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문제 정의
- 그리고 분자생물학적 기법을 이용한 생태 및 유전학적 특성을 규명하는 연구도 요구된다. 이 연구는 한반도 해역(제주, 왕돌초, 울릉도)에 서식하는 자리돔(C. notata) 집단 간의 형태 및 유전적 특성 확인을 위한 시험연구로 그 결과를 보고하고자 한다.
제안 방법
- PCR의 조건은 94℃에서 10분간 최초 열변성 시킨 후 35 cycles 동안 94℃에서 30초 변성반응, 54℃에서 40초 결합반응, 그리고 72℃에서 40초 신장반응을 반복하였으며, 마지막 신장반응은 10분간 실시하였다. DNA의 증폭여부는 전기영동을 통해 확인하였다. 증폭이 확인된 PCR 산물은 제조사의 표준절차에 따라 QIAquick PCR purification kit(Qiagen)을 사용하여 정제하였으며 ABI PRISM 3730XL Analyzer(Applied Biosystems, USA)로 염기서열을 결정하였다.
- Genomic DNA는 부표본을 잘라 잘게 다진 후 Genomic DNA Extraction kit(Bioneer)의 제조사 표준 절차에 따라 추출하였다. 추출된 genomic DNA는 PCR 및 forward primer Cr-A(5'-TTC CAC CTC TAA CTC AAG CTA G-3')와 reverse primer Cr-E(5'-CCT GAA GTA GGA ACC AGA TG-3')(Lee et al.
- PCR 반응액은 총 25 µL의 양으로 약 50 ng의 DNA, 1X로 희석된 10x PCR buffer, 1 mM의 MgCl2, 1 mM의 dNTPs, 50 pM의 forward 및 reverse primer, 1 U의 Ex Tag, 증류수를 혼합하여 제조하였다.
- , 1 mM의 dNTPs, 50 pM의 forward 및 reverse primer, 1 U의 Ex Tag, 증류수를 혼합하여 제조하였다. PCR의 조건은 94℃에서 10분간 최초 열변성 시킨 후 35 cycles 동안 94℃에서 30초 변성반응, 54℃에서 40초 결합반응, 그리고 72℃에서 40초 신장반응을 반복하였으며, 마지막 신장반응은 10분간 실시하였다. DNA의 증폭여부는 전기영동을 통해 확인하였다.
- 계수 형질은 등지느러미의 기조 수(Dorsal fin ray), 뒷지느러미의 기조 수(Anal fin ray), 배지느러미의 기조 수(Pelvic fin ray), 측선상부비늘 수(Scale above lateral line), 측선하부비늘 수(Scale below lateral line)를 해부현미경(OLYMPUS SZX7, ×0.8)을 사용하여 계수하였다.
- 8)을 사용하여 계수하였다. 계측 형질은 전장(TL, Total length), 체장(SL, Standard length), 체고(BD, Body depth), 두장(HL, Head length), 눈길이(ED, Eye diameter), 양안 간격(IW, Interorbital width), 주둥이 길이(SD, Snout distance), 꼬리자루높이(CPH, Caudal peduncle height), 가장 긴 등지느러미 길이(LDS, Longest dorsal spine length), 두 번째 뒷지느러미 길이(SAP, Second anal spine length), 배지 느러미 길이(PFL, Pelvic fin length)를 Vernier calipers를 사용하여 직선거리를 기준으로 0.1 mm까지 측정하였다. 전장(TL)과 체장(SL)을 제외한 모든 형질은 지역에 따라 개체의 크기가 상이하기 때문에 오류를 최소화 하고자 표준체장(SL, standard length)을 기준으로 각 부위를 백분율로 변환하였다.
- 2003)을 통해 확인하였다. 자리돔 개체들 간의 유연관계는 Genbank에 게재된 C. limbata(EF439267.1, EF439266.1, EF439193.1) 염기서열 과의 비교를 통해 분석하였다. Neighbor Joining tree는 MEGA 5.
- 1 mm까지 측정하였다. 전장(TL)과 체장(SL)을 제외한 모든 형질은 지역에 따라 개체의 크기가 상이하기 때문에 오류를 최소화 하고자 표준체장(SL, standard length)을 기준으로 각 부위를 백분율로 변환하였다. 통계분석은 SPSS program ver.
- DNA의 증폭여부는 전기영동을 통해 확인하였다. 증폭이 확인된 PCR 산물은 제조사의 표준절차에 따라 QIAquick PCR purification kit(Qiagen)을 사용하여 정제하였으며 ABI PRISM 3730XL Analyzer(Applied Biosystems, USA)로 염기서열을 결정하였다.
- 추출된 genomic DNA는 PCR 및 forward primer Cr-A(5'-TTC CAC CTC TAA CTC AAG CTA G-3')와 reverse primer Cr-E(5'-CCT GAA GTA GGA ACC AGA TG-3')(Lee et al. 1995)를 사용하여 미토콘드리아 genome 내 Control Region의 일부(430 bp)를 증폭시켰다.
- 제주도와 울릉도 시료는 어선 어망을 이용하여 획득하였고 왕돌초 시료는 SCUBA를 통해 족대를 이용하여 채집하였다. 획득한 시료는 냉장 보관하여 실험실로 운반한 후 계수 및 계측형질을 조사하였다. DNA 부표본은 지느러미를 절취하여 95% ethanol에 보관하였으며, 전체 표본은 70% ethanol에 고정하였다.
대상 데이터
- 세 지역에서 채집한 자리돔(C. notata)으로부터 확보한 60개의 control region(CR) 염기서열은 GenBank에 등록하였다(KM003884-KM003943). Control region 영역의 염기서열 길이 범위는 430-432 bp(제주도; 430 bp, 왕돌초; 432 bp, 울릉도; 432 bp)였고, 염기서열 간 유사도 범위는 97.
- 시료 채집지인 제주와 동해는 동중국해에서 쿠로시오로부터 분리된 대마난류에 영향을 받는다. 대마난류는 대한해협을 통하여 동해남부로 유입되고 동해 북부는 러시아 연안과 북한연안을 따라 리만한류와 북한한류가 남하하면서, 대만난류와 마찬가지로 강한 계절 변화를 보여 해양환경에 큰 영향을 미친다(NRF 2006; Park et al.
- 이 연구에 사용된 시료는 2012년 7-8월 사이에 제주 모슬포, 동해 왕돌초와 울릉도에서 수집하였다. 제주도와 울릉도 시료는 어선 어망을 이용하여 획득하였고 왕돌초 시료는 SCUBA를 통해 족대를 이용하여 채집하였다.
- 이 연구에 사용된 시료는 2012년 7-8월 사이에 제주 모슬포, 동해 왕돌초와 울릉도에서 수집하였다. 제주도와 울릉도 시료는 어선 어망을 이용하여 획득하였고 왕돌초 시료는 SCUBA를 통해 족대를 이용하여 채집하였다. 획득한 시료는 냉장 보관하여 실험실로 운반한 후 계수 및 계측형질을 조사하였다.
데이터처리
- 0 (SPSS Inc, Chicago, IL)를 이용하여 ANOVA 분석, 판별 분석 그리고 상관분석을 실시하였다. ANOVA 분석은 각 형태형질의 유의성을 확인하기 위하여 실시하였으며 판별 분석은 각 개체들이 속하는 지역을 확인하고 형태형질에 따라 지역적으로 분류하기 위해 실시하였다. 마지막으로 상관분석은 판별분석 결과에서 얻은 개체들의 좌표와 각 형질간의 상관관계를 분석하여 판별분석과 함께 도식화하였다.
- ANOVA 분석은 각 형태형질의 유의성을 확인하기 위하여 실시하였으며 판별 분석은 각 개체들이 속하는 지역을 확인하고 형태형질에 따라 지역적으로 분류하기 위해 실시하였다. 마지막으로 상관분석은 판별분석 결과에서 얻은 개체들의 좌표와 각 형질간의 상관관계를 분석하여 판별분석과 함께 도식화하였다.
- 시료의 염기서열은 BioEdit 7.1.3을 이용하여 편집하였고, MEGA 5.05에서 clustal W을 사용하여 정렬하였으며 동일한 지역 내의 유사도와 다른 지역 간의 유사도를 확인하였다. 염기서열의 AT 함유량(content)과 염기서열 길이는 DnaSP 5.
- 전장(TL)과 체장(SL)을 제외한 모든 형질은 지역에 따라 개체의 크기가 상이하기 때문에 오류를 최소화 하고자 표준체장(SL, standard length)을 기준으로 각 부위를 백분율로 변환하였다. 통계분석은 SPSS program ver. 12.0 (SPSS Inc, Chicago, IL)를 이용하여 ANOVA 분석, 판별 분석 그리고 상관분석을 실시하였다. ANOVA 분석은 각 형태형질의 유의성을 확인하기 위하여 실시하였으며 판별 분석은 각 개체들이 속하는 지역을 확인하고 형태형질에 따라 지역적으로 분류하기 위해 실시하였다.
이론/모형
- 1) 염기서열 과의 비교를 통해 분석하였다. Neighbor Joining tree는 MEGA 5.05를 이용하여 Tamura et al. (2011)의 방법에 따라 1000번의 bootstrapping을 이용하여 실시하였다.
- 시료의 계수와 계측 형질은 Kim and Kim (1996)의 방법으로 측정 및 비교하였다. 계수 형질은 등지느러미의 기조 수(Dorsal fin ray), 뒷지느러미의 기조 수(Anal fin ray), 배지느러미의 기조 수(Pelvic fin ray), 측선상부비늘 수(Scale above lateral line), 측선하부비늘 수(Scale below lateral line)를 해부현미경(OLYMPUS SZX7, ×0.
- 05에서 clustal W을 사용하여 정렬하였으며 동일한 지역 내의 유사도와 다른 지역 간의 유사도를 확인하였다. 염기서열의 AT 함유량(content)과 염기서열 길이는 DnaSP 5.10(Rozas et al. 2003)을 통해 확인하였다. 자리돔 개체들 간의 유연관계는 Genbank에 게재된 C.
- 1 (Exoffier 2005)에 포함된 유전자형 다양성(haplotype diversity)과 염기 다양성(nucleotide diversity) 평가를 통해 분석하였다. 유전자형 네트워크(haplotype network)는 Arlequin Ver. 3.1에서의 분석을 통해 얻은 유전자형 빈도표와 minimum spanning tree를 기반으로 시각화하였다.
- 자리돔 개체들의 지역별 유전특성은 Arlequin Ver 3.1 (Exoffier 2005)에 포함된 유전자형 다양성(haplotype diversity)과 염기 다양성(nucleotide diversity) 평가를 통해 분석하였다. 유전자형 네트워크(haplotype network)는 Arlequin Ver.
성능/효과
- notata)으로부터 확보한 60개의 control region(CR) 염기서열은 GenBank에 등록하였다(KM003884-KM003943). Control region 영역의 염기서열 길이 범위는 430-432 bp(제주도; 430 bp, 왕돌초; 432 bp, 울릉도; 432 bp)였고, 염기서열 간 유사도 범위는 97.3-97.8%(제주도; 97.3%, 왕돌초; 97.6%, 울릉도 97.8%)로 확인되었다. 지역 간 유사도 범위는 97.
- 8%)로 확인되었다. 그리고 자리돔(C. notata)과 근연관계에 있는 C. limbata과 함께 작성한 neighbor-joining 계통수를 살펴본 결과에 따르면 한국산 자리돔은 단계통군으로 확인하였다(Fig. 1).
- 세 지역 자리돔의 유전자형을 분석한 결과, 60개체 중 53개의 유전자형을 확인하였으며 산개분포형 네트워크를 보여주었다. 하지만 일반적으로 타 연구에서는 적은 수의 유전자형을 확인하였다.
- 세 지역에서 채집된 자리돔 control region의 유전자형(haplotype)수는 제주도 18개(다양도 지수: 1.000 ± 0.019, 0.064 ± 0.033), 왕돌초 23개(다양도 지수; 0.996 ± 0.013, 0.051 ± 0.262), 울릉도 18개(다양도 지수; 0.987 ± 0.023, 0.025 ± 0.014)로 나타났다.
- 왕돌초 자리돔은 BD(47.4 ± 2.6%), IW(10.7 ± 0.7%), CPH(14.5 ± 0.4%)를 포함하는 총 3개의 계측 형질들이 세 지역 중 가장 크게 나타났다.
- 이에 따르면 이 연구에 이용된 모든 시료는 최고연령의 성체(제주도; 평균 107.7 ± 5.6 mm, 왕돌초; 평균 146 ± 10.3 mm, 울릉도; 평균 140.1 ± 6.8 mm)로 판단된다.
- 자리돔의 형태분석에 사용된 5개의 계수 형질 모두 지역 간의 차이가 없었지만 9개의 계측 형질은 모두 지역 간의 유의한 차이를 보였다(Table 1). 하지만 측선하부비늘 수를 8-9개로 보고한 Kim and Kim (1996)과는 다르게 이번 연구에서는 측선하부비늘수가 10개로 확인되어 차이가 나타났다.
- 전장의 크기는 왕돌초, 울릉도, 제주도 순이었으며 형태 비율에 대한 차이는 제주 자리돔은 HL(28.5 ± 1.6%), ED(9.3 ± 0.5%), SD(6.1 ± 1.0%), LDS(16.4 ± 1.0%), SAP(17.2 ± 1.5%), 그리고 PFL(29.7 ± 1.7%)를 포함하는 총 6개의 계측 형질이 세 지역 중 가장 크게 나타났다.
- 8%)로 확인되었다. 지역 간 유사도 범위는 97.5-97.7%(제주도-왕돌초; 97.5%, 제주도-울릉도; 97.6%, 왕돌초-울릉도; 97.7%)로 높았으며 AT 함유랑(content) 범위는 65.6-67.5%(제주도; 67.5%, 왕돌초; 65.6%, 울릉도; 65.8%)로 확인되었다. 그리고 자리돔(C.
- 2). 판별 적중률은 제주 자리돔이 18개체 중 17개체(99.4%), 왕돌초 자리돔은 24개체 중 19개체(73.2%), 울릉도 자리돔은 18개체 중 17개체(99.4%)로 총 60개체 중 50개체(88.3%)가 올바르게 구분되었다. 판별분석 결과에서 나온 개체들과 각 형질 간의 상관분석을 분석한 결과, Table 1의 결과와 같은 결과를 보였으며 IW, BD, SD, HL, 그리고 ED은 세 지역의 자리돔을 구분하는 대표적인 형질인 것으로 나타났다(Fig.
- 3%)가 올바르게 구분되었다. 판별분석 결과에서 나온 개체들과 각 형질 간의 상관분석을 분석한 결과, Table 1의 결과와 같은 결과를 보였으며 IW, BD, SD, HL, 그리고 ED은 세 지역의 자리돔을 구분하는 대표적인 형질인 것으로 나타났다(Fig. 2, Table 2).
- 판별분석은 9가지의 계측형질을 모두 포함하여 분석한 결과, Function 1은 ED, SD, PFL, LSD, HL, 그리고 IW 순으로 왕돌초-울릉도 자리돔과 제주 자리돔을 구분하는 주 요인으로 판별점수는 61.1%이었다. Function 2는 IW, SD, BD, PFL, CPH, 그리고 SAP 순으로 제주-왕돌초 자리돔과 울릉도 자리돔을 구분하는 주요인으로 판별점수는 33.
후속연구
- 이러한 연구들은 환경적 요인과 생물 반응 연구가 함께 진행되어야 한다는 것을 보여주는 선행연구라 할 수 있다. 그러므로 이번 연구는 해양 생태계 변화와 생물 반응을 추적하기 위한 방법론 탐색에 대한 시험 연구로써, 향후 다양한 수산생물에 활용될 수 있을 것으로 예상된다.
- notata) 관련 기초연구는 형태적 특징 분류(Kim and Kim 1996), 자리돔과 어류의 분자계통학적 위치(Koh and Park 2007), 산란, 번식 시기(Ochi 1986) 등의 분류 및 생태특징에 대한 연구가 주로 이루어져 있다. 그러므로 향후 자리돔의 동태 변화를 이해하기 위해 개체군의 성장률, 크기 구조, 수명, 번식시기 등의 변화패턴에 대한 연구가 필요하다. 그리고 분자생물학적 기법을 이용한 생태 및 유전학적 특성을 규명하는 연구도 요구된다.
- 그러므로 향후 자리돔의 동태 변화를 이해하기 위해 개체군의 성장률, 크기 구조, 수명, 번식시기 등의 변화패턴에 대한 연구가 필요하다. 그리고 분자생물학적 기법을 이용한 생태 및 유전학적 특성을 규명하는 연구도 요구된다. 이 연구는 한반도 해역(제주, 왕돌초, 울릉도)에 서식하는 자리돔(C.
- 앞으로, 국내에 서식하는 자리돔의 더 많은 유전자풀을 분석하고 형태형질 변화에 따른 유전형질 변이를 확인하기 위해 다양한 마커를 사용한 추가적인 분석이 필요하다. 또한, 서식지와 생태특성이 각 지역별 자리돔에 미치는 영향을 종합적으로 연구해볼 필요가 있다고 판단된다. 마지막으로 기후변화와 같은 서식지 환경 차이에 의해 생물의 지리적 분포 및 종 변이가 발생됨에 따라 수산자원의 변화에 영향을 미칠 가능성이 있기 때문에 이에 대응하는 기초 연구가 필요하며 본 연구는 추후 자리돔 연구에 대한 기초자료를 제공한다.
- 또한, 서식지와 생태특성이 각 지역별 자리돔에 미치는 영향을 종합적으로 연구해볼 필요가 있다고 판단된다. 마지막으로 기후변화와 같은 서식지 환경 차이에 의해 생물의 지리적 분포 및 종 변이가 발생됨에 따라 수산자원의 변화에 영향을 미칠 가능성이 있기 때문에 이에 대응하는 기초 연구가 필요하며 본 연구는 추후 자리돔 연구에 대한 기초자료를 제공한다.
- 세 지역에 서식하는 자리돔의 계수와 계측형질을 분석한 결과, 측선하부비늘 수가 Kim and Kim (1996)의 결과와 차이가 있었기 때문에 측선하부비늘 수에 대한 검토가 필요할 것으로 생각된다. 계측형질은 왕돌초의 CPH의 길이가 가장 길었으며 이 형질은 해류의 속도에 영향을 받는다(Costa et al.
- 앞으로, 국내에 서식하는 자리돔의 더 많은 유전자풀을 분석하고 형태형질 변화에 따른 유전형질 변이를 확인하기 위해 다양한 마커를 사용한 추가적인 분석이 필요하다. 또한, 서식지와 생태특성이 각 지역별 자리돔에 미치는 영향을 종합적으로 연구해볼 필요가 있다고 판단된다.
- 이번 연구에서 사용된 control region 마커는 서식처에 따른 자리돔의 유전자풀을 명확하게 설명할 수 없다. 하지만 제주에 서식하는 자리돔보다 지리적으로 가까운 왕돌초와 울릉도에 서식하는 자리돔 간의 유전자 흐름(gene flow)이 더 활발히 일어나고 있는 것으로 추정해볼 수 있으며 추가적으로 control region의 전체 영역 마커 혹은 모계유전을 하는 미토콘드리아 DNA 외의 다른 다양한 마커를 사용한 추가 실험을 통해 유용한 분자마커를 탐색해 볼 필요성이 있다.
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