[논문]저 농도의 전자선을 조사한 전골수구성 백혈병 세포 죽음에서의 TNF-α 작용 효과

김동현; 고성진

doi:10.5392/jkca.2014.14.06.241

저 농도의 전자선을 조사한 전골수구성 백혈병 세포 죽음에서의 TNF-α 작용 효과
Cell Death of Human Promyelocytic Leukemia Cell after Low Dose of Electron Beam Irradiation with TNF-α 원문보기

한국콘텐츠학회논문지 = The Journal of the Korea Contents Association, v.14 no.6, 2014년, pp.241 - 246

김동현 (부산가톨릭대학교 방사선학과) , 고성진 (부산가톨릭대학교 방사선학과)

초록
AI-Helper

급성전골수구성 백혈병(Acute promyelocytic leukemia, APL)은 혈액암으로 치료가 쉽지 않을 뿐만 아니라 항암치료에 가장 효과가 좋다는 방사선 치료를 해도 오히려 정상세포에도 작용하여 부작용을 초래하게 된다. 본 연구에서는 전자선(EB)을 TNF-${\alpha}$와 같이 처리하였을 경우 정상세포와 암세포의 세포 죽음에 어떠한 영향을 미치는지 확인하였다. HL-60세포는 APL세포주로서 사용하였고 DMSO를 처리하여 분화시킨 HL-60세포는 정상과립구의 성질을 나타내어 정상대조군으로 이용하였다. 그 결과 TNF-${\alpha}$를 전자선을 처리한 HL-60세포에서만 세포독성효과를 나타내었고 이 과정에서 TNF-${\alpha}$는 caspase3를 활성화 시켜서 세포자멸사를 유도하여 세포가 죽음에 이르게 하였다. 결론적으로 TNF-${\alpha}$는 항암치료의 부작용을 없애기 위해 저농도의 전자선 치료 시 함께 사용하여 암 세포의 제거를 증가시켜 암의 치료효율을 높일 수 있는 유효물질로 사료된다.

Abstract ▼ AI-Helper

Acute promyelocytic leukemia (APL) is a cancer of the blood. Although electron beam (EB) irradiation is used with other anti-cancer agents, EB irradiation can be harmful to normal tissues around the cancer. In the present study, we evaluate the differential cytotoxic effect of EB irradiation with other molecules, including TNF-${\alpha}$, on DMSO-treated HL-60 cells and HL-60 cells. HL-60 cells are the human promyleocytic leukemia cell line and are differentiated by DMSO. DMSO-treated HL-60 cells are considered to be normal granulocytic cells. In these results, TNF-${\alpha}$ may be used as the potential agent for the treatment of blood cancer without side effects in low dose of EB irradiation therapy.

주제어

AI 본문요약
AI-Helper

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문제 정의

DMSO처리 HL-60세포와 DMSO미처리 HL-60세 포에서 세포독성을 보이지 않는 1Gy의 전자선을 이용해 암세포에만 특이적으로 세포자멸사를 유도하는 방법을 찾고자 하였다. 그래서 각 세포에 1Gy의 전자선을 조사한 다음 3시간 이후에 TNF-α 10ng/ml을 처리 하고 16시간 동안 배양하였다.
또한 방사선 조사도 가장 효과적인 암치료법으로 치료효과를 높이지만 동시에 암 이외에 정상 조직 및 세포에도 영향을 미쳐 다양한 부작용을 유발하기도 한다. 그래서 본 실험에서는 매주 낮은 농도의 전자선을 조사한 다음 표적세포인 암세포에만 작용하는 면역화학물질을 이용하여 방사선 감수성을 높이는 것과 동시에 암 세포의 죽음 유도를 더욱 활성화하여 암세포 제거에 이용해 보고자 하였다.
그러므로 본 연구 에서는 면역물질인 TNF-α를 이용하여 정상세포와 암세포에서 서로 작용을 유도하고자 하였다.
본 연구에서도 이러한 사실을 바탕으로 세포의 생사에 있어서 TNF-α의 양면적인 작용기전을 이용하여 사람 골수구성 백혈병 세포주인 HL-60세포를 분화시켜 정상세포로 간주하는 성숙 HL-60세포와 암세포인 미성숙 HL-60세포의 생존에 TNF-α의 작용을 확인하고자 하였다.
세포자멸사에서 최종실행자인 caspase3의 발현변화를 확인하기 위해 caspase-Glo®3assaykit(Promega, USA)를 이용하여 caspase3의 활성변화를 측정하고자 하였다.
그러므로 본 연구 에서는 면역물질인 TNF-α를 이용하여 정상세포와 암세포에서 서로 작용을 유도하고자 하였다.특히 이를 이용한 방법이 방사선에 대한 감수성을 표적세포인 암세포에서만 증가시켜 방사선 치료 시 정상세포에는 영향을 주지 않고 암세포에만 세포자멸사를 유도하여 제거할 수 있는지 확인하고자 하였다.
본 연구에서도 이러한 사실을 바탕으로 세포의 생사에 있어서 TNF-α의 양면적인 작용기전을 이용하여 사람 골수구성 백혈병 세포주인 HL-60세포를 분화시켜 정상세포로 간주하는 성숙 HL-60세포와 암세포인 미성숙 HL-60세포의 생존에 TNF-α의 작용을 확인하고자 하였다. 특히, 방사선 조사 기법과 병행하였을 경우 더욱 효과적으로 항암효과가 있는지 파악하고자 하였다.

제안 방법

세포고사를 확인하기 위해 annexin-V와 propidium iodide(PI)(BDbioscience,SanDiego,CA)염색을 실시한 다음 유세포 분석기로 annexin-V에 염색된 세포의 수를 측정하였다.Annexin-V에 염색된 모든 세포가 세포고사가 일어난 세포로 정의하고 각 샘플 당 총 10,000개의 세포를 분석하였다.
세포는 37℃, 5% CO₂조건으로 배양하였다. HL-60 세포는 전골수구성 백혈병 세포로 이용하였고 같은 계열의 정상세포를 준비하기 위해 HL-60세포에 DMSO 를 처리하여 과립구로 분화를 유도하였다.그래서 3일 동안 1.
HL-60세포에 DMSO를 처리하여 정상 과립구의 특징을 가진 세포로 분화시켰다. 이를 정상세포군으로 간주하고 암세포는 기존의 HL-60세포를 이용하였다.
2. MTT assay

MTTassaykit(Roche,Penzberg,Germany)를 이용 하여 세포 생존율을 확인하였다.전자선을 농도별로 조사한 다음 세포를 1×10 5 cells/50 μl의 농도로 부유하여 96wellplate에 분주하였다.
각각 16시간이 지나고, MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)solution을 10 μl 첨가하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 4시간을 배양한 다음 100 μl의 solubilizationsolution을 추가로 첨가하였다.
각각의 대조군과 암세포군에게 1, 5, 10, 20 Gy의 전자선을 조사한 다음 새로운 배지로 갈아주어 배양하였다. 이때,TNF-α 처리군은 전자선 조사 3시간 이후에 각각 10ng/ml농도의 TNF-α를 처리하여 다시 16시간 배양하였다.
이를 정상세포군으로 간주하고 암세포는 기존의 HL-60세포를 이용하였다.각각의 세포에 전자선의 처리가 세포 생존에 어떠한 결과를 나타내는지 확인하기 위해 각각 전자선을 1,5,10, 20Gy로 농도별로 조사한 다음 MTTassay로 세포 생존율을 확인하였다.그 결과 DMSO처리군과 미처리군 에서 모두 농도별로 세포생존율을 억제하는 것을 볼 수 있었다[그림 1].
또한 이러한 세포 죽음이 세포자멸사에 의한 것인지 확인하기 위해 위와 같은 방법으로 세포에 각각 전자선을 조사한 다음 annexin-V와 PI를 염색한 세포를 유세포분석기로 확인하였다. Annexin-V가 염색된 모든 세포를 세포자멸사가 일어난 세포로 간주하였다.
먼저 96-wellplate에서 세포를 분주하고 물질 처리하여 배양하였다.배양이 끝나면 키트의 방법에 따라 반응시약과 기질을 넣어 반응시킨 다음 luminometer를 이용하여 chemiluminescence를 측정하였다.
세포고사를 확인하기 위해 annexin-V와 propidium iodide(PI)(BDbioscience,SanDiego,CA)염색을 실시한 다음 유세포 분석기로 annexin-V에 염색된 세포의 수를 측정하였다.Annexin-V에 염색된 모든 세포가 세포고사가 일어난 세포로 정의하고 각 샘플 당 총 10,000개의 세포를 분석하였다.
전자선을 농도별로 조사한 다음 세포를 1×10 5 cells/50 μl의 농도로 부유하여 96wellplate에 분주하였다.

대상 데이터

HL-60 세포(American Type Culture Collection, Rockville,USA)는 10% heat-inactivatedfetalbovine serum (FBS),100 U/ml의 penicillin,100 μg/ml의 streptomycin(Lifetechnologies,Inc.,USA)이 포함된 RPMI1640배지(Lifetechnologies,Inc.)에서 배양하였다.
HL-60세포에 DMSO를 처리하여 정상 과립구의 특징을 가진 세포로 분화시켰다. 이를 정상세포군으로 간주하고 암세포는 기존의 HL-60세포를 이용하였다.각각의 세포에 전자선의 처리가 세포 생존에 어떠한 결과를 나타내는지 확인하기 위해 각각 전자선을 1,5,10, 20Gy로 농도별로 조사한 다음 MTTassay로 세포 생존율을 확인하였다.

성능/효과

그 결과 1Gy의 전자선을 조사한 DMSO처리 HL-60세포에 TNF-α 처리하였더니 세포자멸사에 큰 영향을 주지 않았다[그림 3].
각각의 세포에 전자선의 처리가 세포 생존에 어떠한 결과를 나타내는지 확인하기 위해 각각 전자선을 1,5,10, 20Gy로 농도별로 조사한 다음 MTTassay로 세포 생존율을 확인하였다.그 결과 DMSO처리군과 미처리군 에서 모두 농도별로 세포생존율을 억제하는 것을 볼 수 있었다[그림 1].
그래서 각 세포에 1Gy의 전자선을 조사한 다음 3시간 이후에 TNF-α 10 ng/ml을 처리하고 16시간 동안 배양한 결과 caspase3 의 활성도가 DMSO처리군에서는 약간 감소하는 경향을 보인 것에 반해 DMSO미처리군에서 유의하게 증가한 것을 확인하였다[그림 4].
본 연구에서 나타난 바와 같이 TNF-α는 세포의 종류에 따라 정반대의 작용을 하는 것처럼 다양한 효과를 보인다.
이 결과를 통해 낮은 농도인 1Gy의 전자선은 세포독성에 영향을 주지 않으나 TNFα를 같이 처리함으로써 DMSO 미처리 세포인 암세포성 HL-60세포에 세포자멸사를 부분적으로 유도하는 것을 알 수 있다.

후속연구

의료기관의 종양학과에서는 표재성 악성종양의 경우 전자선을 조사하는 장비인 선형가속장치(linac)를 이용해 우선적으로 치료를 하고 있다. 본 연구에서 확인한 결과를 바탕으로 전자선과 TNF-α를 이용하여 암세포에 대한 구체적인 기전 파악 및 효능을 더욱 검증한다면 부작용이 적으면서 효율적인 암세포 억제를 유도하는 혈액암 치료법 개발에 적용할 수 있을 것으로 사료 된다.
APL의 치료제로는 주로 비타민 A의 파생물인 all-transretionicacid(ATRA)를 이용해 백혈병 세포의 분화 및 세포자멸사를 유도하여 치료에 사용해왔지만, ATRA는 일부 호흡곤란, 발열, 저혈압 등을 동반하는 retionicacidsyndrome(RAS)를 유발한다[2]. 여전히 부작용이 없으면서 효과적인 항암 치료제가 부족한 필요한 실정이고 더욱 새로운 치료물질을 발굴 및 개발하는 것이 필요하다. 이런 암 치료에 치료제 말고도 방사선 치료를 동반하여 그 치료효과를 높이고 있다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	급성 전골수구성 백혈병을 주로 화학요법을 통해 치료하는 이유는 무엇인가?	HL-60세포는 혈액과 골수에서 발생되는 암인 전골 수구성 백혈병 연구에 주로 사용되는 세포로 특히 급성 전골수구성 백혈병(acute promyelocytic leukemia, APL)의 발병기전 및 치료법을 위한 연구에 이용된다. 특히 APL은 외과적 수술로 치료하기 어려운 암이기 때문에 주로 화학요법을 통해 치료한다.화학요법은 암세포에 특이적인 세포독성을 가지고 있는 물질을 처리한 다음 암세포의 죽음이 유발되는지 확인하여 항암효과를 확인하는 것으로 이때 암세포의 세포자멸사와 그와 관련된 작용기전을 연구하고 규명하는 것이 중요하다 [1].
	APL의 치료제로 주로 이용되는 ATRA는 어떤 부작용이 있는가?	화학요법은 암세포에 특이적인 세포독성을 가지고 있는 물질을 처리한 다음 암세포의 죽음이 유발되는지 확인하여 항암효과를 확인하는 것으로 이때 암세포의 세포자멸사와 그와 관련된 작용기전을 연구하고 규명하는 것이 중요하다 [1].APL의 치료제로는 주로 비타민 A의 파생물인 all-transretionicacid(ATRA)를 이용해 백혈병 세포의 분화 및 세포자멸사를 유도하여 치료에 사용해왔지 만,ATRA는 일부 호흡곤란,발열,저혈압 등을 동반하는 retionicacidsyndrome(RAS)를 유발한다[2].여전히 부작용이 없으면서 효과적인 항암 치료제가 부족한 필요한 실정이고 더욱 새로운 치료물질을 발굴 및 개발 하는 것이 필요하다.
	HL-60세포는 어떤 연구에 주로 이용되는가?	HL-60세포는 혈액과 골수에서 발생되는 암인 전골 수구성 백혈병 연구에 주로 사용되는 세포로 특히 급성 전골수구성 백혈병(acute promyelocytic leukemia, APL)의 발병기전 및 치료법을 위한 연구에 이용된다. 특히 APL은 외과적 수술로 치료하기 어려운 암이기 때문에 주로 화학요법을 통해 치료한다.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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