[논문]Nostoc commune으로부터 백혈병세포와 간암세포에 대한 apoptosis 유도 광과민성물질 pheophytin a의 분리 및 구조동정

박재은; 이준영; 이민우; 장은진; 홍창오; 김근기

doi:10.5352/jls.2018.28.11.1321

Nostoc commune으로부터 백혈병세포와 간암세포에 대한 apoptosis 유도 광과민성물질 pheophytin a의 분리 및 구조동정
Isolation and Identification of Pheophytin, a Photosensitizer from Nostoc commune that Induces Apoptosis in Leukemia and Cancer Cells 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.28 no.11 = no.223, 2018년, pp.1321 - 1331

박재은 (부산대학교 생명환경화학과) , 이준영 (마산대학교 임상병리학과) , 이민우 (부산대학교 생명환경화학과) , 장은진 (부산대학교 생명환경화학과) , 홍창오 (부산대학교 생명환경화학과) , 김근기 (부산대학교 생명환경화학과)

초록
AI-Helper

본 연구에서 N. commune으로부터 U937과 SK-HEP-1 세포에 대해 apoptosis를 유도하는 광과민성물질을 순수 분리하였다. N. commune을 dichloromethane : Methanol (1:1)로 추출하여 Hexane, EtOAc, MeOH로 분획하였다. 높은 광역학활성을 나타내는 EtOAc 분획물에서 NC-1을 분리하였으며, 분자량 870의 pheophytin a ($C_{55}H_{74}N_4O_5$)인 것으로 구조를 동정하였다. 광역학활성 조사는 NC-1을 $1.15{\mu}M$에서 $23.00{\mu}M$까지 5개의 농도를 처리하여 광을 조사하는 것과 조사하지 않는 조건으로 나누어 평가하였다. U937과 SK-HEP-1 두 세포에서 apoptotic body 형성, cell blebbing 등의 형태적 변화와 세포독성, caspase 활성, 세포핵의 응축, DNA 단편화 등이 광 의존적이며 농도 의존적으로 활성이 증가하였다. 추가적으로 유세포분석을 통한 apoptosis 유도의 정량적 분석 결과에서도 광조건에서 농도가 증가할수록 apoptosis 유도가 증가하는 것을 확인하였다. 이러한 결과를 통해 NC-1의 U937과 SK-HEP-1 세포에 대한 사멸은 광역학적 apoptosis에 의한 것임을 확인하였다. 본 연구 내용을 N. commune으로부터 광감각제 개발의 기초자료로 활용할 수 있을 것이다.

Abstract ▼ AI-Helper

The aim of this study was to separate the photosensitizer that induces apoptosis of U937 and SK-HEP-1 cells from Nostoc commune. Dried N. commune was extracted with $CH_2Cl_2/MeOH$ (1:1) to separate the photosensitizer using various chromatographic techniques. The isolated compound was identified as pheophytin a ($C_{55}H_{74}N_4O_5$) with a molecular weight of 870. Its photodynamic activities were assessed under different irradiation conditions (light and non-light) at the same concentration range of $1.15-23.0{\mu}M$. The apoptosis inducing activity in U937 or SK-HEP-1 cells appeared only in the light. The mechanisms underlying the pheophytin a-mediated photodynamic inhibition of cancer cells were further investigated by examining cell morphology changes, cytotoxicity, caspase-3/7 activity, fluorescence staining, flow cytometry analysis, and DNA fragmentation in these two cell lines. The positive control and the light irradiation group showed typical apoptotic responses, including morphological changes, cytotoxicity, caspase activity, nucleus shrinkage owing to chromatin condensation, DNA laddering, and the presence of apoptotic bodies. Cytotoxicity markedly increased in a dose-dependent manner after a 12 hr exposure. Caspase-3/7 activity was higher in U937 cells than in SK-HEP-1 cells. Apoptosis induction therefore appeared to be both concentration- and light-dependent. In conclusion, pheophytin a, isolated from the blue green alga N. commune, had a photodynamic apoptosis-inducing effect on U937 and SK-HEP-1 cells. The findings reported here can be used as basic data for the development of next-generation photosensitizers from N. commune.

주제어

표/그림 (11)

그림 Fig. 1. Schematic diagram of isolation process from N. commune.
표 Table 1. HPLC operating conditions
그림 Fig. 2. TLC developing pattern and HPLC analysis chromatogram of purified compound (NC-1).
그림 Fig. 3. Structure of purified photosensitizer compound (NC-1). NC-1 was determined to be pheophytin a of C₅₅H₇₄N₄O₅.
그림 Fig. 4. Morphological changes in U937 and SK-HEP-1 cells treated with NC-1 and light.
그림 Fig. 5. Growth inhibition effects of U937 and SK-HEP-1 cells by light treatment.
그림 Fig. 6. Measurement of caspase-3/7 activity in U937 and SK-HEP-1 cells by NC-1 and light treatment.
그림 Fig. 7. Fluorescent staining of U937 and SK-HEP-1 cells.
그림 Fig. 8. U937 cells viability by NC-1 treatment and light irradiation.
그림 Fig. 9. SK-HEP-1 cells viability by NC-1 treatment and light irradiation.
그림 Fig. 10. Detection of DNA fragmentation in U937 and SK-HEP-1 cells by NC-1 and light treatment.

AI 본문요약
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문제 정의

commune을 이용한 광역학적 활성에 대한 연구는 보고된 것이 없다. 따라서 본 연구에서는 N. commune 추출물로부터 인체 백혈병세포 U937과 간암세포 SK-HEP-1 에 대한 광역학활성을 확인하고, 광과민성물질을 분리하여 동정하였으며, 암세포에 대해 광역학적 세포사멸 기전이 apoptosis에 의한 것인지 확인함으로써 광과민성물질 개발을 위한 연구자료로 제공하고자 한다.
본 연구는 N. commune 추출물로부터 광역학적 apoptosis 유도 물질을 분리하여 차세대 광감각제 개발 가능성을 평가하고자 진행하였다. N.

제안 방법

Analysis of variance (ANOVA)와 Least Significant Different (LSD) (p<0.05)를 이용하여 유의성을 검정하였다.
Apoptosis 유도에 있어 중요한 역할을 하는 caspase의 발현유무를 확인하기 위해 Caspase-Glo®3/7 assay Kit (G8090, Promega, USA)를 이용하였다.
각 세포를 96 well plate에 1×10⁴ cells/well로 분주하고 6시간 배양하여 안정화시킨 후에 물질을 처리하였다. DMSO에 용해시킨 NC-1을 농도별로 처리하였으며, DMSO의 최종농도는 배지의 1% 이하가 되도록 하였다. 물질을 처리하고 4시간 경과한 후에 광 조사 plate에 400-700 nm의 파장을 포함하는 형광등을 이용해 3,250 Lux의 광을 10분간 조사했고, 암상태에서 12시간 더 배양하였다.
Flow cytometry analysis는 Muse™ Cell Analyzer (Merck Millipore, USA) 로 측정하였다. DNA fragmentation은 lysis buffer (wizard SV genomic DNA purification system, Promega, USA), RNase A (Invitrogen, USA) and proteinase K (Promega, USA)를 사용하였다.
Necrosis와 apoptosis는 형태학적으로 차이를 보이는데 apoptosis가 일어나면 염색질의 응축, 세포축소, apoptotic body 형성 및 DNA 단편화 등의 특징을 보인다. DNA 단편화는 apoptosis의 특징적인 현상으로 DNA단편화 현상을 확인함으로써 NC-1에 의한 세포사멸이 apoptosis에 의한 것인지 확인하였다. Fig.
DNA의 단편화 현상을 관찰하기 위하여 각 세포를 6 well plate에 1×106 cells/well로 분주하고, 6시간 배양하여 안정화시킨 후에 NC-1을 농도별로 처리하였다.
Flow cytometry analysis는 Muse™ Cell Analyzer (Merck Millipore, USA) 로 측정하였다.
commune 추출물로부터 광역학적 apoptosis 유도 물질을 분리하여 차세대 광감각제 개발 가능성을 평가하고자 진행하였다. N. commune 추출물을 Hexane, ethylacetate, methanol로 분획하여 U937과 SK-HEP-1 cell에 대해 광역학활 성을 확인하였고, ethylacetate 분획물에서 높은 광역학활성을 나타내어 물질 분리에 이용하였다. 4차례의 TLC를 통해 NC-1을 순수분리 하였으며, TLC와 HPLC를 이용하여 single spot 과 peak를 확인할 수 있었다.
NC-1의 광역학적 apoptosis 유도를 정량적으로 분석하기 위하여 annexin V staining을 실시하였다. 세포원형질 내막에 의치하고 있는 phosphatidyl serine (PS)은 apoptosis에 의해 손상될 경우 early apoptosis 과정에서 원형질 외막으로 위치를 이동하게 된다.
NC-1의 광역학적 세포사멸 기전을 확인하고자 최종 apoptosis 유도를 위한 effector caspase로서 작용하는 caspase-3/7의 발현 및 활성을 측정하였다. U937 세포의 효소 활성을 측정한 결과 광 조사한 처리구에서 11.
NC-1이 유도하는 세포사멸 과정 중 일어나는 세포핵의 변화를 형광염료를 이용하여 염색 후 형광현미경을 통해 관찰하였다(Fig. 7). U937과 SK-HEP-1 세포의 관찰한 결과 음성대조 구에서 원형으로 온전한 형태의 균일하게 형광 염색된 세포핵을 관찰하였으며, 양성대조구에서 apoptosis의 전형적인 현상으로 핵이 응축되어 크기가 다른 형광색의 세포핵을 관찰하였다.
물질을 분리하기 위하여 4차례의 TLC를 실시하였다. TLC 전개 후 유사한 R_f값을 그룹화하여 회수하였으며, 회수한 분획물들은 U937 세포에 처리하여 광역학활성을 확인하고, 활성이 나타나는 그룹을 다음 단계에 이용하였다. 이하 4차 TLC에서 최종적으로 분리된 물질을 NC-1으로 명명하였다(Fig.
U937과 SK-HEP-1 세포에 대한 NC-1의 광역학활성을 조사하기 위해 물질 처리 후 세포의 형태학적 변화를 관찰하였다. Fig.
7). U937과 SK-HEP-1 세포의 관찰한 결과 음성대조 구에서 원형으로 온전한 형태의 균일하게 형광 염색된 세포핵을 관찰하였으며, 양성대조구에서 apoptosis의 전형적인 현상으로 핵이 응축되어 크기가 다른 형광색의 세포핵을 관찰하였다. NC-1을 처리하고 광을 조사한 처리구에서 전체적으로 세포 밀도가 감소하고, 핵이 응축되며 apoptotic body가 형성된 것을 관찰할 수 있었다.
광역학적 apoptosis 유도 물질을 분리 및 분리도를 확인하기 위해서 NP-TLC (silica gel 60 GF254, Merk, Germany)와고성능액체크로마토그래피(HPLC, Waters 600, USA) 분석을 실시하였고, 구조 동정을 위해 핵자기공명분광기(NMR, 600 MHz Agilent Technologies, USA)와 FAB-MS (JMS 700, Joel, Japan) 분석을 실시하였다.
광역학적 세포사멸을 유도하는 NC-1의 처리에 따른 암세포 생존에 미치는 영향을 알아보기 위해 cell viability assay를실시하였다. U937 세포의 결과에서 광을 조사하고 2.
물질의 분리정도를 확인하기 위해 HPLC 분석을 실시하였고, 분석 조건은 Table 1에 나타냈다. 구조 동정을 위해 UV/Vis spectrophotometer 측정과 1D-NMR (¹H-NMR, ¹³C-NMR) 및 2DNMR (gCOSY, gHSQC, gHMBC) 분석을 실시하였으며, 물질 분자량 측정을 위해 FAB-MS 분석을 실시하였다.
용매 분획물 중 ethyl acetate 분획물이 암세포에 대한 높은 광역학활성이 나타나 광과민성물질 분리에 이용하였다. 물질을 분리하기 위하여 4차례의 TLC를 실시하였다. TLC 전개 후 유사한 R_f값을 그룹화하여 회수하였으며, 회수한 분획물들은 U937 세포에 처리하여 광역학활성을 확인하고, 활성이 나타나는 그룹을 다음 단계에 이용하였다.
cells/well로 분주하고, 6시간 배양하여 안정화시킨 후에 NC-1을 농도별로 처리하였다. 물질을 처리하고 2시간이 경과한 후에 광 조사 plate에 형광등을 이용해 3,250 Lux 의 광을 10분간 조사했고, 광 조사 6시간 후 세포를 회수하였다. 광을 조사하지 않은 plate는 계속 암상태를 유지시켰으며, 광 조사 plate와 동일한 시간 동안 배양하였다.
DMSO에 용해시킨 NC-1을 농도별로 처리하였으며, DMSO의 최종농도는 배지의 1% 이하가 되도록 하였다. 물질을 처리하고 4시간 경과한 후에 광 조사 plate에 400-700 nm의 파장을 포함하는 형광등을 이용해 3,250 Lux의 광을 10분간 조사했고, 암상태에서 12시간 더 배양하였다. 광을 조사하지 않은 plate는 계속 암 상태를 유지시켰으며, 광 조사 plate와 동일한 배양 시간을 주었다.
각 세포를 96 well white plate에 1×10⁴ cells/well로 분주하고 6시간 배양하여 안정화시킨 후에 NC-1을 농도별로 처리하였다. 물질을 처리하고 4시간 경과한 후에 광 조사 plate에 형광등을 이용해 3,250 Lux의 광을 10분간 조사했고, 암상태에서 12시간 더 배양하였다. 광을 조사하지 않은 plate는 계속 암상태를 유지시켰으며, 광 조사 plate와 동일한 배양 시간을 주었다.
각 세포를 96 well white plate에 1×10⁴ cells/well로 분주하고 6시간 배양하여 안정화시킨 후에 NC-1을 농도별로 처리하였다. 물질을 처리하고 4시간 경과한 후에 광 조사 plate에 형광등을 이용해 3,250 Lux의 광을 10분간 조사했고, 암상태에서 12시간 더 배양하였다. 광을 조사하지 않은 plate는 계속 암상태를 유지시켰으며, 광 조사 plate와 동일한 배양 시간을 주었다.
각 세포를 6 well plate에 1×10⁶ cells/well로 분주하고 6시간 배양하여 안정화 시킨 후에 NC-1을 농도별로 처리하였다. 물질을 처리하고 4시간이 경과한 후에 광 조사 plate에 형광등을 이용해 3,250 Lux 의 광을 10분간 조사했고, 광 조사 8시간 후에 세포를 회수하였다. 광을 조사하지 않은 plate는 계속 암 상태를 유지시켰으며, 광 조사 plate와 동일한 시간 동안 배양하였다.
각 세포를 6 well plate에 1×10⁶ cells/well로 분주하고 6시간 배양하여 안정화시킨 후 NC-1을 농도별로 처리하였다. 물질을 처리하고 4시간이 경과한 후에 광 조사 plate에 형광등을 이용해 3,250 Lux의 광을 10분간 조사했고, 광 조사 12시간 후에 세포를 회수하였다. 광을 조사하지 않은 plate는 계속 암상태를 유지시켰으며, 광 조사 plate와 동일한 시간 동안 배양하였다.
2B). 물질의 구조를 분석하기 위해 UV/Vis spectrophotometer 측정, NMR 분석과 FAB-MS 측정을 실시하였으며 이들 결과를 토대로 구조를 결정하였다. NC-1의 UV spectrum 측정 결과 405, 507, 535, 610, 667 nm 파장의 peak가 확인되어 chlorophyll a 유도체인 것으로 추측할 수 있었다.
1). 물질의 분리정도를 확인하기 위해 HPLC 분석을 실시하였고, 분석 조건은 Table 1에 나타냈다. 구조 동정을 위해 UV/Vis spectrophotometer 측정과 1D-NMR (¹H-NMR, ¹³C-NMR) 및 2DNMR (gCOSY, gHSQC, gHMBC) 분석을 실시하였으며, 물질 분자량 측정을 위해 FAB-MS 분석을 실시하였다.
배양이 종료된 후 배지량과 동량의 Caspase-Glo®3/7 reagent를 혼합하여 상온에서 1시간 반응시킨 후에 GloMaxTM-Multi Microplate Multimode Reader (Promega, USA)로 측정하였다.
배양이 종료된 후 배지량과 동량의 Celltiter-Glo 2.0 reagent를 혼합하여 상온에서 10분간 반응 시킨 후에 GloMax®-Multi Microplate Multimode Reader로 측정하였다.
세포 현탁액 100μl와 Muse™ Annexin V & Dead Cell reagent 100 μl를 혼합하여 암실에서 20분간 반응시킨 후에 Muse TM cell Analyzer로 apoptosis가 유발된 세포비율을 측정 및 분석하였다.
세포의 형태변화와 caspase 활성을 조사 하기위하여 actinomycin D (Sigma-Aldrich, USA)와 colcemid (Sigma-Aldrich, USA)를 사용하였고[15], 세포핵의 관찰은 SYTO® 13 (Invitrogen, USA)로 염색 후 BX41 fluorescence microscope (OLYMPUS, Japan)을 이용하였다.
암세포에서 NC-1의 apoptosis 유도 정도를 정량적으로 분석하기 위해, MuseTM Annexin V & Dead cell kit (MCH 100105, Millipore, USA)를 이용하여 측정하였다.
암세포의 형태적 변화를 확인하기 위해 현미경 관찰을 실시하였다. 각 세포를 96 well plate에 1×10⁴ cells/well로 분주하고 6시간 배양하여 안정화시킨 후에 물질을 처리하였다.
5 μl를 혼합한 용액 10μl를 첨가하여 상온의 암실에서 10분간 반응시켰다. 염색 10분 후에 형광현미경을 이용하여 핵의 형태변화를 관찰하였다.
용매 분획물 중 ethyl acetate 분획물이 암세포에 대한 높은 광역학활성이 나타나 광과민성물질 분리에 이용하였다. 물질을 분리하기 위하여 4차례의 TLC를 실시하였다.
분쇄된 시료의 중량 기준 10배량의 methanol : dichloromethane (1:1)을 넣어 250 rpm, 2시간 진탕 추출하였다. 추출은 3회 반복 추출하였으며, 정치시켜 상등액만 취해 filter paper (5C, 110, Advantech, Japan)로 여과 후 진공 농축기 (Rotary vacuum evaporator, EYELA N-1000, Tokyo, Japan)를 이용하여 농축하였다. 완전히 농축된 추출물은 순차적 용매분획법을 이용하여 hexane 분획물, ethyl acetate 분획물, 최종 methanol 분획물로 확보하여 냉장보관하며 실험에 이용하였다.

대상 데이터

본 실험에 사용한 인체 백혈병세포 U937 (KCLB 21593.1®)과 간암세포 SK-HEP-1 (KCLB 30052®)는 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank)에서 분양받았다.
세포 배양에 사용한 배지는 DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium, Gibco™, USA)과 RPMI 1640 (Gibco™, USA) 이며, FBS (Fetal Bovine Serum, Gibco™, USA)와 Penicillin-Streptomycin (Gibco™, USA), Trypsin-EDTA (Gibco™, USA)를 사용하였다.
1^®)과 간암세포 SK-HEP-1 (KCLB 30052^®)는 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank)에서 분양받았다. 세포의 배양은 10% FBS와 1% penicillin-streptomycin을 첨가한 RPMI 배지와 DMEM 배지를 각각 사용하였으며, 37℃, 5% CO₂ incubator (MCO-18AIC, Japan)에 배양하였다.
제주시 한경면에서 채취한 N. commune의 이물질 제거를 위해 흐르는 물에 2번 세척하여 40℃ dry oven에서 72시간 건조한 후 분말로 만들어 냉장 보관하며 실험에 사용하였다.

데이터처리

Statistical analysis was analyzed using one-way ANOVA p<0.05, dark conditions not significant.
통계처리

통계분석을 위해 Computer program Statistix 9.0 (Analytic Software, St. Paul, USA)를 사용하였다. Analysis of variance (ANOVA)와 Least Significant Different (LSD) (p<0.

이론/모형

Apoptosis 유도 확인을 위한 핵의 형태적 변화를 관찰하기 위해 형광염료 SYTO® 13을 이용하였다.
세포독성을 측정하기 위한 cell viability assay는 CelltiterGlo® 2.0 assay를 이용하여 측정하였다.
추출은 3회 반복 추출하였으며, 정치시켜 상등액만 취해 filter paper (5C, 110, Advantech, Japan)로 여과 후 진공 농축기 (Rotary vacuum evaporator, EYELA N-1000, Tokyo, Japan)를 이용하여 농축하였다. 완전히 농축된 추출물은 순차적 용매분획법을 이용하여 hexane 분획물, ethyl acetate 분획물, 최종 methanol 분획물로 확보하여 냉장보관하며 실험에 이용하였다.

성능/효과

11.50μM 처리한 결과 DNA laddering이 희미하게 보여졌는데 양성대조구의 결과와 함께 비교해 보면 DNA 단편화가 일어났으나 apoptosis 유발 중 핵산의 가수분해가 많이 이루어졌기 때문에 DNA smearing 현상이 나타난 것으로 추측된다.
19 ppm에서 double let으로 나타남으로써 chlorophyll a의 기본구조를 갖는 porphyrin 화합물이라는 것을 알 수 있었다. ¹³C-NMR 결과에서 55개의 carbon signal 이 확인되어 phytyl기가 결합된 것을 ¹H-NMR 결과와 동일하게 확인할 수 있었으며, 30~40 ppm 사이에 나타나는 phytyl기의 carbon signal을 확인하였다. NC-1의 ¹³C-NMR chemical shift값을 보면 keto carbon [δ189.
NC-1의 UV spectrum 측정 결과 405, 507, 535, 610, 667 nm 파장의 peak가 확인되어 chlorophyll a 유도체인 것으로 추측할 수 있었다. ¹H-NMR spectrum 결과, 4개의 methine기 signal이 8.55(5-H, s), 9.33(10-H, s), 9.48(15-H, s), 7.93(8¹-H, q) ppm에 각각 나타나 porphyrin 환을 갖는 화합물들에 특이적으로 나타나는 methine기 signal과 일치하는 것을 확인하였다[18]. Chlorophyll 화합물은 약 20개의 탄소로 phytyl기를 가지는데 ¹H-NMR spectrum의 결과에서 0.
commune 추출물을 Hexane, ethylacetate, methanol로 분획하여 U937과 SK-HEP-1 cell에 대해 광역학활 성을 확인하였고, ethylacetate 분획물에서 높은 광역학활성을 나타내어 물질 분리에 이용하였다. 4차례의 TLC를 통해 NC-1을 순수분리 하였으며, TLC와 HPLC를 이용하여 single spot 과 peak를 확인할 수 있었다. NMR과 FAB-MS 분석을 실시하여 구조 동정한 결과, NC-1은 분자량 870의 pheophytin a (C₅₅H₇₄N₄O₅)인 것을 확인하였다.
81과 82-vinyl carbons에 결합하고 있는 -H은 81–H (7.93, q), 82-H(H trans, 6.25, q), 82-H (H cis, 6.17, q)에서 확인할 수 있었고, 12C-CH3 signal이 3.19 ppm에서 double let으로 나타남으로써 chlorophyll a의 기본구조를 갖는 porphyrin 화합물이라는 것을 알 수 있었다.
69 ppm에서 signal이 확인되어 lactone 구조가 아니고, 20¹-C 위치에 -H기가 결합되어 있는 것을 알 수 있었다[6, 15, 18]. FAB-MS 분석을 실시한 결과, m/z 870.3에서 molecular peak를 확인할 수 있었다. NMR과 MS data를 종합해보면 NC-1은 870의 분자량을 가지는 Pheophytin a(C₅₅H₇₄N₄O₅)로 동정하였다(Fig.
형광염색한 결과 농도 의존적으로 전체적인 세포의 밀도가 감소하였고, 세포핵의 응축 현상과 DNA fragmentation 현상이 증가하는 것을 확인하였다. Flow cytometer를 이용한 apoptosis 정량적 분석과 DNA fragmentation 실험 결과에서도 두 세포 모두 NC-1의 처리 농도와 광의존적으로 apoptosis가 유도되었으며, 부유세포인 U937과부착세포인 SK-HEP-1 세포간에 감수성의 차이는 있었다. 본연구 결과 N.
NMR과 FAB-MS 분석을 실시하여 구조 동정한 결과, NC-1은 분자량 870의 pheophytin a (C₅₅H₇₄N₄O₅)인 것을 확인하였다. NC-1을 처리하고 광을 조사 하지 않은 처리구와는 달리, 광을 조사한 처리구에서 U937세포의 생육 억제와 apoptotic body가 형성되었고, SK-HEP-1세포는 부착력을 상실하여 부유하고 밀도가 감소하며, apoptotic body가 형성되는 것을 관찰하였다. 이는 NC-1이 암세포에 대해 광역학활성을 가지는 것으로 확인하였다.
반면, NC-1을 처리하고 광을 조사하지 않은 처리구에서는 원형의 균일하게 형광 염색된 세포핵을 관찰하였다. NC-1을 처리하고 광을 조사한 처리구에서 apoptosis가 유도된 세포에서 전형적으로 나타나는 세포핵 응축 등이 관찰됨으로써 NC-1의 세포사멸은 광역학적 apoptosis 유도와 밀접한 연관이 있음을 확인하였다.
U937과 SK-HEP-1 세포의 관찰한 결과 음성대조 구에서 원형으로 온전한 형태의 균일하게 형광 염색된 세포핵을 관찰하였으며, 양성대조구에서 apoptosis의 전형적인 현상으로 핵이 응축되어 크기가 다른 형광색의 세포핵을 관찰하였다. NC-1을 처리하고 광을 조사한 처리구에서 전체적으로 세포 밀도가 감소하고, 핵이 응축되며 apoptotic body가 형성된 것을 관찰할 수 있었다. 또한, NC-1의 처리 농도가 증가함에 따라 apoptotic body 형성도 증가하는 것을 확인하였다.
물질의 구조를 분석하기 위해 UV/Vis spectrophotometer 측정, NMR 분석과 FAB-MS 측정을 실시하였으며 이들 결과를 토대로 구조를 결정하였다. NC-1의 UV spectrum 측정 결과 405, 507, 535, 610, 667 nm 파장의 peak가 확인되어 chlorophyll a 유도체인 것으로 추측할 수 있었다. ¹H-NMR spectrum 결과, 4개의 methine기 signal이 8.
이는 광과민성물질이 세포에 따라 축적되는 위치 및 정도가 다르며, 세포사멸의 기전이 다양한 경로를 통해 이루어지기 때문에 세포간 차이가 있다는 연구와 일치한다[23]. NC-1의 caspase activity 측정 결과 U937 세포에서 일정 농도까지 농도가 증가할수록 caspase의 발현이 증가 하다가 감소하는 현상이 나타났다. 이는 처리 농도가 높아 짧은 시간 안에 세포손상이 일어났고, 세포 파괴 및 그로 인한 효소의 불활성화로 동일 조건 내에서 농도가 낮은 처리구보다 활성이 낮게 나타난 것으로 추측된다[5].
5~1 ppm부근에 multiple signal로 나타나게 된다. NC-1의 분석 결과에서 phytyl기의 signal이 확인되어 phytyl 기가 결합된 chlorophyll 유도체인 것을 확인할 수 있었고, -1.64 ppm에 signal이 확인되어 porphyrin 환 중심의 Mg이온이 떨어져 pyrrole ring이 형성된 것을 확인할 수 있었다. 8¹과 8²-vinyl carbons에 결합하고 있는 -H은 8¹–H (7.
cell blebbing 등의 형태적 변화를 관찰하였으며, 부착력을 상실한 세포가 부유하는 것을 볼 수 있었다. NC-1의 처리 농도가 증가함에 따라 전체적인 세포밀도가 유의적으로 감소함을 알 수 있었으며, 이러한 결과를 바탕으로 NC-1은 암세포에 대해 광역학적 세포사멸을 유도하는 것으로 추측하였다.
4차례의 TLC를 통해 NC-1을 순수분리 하였으며, TLC와 HPLC를 이용하여 single spot 과 peak를 확인할 수 있었다. NMR과 FAB-MS 분석을 실시하여 구조 동정한 결과, NC-1은 분자량 870의 pheophytin a (C₅₅H₇₄N₄O₅)인 것을 확인하였다. NC-1을 처리하고 광을 조사 하지 않은 처리구와는 달리, 광을 조사한 처리구에서 U937세포의 생육 억제와 apoptotic body가 형성되었고, SK-HEP-1세포는 부착력을 상실하여 부유하고 밀도가 감소하며, apoptotic body가 형성되는 것을 관찰하였다.
3에서 molecular peak를 확인할 수 있었다. NMR과 MS data를 종합해보면 NC-1은 870의 분자량을 가지는 Pheophytin a(C₅₅H₇₄N₄O₅)로 동정하였다(Fig. 3).
5A). SK-HEP-1 세포도 NC-1을 처리 하고 광을 조사한 처리구에서 세포독성이 나타났으며, 농도의 증가에 따라 세포독성이 증가하는 것을 확인하였다(Fig. 5B). U937 세포와 SK-HEP-1 세포 모두 NC-1을 처리하고 광을 조사하지 않은 곳에서는 세포독성이 나타나지 않았다.
SK-HEP-1 세포에서는 5.75 μM 이상의 농도로 물질을 처리하고 광을 조사하면 농도 의존적인 caspase 활성이 나타났으며, 그보다 낮은 처리구나 광을 조사하지 않은 처리구에서는 음성대조구 정도의 효소 활성이 나타났다(Fig. 6B).
U937 세포에서 NC-1을 11.50 μM 처리하고 광을 조사한 처리구의 live cell은 6.35% 였고, 음성대조구의 live cell은 7.83%로 나타나 NC-1 처리에 의한 높은 세포사멸 효과가 있음을 확인하였다(Fig.8B).
U937 세포의 결과에서 광을 조사하고 2.87 μM 이상의 농도를 처리하였을 때 농도 증가와 유의하게 세포독성이 증가하는 것을 확인하였고, 23.00 μM 처리시 가장 높은 세포독성이 나타났다(Fig. 5A).
U937 세포의 효소 활성을 측정한 결과 광 조사한 처리구에서 11.50 μM 농도까지 농도 의존적으로 caspase-3/7의 발현이 증가하였으나, 23.00 μM 처리구 에서는 활성이 다소 감소하는 것으로 나타났다(Fig. 6A).
또한 annexin V & dead cell kit의 dead cell marker는 세포막의 구조가 붕괴되어 손상에 대한 지표로써 살아있는 건강한 세포와 early apoptosis가 진행된 세포에서는 염색되지 않으므로 apoptosis의 발현 및 진행 정도를 확인할 수 있다[17]. U937과 SK-HEP-1 세포에서 NC-1의농도 의존적으로 apoptosis 유도된 정도가 증가한 것을 확인하였고, 광을 조사하지 않은 처리구에서는 음성대조구인 DMSO 처리구와 유사한 정도를 나타냈다. U937 세포에서 NC-1을 11.
cell blebbing 등의 형태적 변화를 관찰하였으며, 부착력을 상실한 세포가 부유하는 것을 볼 수 있었다. NC-1의 처리 농도가 증가함에 따라 전체적인 세포밀도가 유의적으로 감소함을 알 수 있었으며, 이러한 결과를 바탕으로 NC-1은 암세포에 대해 광역학적 세포사멸을 유도하는 것으로 추측하였다.
남조류 N. commune의 ethyl acetate분획물로부터 분리․정제된 광역학활성 물질(NC-1)은 TLC 상에서 전개용매 hexane : chloroform : ethyl acetate (4:1:1)으로 전개한 결과, R_f 값이 0.45로 나타났으며(Fig. 2A), HPLC 분석을 통한 분리도를 확인 결과 R_t 5.208 에서 single peak를 확인할 수 있었다(Fig. 2B). 물질의 구조를 분석하기 위해 UV/Vis spectrophotometer 측정, NMR 분석과 FAB-MS 측정을 실시하였으며 이들 결과를 토대로 구조를 결정하였다.
8B). 동일한 조건에서 SK-HEP-1 세포의 live cell은 37.94%로 음성대조구의 결과인 8.95%보다 낮은 세포사멸 효과가 나타난 것을 확인하였다(Fig. 9B). 이것은 앞선 실험 결과와 마찬가지로 물질에 대한 세포간 감수성 차이에 의한 것으로 판단된다.
NC-1을 처리하고 광을 조사한 처리구에서 전체적으로 세포 밀도가 감소하고, 핵이 응축되며 apoptotic body가 형성된 것을 관찰할 수 있었다. 또한, NC-1의 처리 농도가 증가함에 따라 apoptotic body 형성도 증가하는 것을 확인하였다. 반면, NC-1을 처리하고 광을 조사하지 않은 처리구에서는 원형의 균일하게 형광 염색된 세포핵을 관찰하였다.
6A). 반면, 광을 조사하지 않은 처리구에선 음성대조구 정도의 효소 활성이 나타나는 것을 확인하였다. SK-HEP-1 세포에서는 5.
Flow cytometer를 이용한 apoptosis 정량적 분석과 DNA fragmentation 실험 결과에서도 두 세포 모두 NC-1의 처리 농도와 광의존적으로 apoptosis가 유도되었으며, 부유세포인 U937과부착세포인 SK-HEP-1 세포간에 감수성의 차이는 있었다. 본연구 결과 N. commune 에서 분리한 pheophytin a가 U937과 SK-HEP-1 세포에 대해 광역학적 apoptosis 유도 활성을 가지는 것을 확인하였다. 본 실험에 사용한 형광등을 대신하여 물질의 최대흡수파장으로 광을 조사한다면 보다 뛰어난 광역학적 apoptosis를 유도될 것으로 사료된다[25].
세포독성 실험 결과에서 NC-1 처리 후 광을 조사하면 처리 농도가 증가 함에 따라 U937과 SK-HEP-1 세포의 생육이 유의하게 억제되는 것을 확인하였고, 광 의존적 · 농도 의존적 세포사멸을 유도 하는 것을 확인하였다. 세포간 사멸정도를 비교하였을 때, 동일한 처리 농도와 시간에서 U937 세포가 SK-HEP-1 세포보다 높은 세포사멸을 보였다. 이는 광과민성물질이 세포에 따라 축적되는 위치 및 정도가 다르며, 세포사멸의 기전이 다양한 경로를 통해 이루어지기 때문에 세포간 차이가 있다는 연구와 일치한다[23].
U937 세포와 SK-HEP-1 세포 모두 NC-1을 처리하고 광을 조사하지 않은 곳에서는 세포독성이 나타나지 않았다. 세포간 사멸한 정도는 동일한 처리 농도와 시간에서 U937 세포가 SKHEP-1 세포보다 높은 세포사멸을 보였다.
세포독성 실험 결과에서 NC-1 처리 후 광을 조사하면 처리 농도가 증가 함에 따라 U937과 SK-HEP-1 세포의 생육이 유의하게 억제되는 것을 확인하였고, 광 의존적 · 농도 의존적 세포사멸을 유도 하는 것을 확인하였다.
SK-HEP-1 세포는 동일한 조건에서 U937 세포에 비해 낮은 활성이 나타났다. 이와 같은 결과를 통해 NC-1에 의한 세포사멸 기전에 caspase가관여하는 것을 확인하였다. 형광염색한 결과 농도 의존적으로 전체적인 세포의 밀도가 감소하였고, 세포핵의 응축 현상과 DNA fragmentation 현상이 증가하는 것을 확인하였다.
이와 같은 결과를 통해 NC-1에 의한 세포사멸 기전에 caspase가관여하는 것을 확인하였다. 형광염색한 결과 농도 의존적으로 전체적인 세포의 밀도가 감소하였고, 세포핵의 응축 현상과 DNA fragmentation 현상이 증가하는 것을 확인하였다. Flow cytometer를 이용한 apoptosis 정량적 분석과 DNA fragmentation 실험 결과에서도 두 세포 모두 NC-1의 처리 농도와 광의존적으로 apoptosis가 유도되었으며, 부유세포인 U937과부착세포인 SK-HEP-1 세포간에 감수성의 차이는 있었다.

후속연구

commune 에서 분리한 pheophytin a가 U937과 SK-HEP-1 세포에 대해 광역학적 apoptosis 유도 활성을 가지는 것을 확인하였다. 본 실험에 사용한 형광등을 대신하여 물질의 최대흡수파장으로 광을 조사한다면 보다 뛰어난 광역학적 apoptosis를 유도될 것으로 사료된다[25]. 따라서, N.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	암은 무엇인가?	암(cancer)은 정상 세포가 어떤 자극에 의해서 유전자의 형질전환이 발생되면 형태학, 생물학, 물리학, 면역학적 행동이 변한 변형 세포가 유전적으로 대를 이어 무절제한 증식을 함으로써 형성된 악성종양을 말하고, 전 세계적으로 인간의 생명을 위협하는 가장 중요한 요소로 지목되고 있다. 우리나라에 서도 암으로 인한 사망률이 해마다 높아지고 있으며, 국내 사망원인 중 1위를 차지하고 있는 아주 중요한 질환이다[9].
	기존에 알려진 암에 대한 치료법은 무엇으로 구분되는가?	기존에 알려진 암에 대한 치료법은 크게 수술치료, 화학요법, 방사선치료로 구분되나, 대부분의 치료가 정상적인 장기나 조직에 상해를 주며, 면역기능저하, 조혈장애, 유전자 손상 등의 부작용을 유발한다[10]. 하지만 광역학적치료(Photodynamic Therapy, PDT)는 암세포에 국부적 집중치료로 다른 조직과 장기에 영향이 없어 환자의 부담과 부작용을 크게 경감할 수 있어 최근에 선진국을 중심으로 많이 행해지고 있다.
	광역학적치료는 무엇인가?	광역학치료란 광감각제(photosensitizer)가 빛과 산소에 의해 화학적 반응을 일으킴으로써 단일 산소(singlet oxygen)와이에 의해 유발되는 자유라디칼이 암세포만 선택적으로 파괴 하는 치료법이다[13]. 광감각제를 정맥주사하면 혈액 속에서 low density lipoprotein (LDL)과 빠르게 결합하여 전신으로 순환하게 되고 암세포에 쉽게 흡수된다.

참고문헌 (26)

Cho, I. J., Gam, C. W., Kim, K. T. and Park, D. I. 2007. Apoptosis of human lung carcinoma cells through the inhibition of Bcl-2 expression and activation of caspase by chungjogupae-tang. Kor. J. Physiol. Pharmacol. 21, 93-97.
Choi, Y. D., Yoon, S. G. and Chea, M. J. 2008. Cancer imaging and photodynamic therapy using photosensitizers. Polymer Sci. Technol. 19, 138-145.
Choi, Y. H. 2012. Induction of apoptosis and inhibition of NO production by piceatannol in human lung cancer A549 cells. J. Life Sci. 22, 815-822.
Diao, Y., Zhang, Y. and Han, H. 2015. In vitro antimicrobial activities of Nostoc commune extracts. Environ. Earth Sci. Res. 2, 1-4.
Granado-Serrano, A. B., Martin, M. A., Bravo, L., Goya, L. and Ramos, S. 2006. Quercetin induces apoptosis via caspase activation, regulation of Bcl-2, and inhibition of PI-3-kinase/Akt and ERK pathways in a human hepatoma cell line (HepG2). J. Nutr. 136, 2715-2721.

상세보기
Ina, A., Hayashi, K., Nozaki, H. and Kamei, Y. 2007. Pheophytin a, a low molecular weight compound found in the marine brown alga Sargassum fulvellum, promotes the differentiation of PC12 cells. Int. J. Dev. Neurosci. 25, 63-68.

상세보기
Itoh, T., Tsuchida, A., Muramatsu, Y., Ninomiya, M., Ando, M., Tsukamasa, Y. and Koketsu, M. 2014. Antimicrobial and anti-inflammatory properties of nostocionone isolated from Nostoc commune Vauch and its derivatives against Propionibacterium acnes. Anaerobe 27, 56-63.

상세보기
Jheon, S. H. 2007. Photodynamic therapy. J. Kor. Med. Assoc. 50, 1119-1129.
Kang, H. I., Kim, J. Y., Cho, H. D., Park, K. W., Kang, J. S. and Seo, Jr. K. 2010. Resveratrol induces apoptosis in primary human prostate cancer cells. J. Kor. Soc. Food Sci. Nutr. 39, 1119-1125.
Kim, B. M., Kim, G. T., Kim, E. J., Lim, E. G., Kim, S. Y. and Kim, Y. M. 2016. Extract from Artemisia annua Linn induces apoptosis through the mitochondrial signaling pathway in HepG2 Cells. J. Kor. Soc. Food Sci. Nutr. 45, 1708-1716.
Kim, E. J., Kim, G. T., Kim, B. M., Lim, E. G., Kim, S. Y. and Kim, Y. M. 2016. Apoptosis-induced effects of extract from Artemisia annua Linne by modulating Akt/mTOR/GSK- $3{\beta}$ signal pathway in AGS human gastric carcinoma cells. J. Kor. Soc. Food Sci. Nutr. 45, 1257-1264.
Kim, G. H., Lee, M. H., Han, M. H., Park, C., Hong, S. H. and Choi, Y. H. 2013. Induction of apoptosis by citri pericarpium methanol extract through reactive oxygen species generation in U937 human leukemia cells. J. Life Sci. 23, 1057-1063.
Kim, H. G., Chung, P. S., Kim, S. H., Lee, S. H. and Rhee, C. K. 2005. The anticancer effect and mechanism of photodynamic therapy using 9-hydroxypheophorbide-alpha and 630 nm diode laser on heterotransplanted squamous cell carcinoma of head and neck. Kor. J. Otolaryngol-Head Neck Surg. 48, 765-770.
Kim, H. H., Kong, I. K. and Min, G. 2017. S-allylcysteine-mediated activation of caspases and inactivation of PARP to inhibit proliferation of HeLa. J. Life Sci. 27, 164-171.
Kim, K. K., Kawano, Y. and Yamazaki, Y. 2003. A novel porphyrin photosensitizer from bamboo leaves that induces apoptosis in cancer cell lines. Anticancer Res. 23, 2355-2361.
Kim, S. K., Byun, H. G., Park, P. J. and Adachi, K. 2002. Purification and structure of antioxidative substance derived from Tetraselmis suecica. J. Kor. Fish Soc. 35, 155-161.
Kim, T. Y., Jang, S., A, Chae, Y. B. and Bak, J. P. 2016. Antioxidant and protective effects of Leonurus sibiricus L. extract on ultraviolet B (UVB)-induced damage in human keratinocytes. Kor. J. Plant Res. 29, 11-19.
Lee, J. Y., Kim, M. K., Ha, J. Y., Kim, Y. G., Hong, C. O., Kim, S. Y., Kim, C. H. and Kim, K. K. 2014. Isolation and identification of a photosensitizer from Pueraria thunbergiana leaves that induces apoptosis in SK-HEP-1 cells. J. Life Sci. 24, 242-251
Ninomiya, M., Satoh, H., Yamaguchi, Y., Takenaka, H. and Koketsu, M. 2011. Antioxidative activity and chemical constituents of edible terrestrial alga Nostoc commune Vauch. Biosci. Biotechnol. Biochem. 75, 2175-2177.

상세보기
Nobili, S., Lippi, D., Witort, E., Donnini, M., Bausi, L., Mini, E. and Capaccioli, S. 2009. Natural compounds for cancer treatment and prevention. Pharmacol. Res. 59, 365-378.

상세보기
Patterson, G. M. L., Larsen, L. K. and Moore, R. E. 1994. Bioactive natural products from blue-green algae. J. Appl. Phycol. 6, 151-157.

상세보기
Plaza, M., Santoyo, S., Jaime, L., Garcia-Blairsy Reina, G., Herrero, M., Senorans, F. J. and Ibanez, E. 2010. Screening for bioactive compounds from algae. J. Pharm. Biomed. Anal. 51, 450-455.

상세보기
Rosenkranz, A. A., Jans, D. A. and Sobolev, A. S. 2000. Targeted intracellular delivery of photosensitizers to enhance photodynamic efficiency. Immunol. Cell Biol. 78, 452-464.

상세보기
Tamaru, Y., Takani, Y., Yoshida, T. and Sakamoto, T. 2005. Crucial role of extracellular polysaccharides in desiccation and freezing tolerance in the terrestrial cyanobacterium Nostoc commune. Appl. Environ. Microbiol. 71, 7327-7333.

상세보기
Varriale, L., Crescenzi, E., Paba, V., Mazziotti Di Celso, B. and Palumbo, G. 2000. Selective light-induced modulation of Bcl-XL and bax expressions in indocyanine green-loaded U937 cells: Effects of continuous or intermittent photo-sensitization with low IR-light using a 805-nm diode laser. J. Photochem. Photobiol. B: Biol. 57, 66-75
Wolf, B. B. and Green, D. R. 1999. Suicidal tendencies: Apoptotic cell death by caspase family proteinases. J. Biol. Chem. 274, 20049-20052.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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