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문제 정의
- 이온도입의 침투 깊이에 대한 연구는 국소마취제를 적용하고 주사바늘을 찔러 마취 깊이를 측정하거나 (Wallace 등, 2001), 조직을 층 별로 적출하여 고속 액체 크로마토그래피를 사용하여 침투된 약물을 생화학적으로 검출하거나 (Singh와 Roberts, 1993; Mathy 등, 2005; Sintov와 Brandys-Sitton, 2006), 조직을 생검하여 방사성 동위원소를 표지한 약물을 검출하여 (Glass 등, 1980; Riviere 등, 1992; Costello와 Jeske, 1995) 침투 깊이를 추정하는 간접적인 방법을 이용하였다. 본 연구의 가장 큰 특징은 이온도입에 따른 물질의 조직 내 침투 깊이를 추정하지 않고 시각적으로 직접 정확하게 측정했다는 점이다.
- 이온도입의 효율에 대한 대부분의 선행 연구는 쥐나 돼지 또는 사람의 표피를 적출하여 시행하는 프란츠 세포 확산 모델 연구이다. 본 연구의 목적은 혈류와 체온이 유지되는 살아있는 생체를 대상으로 피부 침투 여부와 침투 깊이를 시각화하여 현미경 하에서 직접 측정하고 아울러 조직 투과량과 수송량을 정량적으로 측정하여 전류 강도에 따른 이온도입의 효과를 비교하여 효율적인 전류 강도와 전류밀도를 제시하는데 있다. 본 연구에서 이온도입의 전류 강도에 따른 침투 깊이와 투과량 및 수송량을 제시함으로써 향후 임상에서 치료 목적에 따른 이온도입의 용량 선택 근거로 활용할 수 있게 될 것이다.
제안 방법
- 본 실험에서 이온도입 직 후 피부를 적출하고 고정을 하지 않은 신선한 조직 절편을 제작하여 광학현미경으로 메틸렌 블루의 침투 깊이와 분포를 확인하고 비교할 수 있었다. 15분 동안 이온도입을 시행한 결과 메틸렌 블루가 표피를 가로질러 진피층까지 침투하였다. 털집과 피부기름샘이 진하게 보이는 결과는 털집과 피부기름샘을 통해 메틸렌 블루가 쉽게 통과했음을 보여주고 있다.
- 표피 각질층의 손상을 고려하여 실험 3일전 전기이발기를 사용하여 등과 허리의 털을 깍았다. 24마리의 흰쥐를 1 ㎃, 2 ㎃, 4 ㎃, 8 ㎃군에 6마리씩 무작위로 배정하여 생리식염수를 적신 부드러운 면패드(4 ㎝ x 4 ㎝)를 등에 댄 다음 전극을 고정하고 전기자극기의 음극에 연결하였으며, 5 cm 거리의 허리에 1% BM수용액을 적신 부드러운 면패드(3 ㎝ x 3 ㎝)를 댄 다음 전극을 고정하고 전기자극기의 양극에 연결하였다. 1% BM수용액은 600 μl를 사용하였다.
- 이온도입에 따른 약물의 조직 침투량에 대한 연구는 피부를 적출하여 프란츠세포 모델에서 이온도입을 시행하고 용매에 확산된 약물의 양을 측정하는 in vitro실험이 주종을 이루고 있다 (Siddoju 등, 2011; Cázares-Delgadillo 등, 2010; Xu 등, 2009; Vemulapalli 등, 2008). 기존의 연구와 달리 본 연구는 in vivo에서 쥐의 피부에 직접 이온도입을 시행하고 피부를 적출하여 침투량과 단위면적 당 수송량을 측정했다.
- 동물사육실의 온도는 23±1℃, 상대습도 50±2%를 유지하였으며, 명암주기는 12시간 간격으로 하였다.
- 본 실험에서 이온도입 직 후 피부를 적출하고 고정을 하지 않은 신선한 조직 절편을 제작하여 광학현미경으로 메틸렌 블루의 침투 깊이와 분포를 확인하고 비교할 수 있었다. 15분 동안 이온도입을 시행한 결과 메틸렌 블루가 표피를 가로질러 진피층까지 침투하였다.
- 이온도입 직후 흰쥐를 희생시킨 후 알코올과 증류수를 사용하여 피부 표면에 잔류한 BM용액을 최대한 제거한다음 피부전층을 적출하고 0.4 ㎝ x 0.4 ㎝의 피부조직을 OCT compound(Tissue Tek, Sakura Finetechnical Co., Ltd., Tokyo, Japan)와 동결분무액(Lip Freeze, L.I.P. Ltd., West Yorkshire, UK)을 사용하여 금속 원판위에 포매한 다음 즉시 냉동박절기(Shandon, Thermo Electron Corporation, Waltham, USA)를 사용하여 -20℃에서 7 ㎛ 두께의 절편을 제작하였다. 절편을 광학현미경에 부착된 Olympus DP-72디지털카메라(Olympus Optical Co.
- , West Yorkshire, UK)을 사용하여 금속 원판위에 포매한 다음 즉시 냉동박절기(Shandon, Thermo Electron Corporation, Waltham, USA)를 사용하여 -20℃에서 7 ㎛ 두께의 절편을 제작하였다. 절편을 광학현미경에 부착된 Olympus DP-72디지털카메라(Olympus Optical Co., Tokyo, Japan)로 100배하에서 이미지를 촬영하고 Image-Pro Plus ver. 4.5 프로그램(Media Cybernetics Inc., Georgia, USA)을 사용하여 침투 깊이를 측정하였다.
- 7 ml Eppendorf 튜브에 넣고 37℃에서 12시간 동안 반응시킨 후 원심분리기 (Fisher Scientific, Rochester, NY, USA)를 사용하여 상온에서 13,000 g로 20분 간 원심분리하여 상청액을 취했다. 정상 피부의 상청액과 1% MB수용액 10 ㎕ (0.1 ㎎)을 이용하여 600 ㎚에서 분광광도계(Spectronic 20+, Spectronic Instruments, USA)를 보정하고 표준검정곡선을 그린 후각 검체의 흡광도를 측정하여 조직에 침투된 메틸렌 블루의 총량을 검출한 후 조직 1 g 당 메틸렌 블루의 양과 피부 1 ㎠당 메틸렌 블루의 수송량을 산출하였다.
- 조직 내 메틸렌 블루의 침투량과 경피 수송량은 Lilge 등(1997)의 방법을 변형하여 측정하였다. 적출한 피부중 0.
- 1% BM수용액은 600 μl를 사용하였다. 직류전류가 발생하는 전기자극기(Endomed 982, Enraf-Nonius B.V. Vareseweg 127, 3047 AT Rotterdam, Netherlands)를 사용하여 각각1 ㎃(0.11 ㎃/㎠), 2 ㎃(0.22 ㎃/㎠), 4 ㎃(0.44 ㎃/㎠), 8㎃(0.89 ㎃/㎠)의 강도로 15분 간 이온도입을 시행하였다.
- 표피 각질층의 손상을 고려하여 실험 3일전 전기이발기를 사용하여 등과 허리의 털을 깍았다. 24마리의 흰쥐를 1 ㎃, 2 ㎃, 4 ㎃, 8 ㎃군에 6마리씩 무작위로 배정하여 생리식염수를 적신 부드러운 면패드(4 ㎝ x 4 ㎝)를 등에 댄 다음 전극을 고정하고 전기자극기의 음극에 연결하였으며, 5 cm 거리의 허리에 1% BM수용액을 적신 부드러운 면패드(3 ㎝ x 3 ㎝)를 댄 다음 전극을 고정하고 전기자극기의 양극에 연결하였다.
대상 데이터
- 1% 메틸렌 블루(MB) 수용액은 메틸렌 블루(methylene blue, MW. 319.85, Junsei Chemical Co., Ltd., Tokyo, Japan) 와 초순수제조장치(Balmann Tech. Seoul, Korea)를 사용하여 제조한 3차 증류수를 사용하여 제조하였으며, 용매는 무수 에탄올(Sigma Chemical Co., St. Louis, USA)과 0.1 N 수산화 나트륨(sodium hydroxide, Sigma Chemical Co., St. Louis, USA)을 1:1로 혼합하여 제조하였다.
- 실험동물은 실험동물 관리 및 이용에 관한 지침에 따라 관리하였다. 실험기간 동안 고형사료(KOATECH, Pyungtaek, Korea)와 물을 자유롭게 공급하면서 사육하였다. 동물사육실의 온도는 23±1℃, 상대습도 50±2%를 유지하였으며, 명암주기는 12시간 간격으로 하였다.
- 실험에 사용한 동물은 생후 8주령(270±2.3 g)의 특정 병원균 부재 Sprague-Dawley계 수컷 흰쥐를 KOATECH(Pyungtaek, Korea)으로부터 구입하여 사용하였다.
데이터처리
- 각 군당 24 표본에서 얻은 침투깊이, 조직 내 침투량, 경피 수송량의 평균과 표준편차를 구하고 군 간 차이를 비교하기 위하여 일원분산분석을 하였으며 Bonferroni교정으로 사후검정하였다. 통계적 유의수준은 p<.
성능/효과
- 15분간 메틸렌 블루 이온도입을 시행한 결과 1 ㎃군에서는 평균 20.94 ㎛ 두께의 표피를 가로질러 91 ㎛까지 침투하였으나 부분적으로 침투하였고 색이 옅었으며, 2 ㎃, 4 ㎃ 및 8 ㎃군은 각각 표피를 가로질러 288 ㎛, 320㎛ 및 293 ㎛까지 진피층에 깊이 침투하였으며(Fig 1B), 전류강도에 따른 메틸렌 블루의 침투깊이를 일원분산 분석한 결과 군간 통계적으로 유의한 차이를 보였다 (F=8.97, df=3, p<.001)(Table 1).
- 3 ㎝ x 3 ㎝ (9 ㎠) 크기의 전극을 사용하여 15분간 이온도입을 시행한 본 연구에서 2 ㎃, 4 ㎃, 8 ㎃ 간 침투 깊이와 조직 내 침투량 및 경피 수송량이 유의한 차이가 없었다. 그러나 8 ㎃의 강도를 사용할 경우 이온도입의 효율이 높지만 전류밀도가 0.
- 5 ㎃/㎠ 이하를 권고하고 있다. 따라서 약 320 Da의 약물을 사용하여 효율적이고 피부 손상의 위험이 없이 안전하게 이온도입을 적용하기 위해서는 3 ㎝ x 3 ㎝ (9 ㎠) 크기의 전극을 사용할 경우 4 ㎃ 이하의 전류강도를 선택하여 이온도입을 적용하는 것이 적합하다고 사료된다.
- 11 ㎃/㎠에 지나지 않아 피부 손상의 위험이 낮지만 이온도입의 효율도 낮다. 따라서 이온도입의 효율을 높이고, 피부 손상의 위험이 없이 안전하게 이온도입을 적용하기 위해서는4 ㎃ 이하의 전류강도를 선택하여 전류밀도를 0.5 ㎃/㎠이하로 사용하는 것이 적합하다고 사료된다.
- 실험에서 메틸렌 블루를 사용한 이유는 침투 깊이와 분포를 광학현미경 하에서 시각적으로 직접 확인할 수 있기 때문이었다. 본 연구에서 2 ㎃, 4 ㎃, 8 ㎃의 이온도입이 91.10 ㎛ 깊이까지 침투한 1 ㎃ 보다 각각 3.05배, 3.52배, 3.22배 더 깊이 침투하였으며, 1 ㎃에서 4 ㎃까지는 전류 강도가 증가함에 따라 침투 깊이가 증가하였다. 높은 전류 강도에서는 이온 상호 현상과 역 침투 현상이 나타나기 때문에 일반적으로 이온도입에서는5 ㎃ 이하의 전류 강도를 권고하고 있다 (Costello와 Jeske, 1995).
- 본 연구에서 흰쥐 피부에 분자량 319.85 Da의 메틸렌 블루를 15분 간 이온도입한 결과 메틸렌 블루가 표피 장벽을 가로 질러 진피층 320 ㎛까지 침투되었음을 시각적으로 확인하였으며, 침투 깊이와 조직 내 침투량 및 피부 단위면적 당 수송량은 2 ㎃ (0.22 ㎃/㎠), 4 ㎃ (0.44 ㎃/㎠), 8 ㎃ (0.89 ㎃/㎠) 간 차이가 없었으나 4㎃에서 침투 깊이와 조직 내 침투량 및 수송량이 가장 많은 경향을 보였다. 전류밀도는 전류강도와 전극크기에 따라 결정되고, 피부 안전성에 매우 중요한 요소이며 이온도입 적용 시 0.
- 비색분석으로 측정한 메틸렌 블루의 침투량도 조직1 g 당 0.18 mg이 침투된 1 ㎃보다 2 ㎃, 4 ㎃, 8 ㎃의 이온도입이 각각 2.56배, 3.56배, 3.11배 더 많이 침투하였으며, 4 ㎃까지는 전류 강도가 증가함에 따라 침투량이 증가하였고 2 ㎃와 8 ㎃사이에는 차이가 없었으며 4 ㎃에서 침투량이 가장 많은 경향을 보였다. 단위면적당 수송량도 39.
- 이를 사후검정한 결과2 ㎃, 4 ㎃ 및 8 ㎃ 이온도입군이 1 ㎃보다 경피 수송량이 유의하게 많았으며(p<.05), 2 ㎃와 4 ㎃ 및 8 ㎃ 이온도입군 간에는 통계적으로 유의한 차이가 없었다 (Fig 3).
- 이를 사후검정한 결과2 ㎃, 4 ㎃ 및 8 ㎃ 이온도입군이 1 ㎃보다 침투깊이가 유의하게 깊었으며(p<.05), 2 ㎃와 4 ㎃ 및 8 ㎃ 이온도입군 간에는 통계적으로 유의한 차이가 없었다(Fig 1C).
- 전류강도에 따른 메틸렌 블루의 경피 수송량을 일원분산분석한 결과 군간 통계적으로 유의한 차이를 보였다 (F=16.69, df=3, p<.001)(Table 1).
- 전류강도에 따른 메틸렌 블루의 조직 내 침투량을 일원분산분석한 결과 군간 통계적으로 유의한 차이를 보였다(F=11.52, df=3, p<.001)(Table 1), 이를 사후검정한 결과 2 ㎃, 4 ㎃ 및 8 ㎃ 이온도입군이 1 ㎃보다 침투량이 유의하게 많았으며(p<.05), 2 ㎃와 4 ㎃ 및 8 ㎃ 이온도입군 간에는 통계적으로 유의한 차이가 없었다(Fig 2).
후속연구
- Lee와 Choi (2011)의 연구에서 시간에 따른 이온도입의 효율을 제시한바 있다. 따라서 이미 개발된 기존 의약품 제형을 표적조직의 깊이에 따라 전류 강도와 시간을 고려하여 다양한 질환에 활용하기를 기대한다.
- 본 연구의 목적은 혈류와 체온이 유지되는 살아있는 생체를 대상으로 피부 침투 여부와 침투 깊이를 시각화하여 현미경 하에서 직접 측정하고 아울러 조직 투과량과 수송량을 정량적으로 측정하여 전류 강도에 따른 이온도입의 효과를 비교하여 효율적인 전류 강도와 전류밀도를 제시하는데 있다. 본 연구에서 이온도입의 전류 강도에 따른 침투 깊이와 투과량 및 수송량을 제시함으로써 향후 임상에서 치료 목적에 따른 이온도입의 용량 선택 근거로 활용할 수 있게 될 것이다.
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