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문제 정의
- P5를 분리하여 그 특성에 대하여 조사한 후, 이 균주의 케라틴 처리제제 및 생물비료 제제로서의 가능성을 보고하였다(Jeong 등, 2010). 따라서 본 연구에서는 이 균주가 생성한 케라틴 분해효소의 물리화학적 특성과 기질 특이성을 검토함으로써 실제 효소 적용에 필요한 기초자료를 획득하고자 하였다.
제안 방법
- 사람의 손발톱은 분쇄기로 파쇄하여 사용하였다. 0.1M Tris-HCl 완충액(pH 9)에 각 기질 0.1% 및 10 U/ml의 효소액 1 ml를 첨가하여 30℃, 200 rpm에서 6시간동안 반응시킨 후, 각 케라틴의 분해율을 측정하였다.
- 5% trichloroacetic acid를 첨가하여 효소 활성을 정지시킨 후, 10000×g, 20℃에서 30분간 원심분리하였다. 280 nm에서 상등액의 흡광도를 측정하여 효소 활성을 측정하였다. 케라틴 분해효소의 활성 1 unit는 시간당 0.
- 따라서 본 연구에서는 콩의 근권토양에서 분리된 Xanthomonas sp. P5가 생산한 케라틴 분해효소의 특성을 조사하였다. 본 균주에 의한 케라틴 분해효소의 생산은 시간 경과에 따라 증가하여 배양 3일 경, 최대 10.
- 실험균주의 생육도는 배양액 내에 잔존하는 미분해 우모 케라틴을 Whatman no.1 여과지를 이용하여 제거한 후, 여액의 흡광도를 660 nm에서 측정함으로써 확인하였다. 배양액의 단백질 농도는 Bradford법(Bradford, 1976)을 이용하여 측정하였으며, 표준물질로는 bovine serum albumin을 사용하였다.
- P5이었다(Jeong 등, 2010). 케라틴 분해효소 생산에 이용된 배지의 조성은 K2HPO4 0.03%, KH2PO4 0.04%, yeast extract 0.01% (pH 7)이었으며, 탄소원 및 질소원으로 우모 케라틴(feather keratin)을 0.1% 첨가하였다 (Jeong 등, 2010). 영양배지(nutrient broth)를 이용하여 30℃, 200 rpm에서 24 시간동안 배양된 전배양액 2% (v/v)를 50 ml의 생산배지가 함유된 250-ml 용량의 삼각플라스크에 접종한 후, 전배양과 동일한 조건에서 배양하였다.
- 배양액을 4℃, 10000×g에서 원심분리하여 세포를 제거한 후, 여액을 물리화학적 특성 조사를 위한 조효소액으로 사용하였다. 케라틴 분해효소의 최적 활성 pH는 pH 3-11의 0.1M 완충액을 이용하여 조사하였다. 이때 사용된 완충액은 pH 3-6 (sodium acetate 및 sodium citrate), pH 6-8 (potassium phosphate), pH 7-9 (Tris -HCl), pH 9-11 (glycine-NaOH, sodium bicarbonate -NaOH)이었다.
- 이때 사용된 완충액은 pH 3-6 (sodium acetate 및 sodium citrate), pH 6-8 (potassium phosphate), pH 7-9 (Tris -HCl), pH 9-11 (glycine-NaOH, sodium bicarbonate -NaOH)이었다. 케라틴 분해효소의 최적 활성 온도는 20℃-70℃에서 조사하였다. pH 안정성을 조사하기 위해 pH 3-11의 완충액에 효소를 첨가하여 30℃에서 1시간 동안 반응시켰다.
대상 데이터
- 배양액을 4℃, 10000×g에서 원심분리하여 세포를 제거한 후, 여액을 물리화학적 특성 조사를 위한 조효소액으로 사용하였다.
- 실험균주가 생성한 케라틴 분해효소의 기질특이성을 조사하기 위하여 케라틴으로 구성되어있는 닭우모, 오리우모, 사람의 손발톱과 모발을 분해기질로 선정하였다. 사람의 손발톱은 분쇄기로 파쇄하여 사용하였다.
데이터처리
- 케라틴의 분해율은 케라틴의 건조무게 감소량을 측정한 후, 백분율(%)로 나타내었다. 다른 언급이 없는 한, 모든 실험은 세 번 반복하였으며, 결과는 평균값으로 표시하였다.
이론/모형
- 1 여과지를 이용하여 제거한 후, 여액의 흡광도를 660 nm에서 측정함으로써 확인하였다. 배양액의 단백질 농도는 Bradford법(Bradford, 1976)을 이용하여 측정하였으며, 표준물질로는 bovine serum albumin을 사용하였다. 케라틴의 분해율은 케라틴의 건조무게 감소량을 측정한 후, 백분율(%)로 나타내었다.
성능/효과
- 8%-100%의 활성을 나타내었으며, 그중 pH 9에서 최대 활성을 나타내었다. pH 3에서는 활성을 나타내지 않았으며, pH 4-6.5의 산성 영역 에서는 7.4%-34.3%의 낮은 활성을 나타낸 반면 pH 10-11의 강알칼리성 영역에서는 최소 55.2%-68.8%의 높은 활성을 나타내었다. 지금까지 보고된 대부분의 미생물유래 케라틴 분해효소는 pH 7.
- 1에서 보는 바와 같다. 균체 생육도는 배양 4일까지 시간에 비례하여 증가하다가 정지기에 도달하였으며, 케라틴 분해효소의 활성과 가용성 단백질의 농도는 배양 3일까지 서로 비례하여 지속적으로 증가하였다. 배양 3일 경, 케라틴 분해효소의 활성은 10.
- 6%-100%의 활성이 유지되었다. 또한 pH 6-10에서 1시간 동안 처리시, 최대 89.2%-100%의 활성이 유지되었고, pH 11에서도 최대 71.6%의 활성이 유지되었다. P5 균주는 사람의 모발은 분해하지 못하였지만 오리 및 닭의 우모는 충분히 분해할 수 있었다.
- 2에서 보는 바와 같이 전형적인 종 모양의 온도곡선을 나타내었다. 본 효소는 35℃-50℃ 범위에서 77.1%-100%의 활성을 나타내었으며, 그중 40℃-45℃에서 최대 활성을 나타내었다. 또한 50℃ 및 60℃에서도 여전히 62% 및 31.
- 5에서 보는 바와 같다. 본 효소는 pH 6-10에서 1시간 동안 처리시에도 최대 89.2%-100%의 활성이 유지되었으며, pH 11에서도 최대 71.6%의 활성이 유지되었다. 일반적으로 미생물 케라틴 분해효소는 pH 5-11에서 안정한 것으로 알려져 있어 본 연구결과와 비슷하였다(Gupta와 Ramnani, 2006).
- 3에서 보는 바와 같다. 본 효소는 pH 7-11에서 58.8%-100%의 활성을 나타내었으며, 그중 pH 9에서 최대 활성을 나타내었다. pH 3에서는 활성을 나타내지 않았으며, pH 4-6.
- 6에서 보는 바와 같다. 본 효소는 닭우모, 오리우모 및 사람의 손발톱을 각각 43.6%, 55.4% 및 24.3% 분해하였으나 사람의 모발은 거의 분해할 수 없었다. 닭 우모를 케라틴 분해효소 생성세균으로 처리했을 경우, 우모 분해산물의 영양적 가치와 소화율은 화학적 처리를 거친 분해산물보다 우수한 것으로 보고되어있다(Brandelli, 2008).
- pactum DSM40530이 생성한 케라틴 분해효소는 pH 4에서도 안정한데, 이것은 지금까지 알려진 가장 낮은 pH에서 안정한 케라틴 분해 효소이다(Bockle 등, 1995). 한편, 산성 영역에서는 사용 완충액의 종류에 따라 활성의 변화가 컸는데 완충액에 함유되어 있는 성분이 효소 활성에 영향을 미친 것으로 판단되었으며, 효소의 보존시 완충액의 선정도 중요한 인자임을 알 수 있었다.
후속연구
- 따라서 Xanthomonas sp. P5가 생성한 케라틴 분해효소는 우모의 현장 분해나 우모 분해산물의 영양성분을 개선하는데 활용 가능성이 있을 것으로 판단된다.
- 닭 우모를 케라틴 분해효소 생성세균으로 처리했을 경우, 우모 분해산물의 영양적 가치와 소화율은 화학적 처리를 거친 분해산물보다 우수한 것으로 보고되어있다(Brandelli, 2008). 따라서 실험 균주가 생성한 케라틴 분해효소는 우모 분해물의 영양적 가치 개선뿐만 아니라 다른 케라틴 폐기물의 처리에도 활용 가능성이 있을 것으로 판단된다.
- 실제 조효소 상태의 제품이 대량의 단백질을 처리하기 위한 효소 제제로 시판되고 있다. 또한 케라틴 분해효소의 특성은 균주 특이적이므로 각 균주가 생성한 효소의 물리화학적 특성을 조사하는 것은 효율적인 효소 적용을 위해서 반드시 선행되어야 할 연구이다.
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