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문제 정의
- 따라서 본 연구는 우리나라 소나무속에 대한 DNA atpFH, psbA-trnH region의 계통학적 해상력을 검토하고, 이를 기초로 우리나라에 분포하는 소나무속의 정확한 계통 체계를 정립하는 것을 목적으로 하였다.
- 염기서열 분석을 통해 얻어진 자료행렬을 기초로 최단 거리 계통도를 작성하였고, 각 유전자별 및 유전자간 조합분석을 실시하였으며, 이를 통해 분류군간의 계통학적 유연관계를 검토하고자 하였다.
제안 방법
- )]이 포함되어 다루어 진 바 있다. 이후 Gernandt et al. (2005)이 rbcL과 matK를 마커로 활용하여, 우리나라에 분포하는 것으로 알려진 소나무속 20종 중 12종[풍겐스소나무(P. pungens Lamb.), 리기다소나무(P. ridida Mill.), 테에다소나무(P. taeda L.), 방크스소나무(P. banksiana Lamb.), 곰솔, 구주소나무, 소나무, 잣나무, 눈잣나무, 섬잣나무, 스트로브잣나무, 백송]이 포함된 계통학적 연구를 수행하였다. 이러한 유전분석을 통한 소나무속의 계통연구들은 (Wang et al.
- 유전자 증폭을 위한 중합효소 연쇄반응은 70-80 ng의 정제된 template DNA, 1 unit Taq DNA polymerase (Solgent Co., Korea), 10× reaction buffer (100 mM Tris-HCl, pH 8.0, 500 mM KCl, 15 mM MgCl2) 2.5 µL, 2.5 mM의 dNTP (Solgent Co., Korea)와 양방향 primer (5 pmol/µL) 각각 0.5 µL에 멸균된 3차 증류수를 첨가하여 최종 volume 25 µL의 반응액으로 실시하였다.
- 계통수 구축을 위하여 형질에 있어서 가중치는 모두 동일하게 처리하였고, 전체 염기서열 중 gap은 모두 결여형질(missing character)로 처리하였으며, 정렬된 염기서열의 모든 character는 ‘unordered’, ‘unweighted’ character로 설정하였다.
- 상등액을 제거한 pellet은 실온에서 3시간 정도 건조시켜 여분의 alcohol을 제거한 후, pellet의 양에 따라 50~100 µL의 1X TE buffer를 추가하여 용해시켰다. 추출한 DNA는 1% agarose gel로 전기영동 하여 추출여부를 확인하였으며, 정확한 DNA의 농도는 GeneQuant pro (Amersham Pharmacia Biotech, Inc. USA)를 이용하여 결정하였다.
- 본 연구에서 한국산 소나무속의 분자계통학적 분석을 위해 엽록체 DNA atpF-H region, psbA-trnH region을 이용하였다.
- 5 µL에 멸균된 3차 증류수를 첨가하여 최종 volume 25 µL의 반응액으로 실시하였다. 유전자 증폭반응은 GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems Inc., USA)을 사용하였으며, PCR 반응 산물은 LoadingSTAR (DYN-EBIO Co., Korea)와 혼합된 PCR product를 1% agarose gel에서 전기영동하여 증폭여부를 확인하였다. 각각의 유전자 지역을 증폭하기 위해 사용한 primer의 sequence 등은 Table 2에 정리하였다.
- atpF-H region : atpF(CBOL Plant Working Group, 2009) 와 atpH(CBOL Plant Working Group, 2009) primer를 이용하여 atpF-H region을 증폭하였다(Table 2). atpF-H의 증폭은 94℃에서 2분 동안 pre-denaturation을 시킨 후, 94℃에서 1분의 denaturation, 55℃에서 1분의 annealing, 72℃에서 1분의 extension으로 이루어지는 thermal cycle 과정을 40회 반복하였으며, 마지막으로 72℃에서 final extension 과정으로 구성된 PCR을 통해 이루어졌다.
- psbA-trnH region : trnH (CBOL Plant Working Group, 2009)와 psbA (CBOL Plant Working Group, 2009) primer를이용하여 psbA-trnH region을 증폭하였다(Table 2). psbA-trnH 의 증폭은 94℃에서 2분 동안 pre-denaturation을 시킨 후, 94℃에서 1분의 denaturation, 64.
- PCR products는 QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN, USA)를 이용하여 공급자의 매뉴얼에 따라 정제하였으며, 정제된 PCR products를 cycle sequencing 반응의 주형으로 사용하였다.
- Cycle sequencing 반응은 BigDye Terminator V3.1 Sequencing Kit (Applied Biosystems, Inc. USA)를 사용하여 GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems Inc. USA) 에서 공급자의 메뉴얼에 따라 실시하였다. Post reaction clean-up 과정은 Montage SEQ96 sequencing reaction cleanup kit (Millipore Corporation, Bedford, MA)를 이용하여 공급자의 메뉴얼에 따라 정제하였다.
- USA) 에서 공급자의 메뉴얼에 따라 실시하였다. Post reaction clean-up 과정은 Montage SEQ96 sequencing reaction cleanup kit (Millipore Corporation, Bedford, MA)를 이용하여 공급자의 메뉴얼에 따라 정제하였다.
- Sequencing된 각 유전자의 염기서열은 Sequencher (ver. 4.5, Gene Codes. USA)를 이용하여 조합(assembly)하였다. 염기서열의 분석을 위하여 Clustal X program (ver.
- USA)를 이용하여 조합(assembly)하였다. 염기서열의 분석을 위하여 Clustal X program (ver. 1.83, Thompson et al., 1997)을 이용하여 일차적으로 염기를 정렬시킨 후, 최종적으로 나안으로 직접 염기서열을 수정하여 확인하였다.
- 956)가 도출되었으며, 이를 통해 완전합의계통수(Strict consensus tree)를 작성하였다. Strict consensus tree에서 방크스소나무가 리기다소나무, 리기테에다소나무(P. rigia Mill. X P. taeda L.), 테에다소나무와 함께 57%의 BP 값으로 지지되는 분계조를 형성하였다는 점과 잣나무아속 내에서의 분지순서, BP값 등에서 차이를 보일뿐 psbA-trnH region에서의 결과와 유사한 topology를 형성하였다(Fig. 1). ML tree에서는 각 분계조를 지지하는 BP 값의 차이를 제외하고 전체적인 topology는 strict consensus tree와 유사하였다(Fig.
- atpF-H region : atpF(CBOL Plant Working Group, 2009) 와 atpH(CBOL Plant Working Group, 2009) primer를 이용하여 atpF-H region을 증폭하였다(Table 2). atpF-H의 증폭은 94℃에서 2분 동안 pre-denaturation을 시킨 후, 94℃에서 1분의 denaturation, 55℃에서 1분의 annealing, 72℃에서 1분의 extension으로 이루어지는 thermal cycle 과정을 40회 반복하였으며, 마지막으로 72℃에서 final extension 과정으로 구성된 PCR을 통해 이루어졌다.
- psbA-trnH region : trnH (CBOL Plant Working Group, 2009)와 psbA (CBOL Plant Working Group, 2009) primer를이용하여 psbA-trnH region을 증폭하였다(Table 2). psbA-trnH 의 증폭은 94℃에서 2분 동안 pre-denaturation을 시킨 후, 94℃에서 1분의 denaturation, 64.5℃에서 1분의 annealing, 72℃에서 1분의 extension으로 이루어지는 termal cycle 과정을 40회 반복하였으며, 마지막으로 72℃에서 final extension 과정으로 구성된 PCR을 통해 이루어졌다.
대상 데이터
- 국내에 자생하거나 도입되어 식재되고 있는 소나무속 17분류군에 대하여 국립수목원 식물표본관(KH)에 소장하고 있는 건조표본의 침엽을 실험재료로 사용하였고, 중국산 으로 알려져 있는 백송 1개체는 직접 채집한 생체를 이용하였다. 또한 근연분류군으로써 같은 과에 속해있는 잎갈나무속(Larix Mill.
- 국내에 자생하거나 도입되어 식재되고 있는 소나무속 17분류군에 대하여 국립수목원 식물표본관(KH)에 소장하고 있는 건조표본의 침엽을 실험재료로 사용하였고, 중국산 으로 알려져 있는 백송 1개체는 직접 채집한 생체를 이용하였다. 또한 근연분류군으로써 같은 과에 속해있는 잎갈나무속(Larix Mill.)의 일본잎갈나무[Larix kaempferi (Lamb.) Carrire]를 군외군(outgroup)으로 이용하였다. 본 연구에서 사용한 식물재료의 표본 정보는 Table 1에 정리하였다.
데이터처리
- PAUP* program (ver. 4.0b10, Swafford, 2002)을 이용하여 Uncorrected pairwise distance로 각 분류군들 사이의 염기변이 양상을 분석하였다. 계통수 구축을 위하여 형질에 있어서 가중치는 모두 동일하게 처리하였고, 전체 염기서열 중 gap은 모두 결여형질(missing character)로 처리하였으며, 정렬된 염기서열의 모든 character는 ‘unordered’, ‘unweighted’ character로 설정하였다.
- 계통수 구축을 위하여 형질에 있어서 가중치는 모두 동일하게 처리하였고, 전체 염기서열 중 gap은 모두 결여형질(missing character)로 처리하였으며, 정렬된 염기서열의 모든 character는 ‘unordered’, ‘unweighted’ character로 설정하였다. PAUP*에 의해 가장 짧은 경로를 가지는 계통수를 산출하기 위해 heuristic search를 통해 최대절약분석(maximum parsimony analysis)을 실시하였으며, Bootstrap 분석(Felsenstein, 1985)을 1,000회 반복하여 계통도 가지의 지지도를 확인하고자 Bootstrap value를 산출하였다. Maximum likelihood analysis는 GTR+I+Γ 모델을 적용하여 RAxML BlackBox(http://phylobench.
이론/모형
- DNA 추출을 위해 확보된 재료의 잎을 사용하였고, Total genomic DNA는 Doyle and Doyle (1987)의 CTAB 방법을 일부 변경한 Kim et al. (2008)과 Kim et al. (2009)의 방법을 이용하여 추출하였다. 건조된 식물의 잎 40 mg을 조직분쇄기 (Tissue Lyser II, QIAGEN)로 분쇄하여 1.
- Maximum likelihood analysis는 GTR+I+Γ 모델을 적용하여 RAxML BlackBox(http://phylobench.vital-it.ch/raxml-bb/) 를 이용하였다.
- 염기서열의 분석(sequencing)은 ABI 3700 automated DNA sequencer (Applied Biosystems, Inc. USA)를 이용하였다.
성능/효과
- 엽록체 DNA atpF-H region의 염기서열 변이 : 17분류군에 대한 atpF-H region을 분석하였으며, 557 bp의 염기 site 로 정렬된 자료행렬을 이용한 계통학적 분석결과, 전체 염기서열 중 510 bp는 일정하고, 47 bp는 변이가 있었으며, 이 중 25 bp가 계통학적으로 유용한 형질이었다. 분석구간의 G+C 함량은 35.
- 엽록체 DNA psbA-trnH region의 염기서열 변이 : 17분류군에 대한 psbA-trnH region을 분석하였으며, 687 bp의 염기site로 정렬된 자료행렬을 이용한 계통학적 분석결과, 전체 염기서열 중 620 bp는 일정하고, 67 bp는 변이가 있었으며, 이 중 23 bp가 계통학적으로 유용한 형질이었다. 분석구간의 G+C 함량은 38.
- 엽록체 DNA atpF-H region : 17분류군에 대한 계통학적 분석 결과 47 step의 tree length를 갖는 3개의 MP tree(CI, RI = 1.000)가 도출되었으며, 이를 통해 Strict consensus tree 를 작성하였다. Strict consensus tree에서 소나무속 전체는 100%의 BP 값으로 강하게 지지되었으나, 잣나무아속인 잣나무가 소나무아속과 분리되지 못하고 소나무아속에 포함되는 결과를 보여주었다(Fig.
- 000)가 도출되었으며, 이를 통해 Strict consensus tree 를 작성하였다. Strict consensus tree에서 소나무속 전체는 100%의 BP 값으로 강하게 지지되었으나, 잣나무아속인 잣나무가 소나무아속과 분리되지 못하고 소나무아속에 포함되는 결과를 보여주었다(Fig. 3, A).
- 엽록체 DNA psbA-trnH region : 17분류군에 대한 계통 분석 결과 68 step의 tree length를 갖는 2개의 유사한 MP tree(CI = 0.985, RI = 0.990)가 도출되었으며, 이를 통해 Strict consensus tree를 작성하였다. Strict consensus tree에서 atpF-H region과 마찬가지로 소나무속 전체가 100%의 높은 BP 값으로 지지되었다.
- 990)가 도출되었으며, 이를 통해 Strict consensus tree를 작성하였다. Strict consensus tree에서 atpF-H region과 마찬가지로 소나무속 전체가 100%의 높은 BP 값으로 지지되었다. 또한 소나무아속은 100%, 잣나무아속은 92%의 다소 높은 BP 값에 의해 지지되는 각각의 분계조를 형성하였다(Fig.
- 엽록체 DNA atpF-H와 psbA-trnH region의 조합분석 :17분류군에 대한 1,244개의 염기site로 조합된 엽록체 DNA 분석결과, 122 step의 tree length를 갖는 7개의 MP tree(CI = 0.934, RI = 0.956)가 도출되었으며, 이를 통해 완전합의계통수(Strict consensus tree)를 작성하였다. Strict consensus tree에서 방크스소나무가 리기다소나무, 리기테에다소나무(P.
- 본 연구에서 마커로 활용된 2개 유전자에 대한 분석결과, 구과 실편의 끝에 돌기가 있다는 공통형질을 갖는 소나무속이 단계통군이라는 것을 일부 지지하고 있다. 또한 Fig.
- , 1999; Gernandt, 2005). 또한 이번 연구에 사용된 atpF-H region 유전자가 속내에서의 분류보다는 과내에서의 분류군에 적합하다고 생각했을 때, 소나무속은 독립적인 단계통군으로 판단되어지며, 속내에서는 소나무아속과 잣나무아속으로 뚜렷하게 구분된다고 생각된다.
- 본 연구결과 (소나무속 내에서의 계통유연관계를 살펴보면), 소나무아속에서는 소나무와 구주소나무는 2년지의 수피가 불규칙적으로 갈라지는 형태적 특징과 본 연구를 통해 이루어진 분자계통학적 연구 결과, 두 종은 소나무아속 내에서 가장 가까운 분류군으로 생각되며, 이는 rbcL, matK, trnV 등의 마커를 활용한 소나무속의 분자계통연구를 실시한 Wang et al., (1999)과 rbcL, matK를 마커로 활용하여 유라시아산 소나무속의 분자계통연구를 실시한 Gernandt, (2005)의 연구결과와도 일치한다. 리기다소나무+리기테에다소나무+테에다소나무+방크스소나무 분계조는 57%의 다소 낮은 BP에 의해 지지되었으나 소나무, 구주소나무, 곰솔 등과 명확히 구분되어지고, 리기다소나무+리기테에다소나무+테에다소나무 분계조가 96%의 높은 BP값으로 지지되어 선행된 연구결과들(Wang et al.
- 본 연구에서 계통분석에 이용된 2개의 유전자는 각각의 분석결과가 다소 상이했다. 엽록체 DNA psbA-trnH region은 선행연구에 비해 계통학적으로 유효한 염기site 가 상대적으로 적음에도 불구하고(3.4%), 다른 유전자들을 이용한 선행연구와 유사한 topology를 보이며 소나무 속의 계통학적 유연관계 분석에서 높은 해상력을 제공할 수 있을 것으로 나타났다. 반면, atpF-H region은 psbA-trnH region에 비해 계통학적으로 유효한 site가 많았음에도 불구하고(4.
- 새로운 분자마커를 활용한 본 연구결과, 소나무속은 뚜렷한 단계통군으로 생각되고, 한국산 소나무속은 소나무아속과 잣나무아속으로 구분하는 것이 타당하고, 소나무아속은 소나무+구주소나무 분계조, 곰솔, 만주곰솔의 세 그룹으로 분류하는 것이 타당할 것으로 생각된다. psbAtrnH region은 나자식물의 분자분류학적 연구에 있어서 속 수준의 분석에 다소 유용한 것으로 나타났지만, 과수준에서 더욱 높은 해상력을 제공할 수 있을 것으로 생각되며, atpF-H region은 과수준이나 과이상의 상위분류군 분석에 유용할 것으로 생각된다.
후속연구
- 백송은 침엽이 3장씩 속생하여 5엽인 다른 잣나무아속의 식물들과 차이가 있지만 유관속이 1개인 특징으로 잣나무아속과 공통점을 가진다. 이처럼 백송은 형태학적으로 소나무아속과 잣나무아속의 중간 형질을 가지고 있으며 향후 소나무속내 두 아속간의 진화학적연구에 중요한 종으로 판단된다.
- 새로운 분자마커를 활용한 본 연구결과, 소나무속은 뚜렷한 단계통군으로 생각되고, 한국산 소나무속은 소나무아속과 잣나무아속으로 구분하는 것이 타당하고, 소나무아속은 소나무+구주소나무 분계조, 곰솔, 만주곰솔의 세 그룹으로 분류하는 것이 타당할 것으로 생각된다. psbAtrnH region은 나자식물의 분자분류학적 연구에 있어서 속 수준의 분석에 다소 유용한 것으로 나타났지만, 과수준에서 더욱 높은 해상력을 제공할 수 있을 것으로 생각되며, atpF-H region은 과수준이나 과이상의 상위분류군 분석에 유용할 것으로 생각된다. 또한, 향후 본 연구에 포함되지 않았던 전 세계에 분포하는 소나무속 또는 소나무과의 분류군들을 포함하는 추가적인 연구를 수행하여 이에 대한 더 명확한 결과가 재검토되어야 할 것으로 생각된다.
- psbAtrnH region은 나자식물의 분자분류학적 연구에 있어서 속 수준의 분석에 다소 유용한 것으로 나타났지만, 과수준에서 더욱 높은 해상력을 제공할 수 있을 것으로 생각되며, atpF-H region은 과수준이나 과이상의 상위분류군 분석에 유용할 것으로 생각된다. 또한, 향후 본 연구에 포함되지 않았던 전 세계에 분포하는 소나무속 또는 소나무과의 분류군들을 포함하는 추가적인 연구를 수행하여 이에 대한 더 명확한 결과가 재검토되어야 할 것으로 생각된다.
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