수 있었다.
- 또한 과도한 창상구축은 반흔을 크게 형성하는 것으로 알려져 있는데(21) 본 실험에서도 창상유발 후 21일에서는 반흔의 모양을 관찰할 수 있었으며 CO군에 비하여 PC, LCM, LCH군에서 반흔의 반경이 크게 감소하였음을 관찰할 수 있었다. 창상유발 후 28일에서 CO군에서 아직 아물지 않은 상처가 보이는 반면 나머지 실험군에서는 모두 반흔이 형성되었으며 정상표피의 형태로 구축되었고 정상조직과의 경계가 뚜렷하지 않았으며, 3% 야관문 도포군(LCM)에서는 특히 반경이 줄어들고 반흔의 넓이가 현저히 감소함을 볼 수 있었으며 체모 생성이 관찰되었다.
- 특히 창상유발 21일에 LCL군의 왼쪽 창상 면적이 1.25 mm, LCM군은 1.27 mm, LCH군은 1.40 mm로 CO군의 2.73 mm와 비교하여 54.2%, 53.5% 및 48.7%의 현저한 창상면적 감소를 보였다(Table 3).
후속연구
- 1% 낮은 수치를 나타내며 높은 elastase 저해 활성을 나타내었다. 이로서 야관문 추출물은 천연물로서는 창상피부의 회복을 돕는데 우수한 소재로 활용 가능할 것으로 사료된다.
- 본 연구에서도 항산화 활성 물질을 함유하고 있는 야관문 추출물이 창상 치유를 위한 증식기 과정에서 빠른 상피화를 보이며, 재형성기 과정에서 반흔의 면적을 줄이면서 피부재생을 돕는다고 할 수 있다. 추후 야관문의 약리작용기전에 대하여는 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각한다.
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