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문제 정의
- , 2005). 따라서 본 연구는 복숭아혹진딧물의 주요 양채류 재배 지역별 살충제 저항성 수준을 조사하고 우수 약제를 선발하여 저항성 관리 체계의 기초 자료로 제공하고자 수행되었으며, 또한 생물검정을 대체 할 수 있는 저항성 마커를 개발하여 야외 개체군 저항성 관리에 활용하고자 수행되었다.
- 본 연구는 농촌진흥청 어젠다 연구과제(PJ006630, PJ906982) 를 수행하는 과정에서 얻은 결과를 바탕으로 작성 되었다.
제안 방법
- PCR 산물은 전기영동으로 확인 후 Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up kit (Promega, Madison, WI, USA)을 이용하여 정제, 농축하였다.
- 2 mM), ExTaq (TaKaRa, Shiga, Japan)을 넣고 total volume을 20 µl로 맞추어 PCR을 수행하였다. PCR조건은 94℃ 4분간 변성과정을 거쳐94℃ 20초, 55℃ 20초, 72℃ 30초로 35회 반복하여 증폭하였고 마지막에 72℃에서 5분간 처리하였다. 사용된 프라이머는 Table 2와 같다.
- 각 개체군별 복숭아혹진딧물 무시충 성충을 20 mg 정도 분량씩 모은 다음 DNAzol (MRC, Cincinnati, OH, USA) 400 µl를 넣고 조직분쇄기를 이용하여 균질화 하였다.
- 각 개체군별 복숭아혹진딧물 무시충 성충을 500 mg 정도 분량씩 모은 다음 0.1% Triton X-100가 포함된 0.1 M Tris-HCl pH 7.8 완충용액 500 µl를 넣고 얼음에서 조직분쇄기를 이용하여 균질화 한 후 약 10,000 g로 4℃에서 20분간 원심분리 하였다.
- 5 cm 디쉬에 넣은 후 성충 10 마리씩 접종 후 48시간 후 사충수를 조사하였다. 모든 실험은 농도별 3반복으로 수행 하였으며 사충률을 계산하여 저항성 정도를 비교하였다.
- 복숭아혹진딧물 약제 저항성에 관여하는 것으로 알려진 유전자의 돌연변이 유무를 확인하기 위하여 개체군 및 계통별 전체 DNA를 추출하였다. 각 개체군별 복숭아혹진딧물 무시충 성충을 20 mg 정도 분량씩 모은 다음 DNAzol (MRC, Cincinnati, OH, USA) 400 µl를 넣고 조직분쇄기를 이용하여 균질화 하였다.
- 복합저항성 계통은 5개의 야외 지역 채집 개체군 내에서 100 마리씩을 모아서 하나의 사육 상자에 넣은 후 1주일 후 선발을 시작 하였다. 사용된 살충제 계통별 저항성 정도가 높은 메소밀(카바메이트계), 비펜스린(페레스로이드계), 이미다클로프리드(네오니코티노이드계)와 페메트로진, 플로니카미드를 각각 LC20 값에 준하여 6개월 간 한달 간격으로 총6회 도태하여 복합저항성 계통(multiple resistance strain - MR)을 만들어서 저항성 기작 연구에 중점적으로 사용하다.
- 복합저항성 계통은 5개의 야외 지역 채집 개체군 내에서 100 마리씩을 모아서 하나의 사육 상자에 넣은 후 1주일 후 선발을 시작 하였다. 사용된 살충제 계통별 저항성 정도가 높은 메소밀(카바메이트계), 비펜스린(페레스로이드계), 이미다클로프리드(네오니코티노이드계)와 페메트로진, 플로니카미드를 각각 LC20 값에 준하여 6개월 간 한달 간격으로 총6회 도태하여 복합저항성 계통(multiple resistance strain - MR)을 만들어서 저항성 기작 연구에 중점적으로 사용하다. 도태 계통을 고정 한 후 한 달에 1회 도태를 지속하면서 저항성 계통을 유지하였다.
- 2009년 기준 한국작물보호협회에 등록된 살충제 21가지(배추 기준) 중 단일 제제로 구성된 10개의 약제를 선발하고 시중에서 판매하고 있는 약제를 구입하여 시험에 사용하였다(Table 1). 시험 방법은 잎침지법을 사용하였으며, 추천농도로 희석된 살충제에 5 cm로 자른 배추잎을 30초간 침지 후 음건하여 여과지가 깔린5.5 cm 디쉬에 넣은 후 성충 10 마리씩 접종 후 48시간 후 사충수를 조사하였다. 모든 실험은 농도별 3반복으로 수행 하였으며 사충률을 계산하여 저항성 정도를 비교하였다.
- 각 개체군별 복숭아혹진딧물 무시충 성충을 20 mg 정도 분량씩 모은 다음 DNAzol (MRC, Cincinnati, OH, USA) 400 µl를 넣고 조직분쇄기를 이용하여 균질화 하였다. 이후 과정은 MRC사에서 제공하는 방법에 따라 DNA를 추출하였다. 추출된 DNA는 20 µl 기준 PCR 수행 시 50 ng 정도를 넣었다.
- 실험 방법은 kit에서 제공하는 방법을 따랐다. 정제, 농축된 PCR산물의 염기서열을 분석하였다(NICEM sequencing facility, Seoul National University, Seoul, Korea). 염기서열 분석 결과는 Lasergene software (DNASTAR, Madison, WI, USA)를 이용하여 Clustral V방법으로 정렬하고 분석하였다.
- 주형DNA 1 µl, 0.5 pM 프라이머1 µl씩, 10 X PCR 완충용액, dNTP (각각 최종 농도가 0.2 mM), ExTaq (TaKaRa, Shiga, Japan)을 넣고 total volume을 20 µl로 맞추어 PCR을 수행하였다.
- , 1996), 정량화가 어려워 본 연구에서는 특정 살충제에 대한 저항성 마커로 활용하기는 어려웠다. 추가 연구로 다양한 살충제에 대하여 저항성을 보이는 MR에서 특이적으로 발현되는 유전자를 찾고자 suppression subtractive hybridization 방법으로 cDNA library를 만들어 분석한 결과 cDNA library 중 480개를 분석하여 213,867 bp의 염기서열을 읽었다. 유효한 결과를 얻은 것은 154개로 에스터레이즈 등 잘 알려진 살충제 저항성 관여 유전자뿐만 아니라 ABC transporter 등의 유전자도 검출하였으나, cDNA library 내 검출 비율을 기준으로 평가 하였을 때, 발현량의 차이가 매우 낮은 것으로 판단되었다(미보고자료).
- 추출된 단백질 시료(10 µg)를 비변성전기영동과 등점전전기영동으로 단백질 분리를 실시하였다.
대상 데이터
- 2009년 기준 한국작물보호협회에 등록된 살충제 21가지(배추 기준) 중 단일 제제로 구성된 10개의 약제를 선발하고 시중에서 판매하고 있는 약제를 구입하여 시험에 사용하였다(Table 1). 시험 방법은 잎침지법을 사용하였으며, 추천농도로 희석된 살충제에 5 cm로 자른 배추잎을 30초간 침지 후 음건하여 여과지가 깔린5.
- 2% fast blue RR salt 용액에 밴드가 보일 때까지 반응시킨 후 세척하였다. 등전점전기영동은 pH 3-7 pre-cast IEF gel (Novex)과 비변성전기영동을 수행한 전기영동 장치를 이용하였으며 음극 완충용액은 20 mM lysine, 20 mM arginine을 양극 완충용액은 7 mM phosphoric acid를 각각 사용하였다. 분리 조건은 4℃에서 100 V 60분, 200 V 60분, 500 V 30분이었다.
- 복숭아혹진딧물 살충제 감수성 계통은 국립농업과학원에서 분양 받았으며, 지역별로 채집한 야외 집단은 양채류 재배가 많이 이루어지고 있는 홍천(홍천군 내면), 평창(평창군 대관령면), 봉화(봉화군 석포면), 무주(무주군 무풍면), 제주 (서귀포시 대정읍)에서 2009년에서 2011년까지 3년 간 6~8월 사이에 채집하여 배추를 기주로 고령지농업연구센터 곤충사육실(온도 25℃, 광주기 16L: 8D, 상대습도 60±10%)에서 사육하였다.
데이터처리
- 도태 계통을 고정 한 후 한 달에 1회 도태를 지속하면서 저항성 계통을 유지하였다. 생물 검정은 위와 동일한 방법으로 수행하였으며, LC50값은 SAS 프로그램을 이용하여 probit 방법을 사용하였다(SAS institute, 2009).
이론/모형
- PCR 산물은 전기영동으로 확인 후 Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up kit (Promega, Madison, WI, USA)을 이용하여 정제, 농축하였다. 실험 방법은 kit에서 제공하는 방법을 따랐다. 정제, 농축된 PCR산물의 염기서열을 분석하였다(NICEM sequencing facility, Seoul National University, Seoul, Korea).
- 정제, 농축된 PCR산물의 염기서열을 분석하였다(NICEM sequencing facility, Seoul National University, Seoul, Korea). 염기서열 분석 결과는 Lasergene software (DNASTAR, Madison, WI, USA)를 이용하여 Clustral V방법으로 정렬하고 분석하였다.
- 원심분리 후 상층액을 지질 제거를 위하여 Wizard® SV gel and PCR clean-up kit에서 제공하는 칼럼에 넣고 7,000 g로 4℃에서 5분간 원심분리 하였다. 칼럼을 통과한 용액을 Bradford 방법(Bradford, 1976)으로 단백질정량 한 후 단백질원으로 사용하였다.
성능/효과
- 2009년에서 2011년까지 3년간 양채류 재배가 많이 이루어지고 있는 다섯 지역의 복숭아혹진딧물 약제 저항성 수준을 모니터링 한 결과 일부 약제에 대해서는 저항성 수준이 매우 높았다(Table 3). 2009년에는 양채류 재배가 많이 이루어지고 있는 홍천, 평창, 봉화, 무주, 제주 지역 개체군 대부분 메소밀, 비펜스린 등에 대하여 고도의 저항성을 보였으나 2010년에는 지역에 따라 차이가 컸다.
- 3년간 실험에 사용된 5가지 야외 계통에서 저항성을 보인 메소밀과 비펜스린의 작용점으로 알려진 아세틸콜린에스터레이즈(ace; StoF)와 나트륨채널(para; LtoF)에 이미 보고된 돌연변이 분포를 알아본 결과 ace에서는 야외 계통 모두 돌연변이가 분포하고 있으나 para의 경우 높은 저항성을 보였음에도 불구하고 돌연변이가 거의 나타나지 않았다(Fig. 1). 이러한 결과는 외국에서 보고된 결과(Cassanelli et al.
- , 2010). 그러나 본 연구를 통하여 국내에서는 1,000배 이상 고도 저항성을 보이는 개체군은 찾을 수가 없었고, 다만 MR이 감수성에 비하여 약 200배 정도의 저항성을 보였을 뿐이다. 다만, 2000년대 초 보다는 야외 개체군 내 이미다클로프리드 저항성 수준이 많이 발달된 것을 확인하였다(Choi et al.
- , 2005), para의 LtoF의 경우 생물검정 결과와 상관관계가 없어 국내에서는 적용하기 어려울 것으로 판단한다. 또한, 본 연구를 통하여 복숭아혹진딧물para에서 LtoF 돌연변이가 발견되는 부근에서 새로운 점돌연변 이인 MtoL 돌연변이를 발견하였다. 이 돌연변이는 최초 목화진 딧물에서발견되었으나(Yang and Williamson, 2001), 최근 프랑스 야외 계통에서도 발견된 예가 있다(Fontaine et al.
- 네오니코티노이드 계통의 약제(이미다클로프리드, 아세타미프리드, 티아메톡삼, 티아클로프리드, 클로티아니딘, 디노테퓨란)가 대체적으로 좋은 살충효과를 나타냈지만, 2011년에는 지역에 따라 디노테퓨란의 경우 저항성 차이가 컸으므로 방제 약제를 선택할 때 주의를 기울여야 할 것이다. 또한, 지역 개체군에서 꾸준하게 도태를 시킨 복합저항성 계통(MR)은 감수성에 비하여 다양한 약제에 대해 높은 저항성을 나타냈다(Table 4). 이는 야외 개체군에서도 다양한 약제에 대하여 복합적으로 저항성을 보일 수 있다는 것이다.
- 복숭아혹진딧물 저항성 발달에 에스터레이즈(E4, FE4 type esterase)가 관여하는 것으로 알려져 있는데(Field and Devonshire, 1998), 주로 유전자의 중복(gene duplication)에 따른 수적 증가와 유전자의 과발현(over-expression)에 의한 양적인 증가이다 (Field and Foster, 2002). 본 연구에서 에스터레이즈의 양적 증가여부를 조사한 결과, 복합저항성 계통과 지역계통 특이적 동위효소(isozyme)의 발현정도는 지역 간에 차이가 있었으나, 사용한 4개의 기질간의 차이는 거의 없었다 (Fig. 2). 사용한 α -NA, NP, NB, NV 4개의 기질은 곁사슬이 각각 1~4개로 곁사슬이 길어질수록 에스터레이즈가 가수분해되기 어려워져 곁사슬길이에 따른 분해능 차이를 볼 수 있다(Barron and Bernsohn, 1968).
후속연구
- , 2004). 따라서 국내 복숭아혹진딧물 살충제 저항성관리를 위하여 본 연구를 통해 선발된 저항성 마커를 활용한다면 더 효율적인 관리가 가능 할 것이다.
- 위의 결과를 종합해 보면, 살충제에 대한 지역별, 시기별 저항성 정도가 다르기 때문에 정확하게 저항성 정도를 모니터링 한 후 약제 방제 체계를 수립 한다면 훨씬 더 효과적인 방제로 약제비 절감 효과를 얻을 수 있을 것이다. 그러나 생물 검정의 경우 많은 시간과 노력이 필요하기 때문에 빠른 시간 내에 저항성 모니터링을 할 수 있는 방법이 필요한데, PCR을 활용 한 분자 생물학적인 방법이 그 대체 방법으로 제시 되어왔다(Aketarawong et al.
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