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문제 정의
- destructans과 같이 유사한 뿌리썩음병 증상을 유발하는 토양 병원균 간의 특성이 명확하지 않았다. 따라서 본 연구는 C. destructans에 의한 인삼 뿌리썩음병 발병에 영향을 주는 환경 요인을 구명하고, 인삼 뿌리의 상처 유무, 재배 년수, C. destructans 분리 균주의 병원성 및 접종 농도에 따른 특성을 보고하고자 한다.
가설 설정
- Growth and development of Cylindrocarpon destructans on ginseng roots. A: Lesion development by highly (right) and weakly (middle) virulent isolates on 3-year-old roots 2 weeks after inoculation. A wound (1.
- 25 mm in diameter) was created with a sharp pin on the upper inoculation site while the lower inoculation site was unwounded. B: Lesions developing mainly at the junctions of primary and lateral roots cultivated in pathogen inoculated soil.
제안 방법
- 인삼뿌리 표면의 짙은 갈색의 움푹패인 병반들과 주근 끝과 측근에서 적변 증상 없이 부패 병징을 보이는 뿌리들을 2012-2013년에 걸쳐 농가 포장으로부터 수집하였다. 1-4년생 뿌리로부터 수집한 뿌리를 0.1%의 NaOCl에 3분 동안 침지 후 멸균수에 2회 씻어 살균처리 하였다. 병반 조직으로부터 조각들을 분리하여 Reeleder 등(1999)의 rose bengal agar(RBA) 배지상에 치상하여 뿌리썩음병원균의 균사가 생장하여 육안으로 확인할 수 있을 때까지 20±2℃ 배양기에서 3-5일간 배양하였다.
- 병원성 검정. 4년생 인삼뿌리로부터 분리된 8종의 C. destructans를 건전한 인삼 뿌리에 접종하여 검정하였다. PDA에서 생장 중인 0.
- 0으로 조절하였다. C. destructans 접종은 인삼 뿌리에 무상처 접종과 상처 접종으로 2가지 방법으로 처리하였다. 인삼 뿌리의 상처 접종은 미세바늘을 이용하여 깊이 1.
- PDA 배지상에 형성된 콜로니 수는 실온(20±2℃)에서 3일간 배양하여 콜로니 수를 측정하였다.
- 5×103 cfu/g으로 각각 조절하였다. 각각의 접종농도는 균사체를 함유한 oatmeal 배지로부터 1, 5, 10 ml 현탁액을 PDA 배지위에 도말처리 하였다. PDA 배지상에 형성된 콜로니 수는 실온(20±2℃)에서 3일간 배양하여 콜로니 수를 측정하였다.
- 이들 토양을 45×70 cm 포트에 담아 차광 온실내에서 유지하였고 대조구는 처녀지 토양을 이용하였다. 국립원예특작과학원 인삼포장에서 생육중인 건전한 1-4년생 인삼뿌리를 채취하여 뿌리부위 토양을 모두 제거한 다음 포트당 3주씩 이식하여 차광 온실내에 재배하면서 포트 하부를 15 cm 정도 토양내에 묻어 완전임의 3반복으로 처리하였다. 차광온실은 주위 온도가 20±2℃로 유지하였고 광도는 40 정도로 낮게 관리하였다.
- 균사생장 길이는 배양 2주 후 균총의 생장정도를 측정하였고 포자 형성정도는 배양 4주 후 15 ml의 증류수를 첨가한 후 생장 중인 균총 표면을 슬라이드 글라스를 이용하여 긁어낸 다음 10 ml의 증류수로 2번 씻은 후 포자 측정기를 이용하여 조사하였다. 균사 생장에 미치는 온도의 영향을 측정하기 위해 PDA 배지상에 14일 동안 배양한 C. destructans CD-1(병원성 강)과 CD14(병원성 약)으로부터 취한 0.5 cm 균사 조각을 PDA 배지상에 재접종 후 배양기의 온도를 5-35℃ 사이로 설정하여 3일 간격으로 균사의 생장정도를 측정하였다. 대부분 강한 병원성을 지닌 균주들은 PDA 배지상에서 포자 형성정도가 높지 않기 때문에 포자 형성을 확대하기 위해 modified potato ginseng agar(MPGA), 물 1,000 ml의 인삼뿌리 20 g, 감자 20 g을 넣고 15분간 끓인 후 거즈로 걸러 300 ml의 추출물을 만든 후 agar 15 g과 증류수 700 ml 첨가) 배지를 이용하였다.
- destructans 균주중 강한 병원성을 나타내는 3균주와 약한 병원성을 나타내는 3균주를 선발하여 PDA 배지상에 접종한 후 20±2℃의 실온에 보관하였다. 균사생장 길이는 배양 2주 후 균총의 생장정도를 측정하였고 포자 형성정도는 배양 4주 후 15 ml의 증류수를 첨가한 후 생장 중인 균총 표면을 슬라이드 글라스를 이용하여 긁어낸 다음 10 ml의 증류수로 2번 씻은 후 포자 측정기를 이용하여 조사하였다. 균사 생장에 미치는 온도의 영향을 측정하기 위해 PDA 배지상에 14일 동안 배양한 C.
- PDA 배지상에 형성된 콜로니 수는 실온(20±2℃)에서 3일간 배양하여 콜로니 수를 측정하였다. 또한, 2년생 인삼 뿌리를 원예과학원 재배포장으로부터 수집하여 건전 뿌리만 병원균 감염 포트와 대조구 포트에 각각 이식하여 재배하였다. 각 접종 농도별로 처리된 포트당 3개에는 무상처 뿌리를, 또 다른 3개 병원균 접종 포트에는 상처유발 후 이식하였다.
- 병원균 접종은 potato ginseng agar에서 생장한 분리균 CD-1의 포자 농도를 5×105 spores/ml 개로 조절하여 1,000 ml 배양액이 담긴 용기 속에 넣어 각각 접종하였다. 또한, 인삼뿌리는 상처유무에 따라 각각 3개의 배양 용기(각 용기당 6주)에 넣어 pH 5.0과 7.0으로 구분하여 재배하였다. 또 다른 용기에는 병원균을 접종하지 않고 6주의 인삼을 재배하면서 대조구로 사용하였다.
- 멸균 후 최종적으로 1 N HCl 또는 NaOH를 소량첨가 하여 pH를 조절하였다. 미리 14일 동안 PDA 배지상에서 배양하였던 C. destructans CD-1에서 취한 0.5cm 균사 조각을 삼각플라스크에 접종한 후 회전 배양기에 고정하여 15일 동안 배양한 후 플라스크로부터 균사체를 여과해 40℃에서 72시간 건조한 다음 무게를 측정하였다.
- 배양 후 균총으로 덮인 oat meal 배지를 포장의 흙으로 1, 5, 10% (v/v) 혼용하여 접종농도를 3.5×102, 2.0×103 그리고 3.5×103 cfu/g으로 각각 조절하였다.
- 병반 조직으로부터 조각들을 분리하여 Reeleder 등(1999)의 rose bengal agar(RBA) 배지상에 치상하여 뿌리썩음병원균의 균사가 생장하여 육안으로 확인할 수 있을 때까지 20±2℃ 배양기에서 3-5일간 배양하였다.
- 병원균 접종은 potato ginseng agar에서 생장한 분리균 CD-1의 포자 농도를 5×105 spores/ml 개로 조절하여 1,000 ml 배양액이 담긴 용기 속에 넣어 각각 접종하였다.
- 이후 균사체를 potato dextrose agar(PDA; dextrose 20 g, agar 20 g, 증류수 100 ml)를 넣은 배양접시에 옮겨 14일 동안 생장시킨 후 접종에 이용하였다. 분리된 균주는 현미경 검경을 통해 동정한 다음 이를 ITS 염기서열을 분석 의뢰하여 Blast를 통해 확인한 후 실험 균주로 공시하였다.
- pH 변화에 의한 균사 생장조사. 뿌리썩음병원균 생장 배지의 pH를 pH 3.0, 5.0, 7.0으로 조절하기 위하여 Na2HPO4/NaH2PO4와 구연산과 구연산나트륨이 함유된 버퍼 용액 0.01M을 조제하여 사용하였다. 조제된 버퍼 용액 100 ml을 250 ml 플라스크에 넣고 potato dextrose broth(PDB)를 적정량 넣은 다음 121℃에서 15분간 멸균하였다.
- 각 용기의 배양액은 공기 분사 호스를 통해 공기를 주입하였고 실내의 낮은 광조건(40 µmol/m)에서 재배하였다. 뿌리의 발병정도는 3일 간격으로 조사하였으며, 병반크기는 발병정도에 따라 6단계로 나누었다. 즉, 1 = 무발병, 2 = 직경 0.
- 여기서 각 처리구당 X1, X2, X3, X4, X5, X6은 1-6의 뿌리썩음병 발병등급에 해당하는 발병 주수를 조사하였다.
- 각 접종 농도별로 처리된 포트당 3개에는 무상처 뿌리를, 또 다른 3개 병원균 접종 포트에는 상처유발 후 이식하였다. 이때 뿌리상처는 미세바늘로 깊이 1.0 mm, 지름 0.25 mm 크기로 8-10개 처리하였다. 이식 후 초기 10일 동안 포트를 비닐로 덮어 수분손실을 최소화 하였으며, 포트내 수분정도는 3일 간격으로 관수하여 포장용수량 수준으로 유지하였다.
- 5 cm2의 균총을 2-3개(4반복)씩 뿌리에 접종한 후 젖은 여과지를 넣은 플라스틱 용기(15×25 cm)에 넣어 20℃ 항온기에 보관하였다. 이때 뿌리표면 접종 부위에 미세바늘로 깊이 1.0 mm, 지름 0.25 mm의 상처를 내거나 무상처로 접종하였다. 접종부위에 병반 형성정도는 균 접종 22일 후에 측정하였으며 병원균 접종 후 상처유무에 따른 짙은색의 병반 형성 정도에 따라 병원성을 구분하였다.
- 인삼뿌리 발병 진전에 대한 pH의 영향과 뿌리상처 접종 후 병반 크기를 측정하기 위하여 인삼포장에서 생장중인 2년생 건전뿌리를 재배 토양과 함께 캐낸 후 뿌리 흙을 모두 제거하여 스티로폼을 이용하여 수경재배 하였다. 이때 사용한 국립원예특작과학원 표준 배양액을 1 N HCl 또는 NaOH를 이용하여 pH 5.0 또는 7.0으로 조절하였다. C.
- 이식 후 초기 10일 동안 포트를 비닐로 덮어 수분손실을 최소화 하였으며, 포트내 수분정도는 3일 간격으로 관수하여 포장용수량 수준으로 유지하였다. 이식 30일 후 뿌리썩음병 발병률을 조사하였으며 발병지수 계산을 통하여 1-6등급으로 구분하였다.
- pH 변화와 상처유무가 발병에 미치는 영향. 인삼뿌리 발병 진전에 대한 pH의 영향과 뿌리상처 접종 후 병반 크기를 측정하기 위하여 인삼포장에서 생장중인 2년생 건전뿌리를 재배 토양과 함께 캐낸 후 뿌리 흙을 모두 제거하여 스티로폼을 이용하여 수경재배 하였다. 이때 사용한 국립원예특작과학원 표준 배양액을 1 N HCl 또는 NaOH를 이용하여 pH 5.
- 25 mm의 상처를 내거나 무상처로 접종하였다. 접종부위에 병반 형성정도는 균 접종 22일 후에 측정하였으며 병원균 접종 후 상처유무에 따른 짙은색의 병반 형성 정도에 따라 병원성을 구분하였다.
- 뿌리의 발병정도는 3일 간격으로 조사하였으며, 병반크기는 발병정도에 따라 6단계로 나누었다. 즉, 1 = 무발병, 2 = 직경 0.9 mm 갈변, 3 = 직경 1-4.0 mm 짙은 갈변, 4 =직경 5-7 mm 짙은 갈변, 5 = 직경 7.0 mm 이상 짙은 갈변, 6 = 완전부패로 각각 구분하였다. 그 다음 발병지수(disease severity index, DSI)를 다음 식을 사용하여 환산하였다.
- 차광온실은 주위 온도가 20±2℃로 유지하였고 광도는 40 정도로 낮게 관리하였다. 포트내 이식 후 30일 동안 재배하면서 뿌리썩음병 발병률과 발병정도에 따라 1-6등급으로 구분하여 표시하였다.
대상 데이터
- 이들 토양을 45×70 cm 포트에 담아 차광 온실내에서 유지하였고 대조구는 처녀지 토양을 이용하였다.
- 재배연수별 발병에 미치는 영향. 인삼 연령별 포트내 이식을 위해 인삼 뿌리썩음병이 다발생하여 고사한 충북 음성의 인삼 재배농가로부터 재배토양을 수집하였다. 수집토양 분석 결과 유기물 함량 4.
- destructans 분리. 인삼뿌리 표면의 짙은 갈색의 움푹패인 병반들과 주근 끝과 측근에서 적변 증상 없이 부패 병징을 보이는 뿌리들을 2012-2013년에 걸쳐 농가 포장으로부터 수집하였다. 1-4년생 뿌리로부터 수집한 뿌리를 0.
성능/효과
- 8, 19 균주의 PDA 배지상에서 포자 생성량은 균총당 1.1×106, 3×105, 2×106의 포자를 나타낸 반면 병원성이 약한 CD-6, 16, 17은 7.2×109, 6.6×108, 7.2×108의 포자를 생성하였다.
- C. destructans 균주중 강한 병원성을 나타내는 3균주와 약한 병원성을 나타내는 3균주를 선발하여 PDA 배지상에 접종한 후 20±2℃의 실온에 보관하였다.
- 온도가 균사생장에 미치는 영향. C. destructans 분리균을 5-35℃의 온도범위에 노출시켜 생장시킨 결과(Fig. 3) 강한 병원성을 지닌 CD-2와 약한 병원성을 나타낸 CD-16 균주 모두 20℃가 생육적온이었다. 또한 두 균주 모두 5℃에서는 생장이 낮고, 35℃에서는 생장하지 못하였으며, CD-16보다 CD-2의 생장이 느린 경향이었다.
- destructans 중에서 21 균주는 강한 병원성을 나타내는 것으로 확인되었다. C. destructans의 생육 특성은 기존의 보고와 비교하여 20℃에서 균사 생육이 가장 양호하여 유사하였지만 병원성에 따라 담황색에서 담갈색에 이르기까지 균총의 색상과 생육 속도가 다르다는 것을 확인할 수 있었다. 또한 뿌리의 상처는 토양의 pH보다 발병도를 높이는 것으로 확인되어 토양 해충 등에 의한 상처도 인삼 뿌리썩음병의 발생이 크게 증가시킬 수 있음을 확인할 수 있었다.
- 5로 낮추자 다시 증가하였다. Cylindrocarpon 감염에 의한 뿌리썩음병 발병정도는 뿌리의 년한에 영향을 받으며, 연한이 높은 뿌리일수록 얇고 작은 병반이 다수 형성되었으며 어린 뿌리 발병주에서는 완전히 부패되었다. 또한, 인삼을 재배하는 포장에서 재배연한이 높은 뿌리일수록 뿌리썩음병 발병률이 높아지는데 이는 시간이 경과 할수록 토양내 균밀도가 높아져서 2년근에서 3, 4년근으로 병원체가 전이되기 때문으로 판단된다.
- 3B). 두 분리균 모두 5℃에서는 생장이 낮았으며, CD-2가 CD-16보다 생장이 느린 경향이었으며, 35℃에서는 두 분리균 모두 생장하지 못하였다.
- 3) 강한 병원성을 지닌 CD-2와 약한 병원성을 나타낸 CD-16 균주 모두 20℃가 생육적온이었다. 또한 두 균주 모두 5℃에서는 생장이 낮고, 35℃에서는 생장하지 못하였으며, CD-16보다 CD-2의 생장이 느린 경향이었다.
- destructans의 생육 특성은 기존의 보고와 비교하여 20℃에서 균사 생육이 가장 양호하여 유사하였지만 병원성에 따라 담황색에서 담갈색에 이르기까지 균총의 색상과 생육 속도가 다르다는 것을 확인할 수 있었다. 또한 뿌리의 상처는 토양의 pH보다 발병도를 높이는 것으로 확인되어 토양 해충 등에 의한 상처도 인삼 뿌리썩음병의 발생이 크게 증가시킬 수 있음을 확인할 수 있었다. 무엇보다 직파보다 묘삼의 이식재배가 널리 보급된 국내 인삼 재배 여건을 감안할 때 2년생 뿌리에서 가장 높은 발병을 보인 점도 향후 인삼의 재배 방법 및 이식 시기에 관한 연구도 뒤따라야 할 것으로 생각된다.
- 1A). 또한 이들 분리균들을 PDA 배지에서 2주 생장시킨 결과 강한 병원성을 나타낸 균주들의 표면은 짙은 갈색을 나타낸 반면 병원성이 약한 균주들은 베이지색 또는 옅은 갈색을 나타내었다(Fig. 2).
- 반면 1년생 뿌리는 2년생 뿌리에 비해 발병정도는 낮았지만 몇 개의 발병뿌리에서 거의 완전히 분해된 것처럼 부패 정도가 심하였다. 또한, 3, 4년생 뿌리 대부분은 뿌리 표면에 다수의 작고 옅은 침입병반이 형성되었으며, 2년생 뿌리와 비교시 발병률이 낮았다(Table 2).
- 4). 또한, 무상처 접종 뿌리에서도 pH 7.0에서의 발병도가 훨씬 더 낮았으며, 병반이 상처 접종 뿌리에서 보다 현저히 늦게 형성되었다. 뿌리썩음병원균의 균사생장에 미치는 pH 효과를 PDB 배지에서 조사한 결과 pH 3.
- 뿌리 년수가 발병에 미치는 영향. 발병 토양내에 생육중인 인삼뿌리를 년수별로 이식하여 재배한 결과 2년생 뿌리에서 발병률 79.5%로 높은 경향이었으며, 발병정도는 4.5로 가장 높았다(Table 2). 반면 1년생 뿌리는 2년생 뿌리에 비해 발병정도는 낮았지만 몇 개의 발병뿌리에서 거의 완전히 분해된 것처럼 부패 정도가 심하였다.
- 본 연구를 통해 국내 인삼 주요 산지에서 수집한 57종의 C. destructans 중에서 21 균주는 강한 병원성을 나타내는 것으로 확인되었다. C.
- 인삼을 연작하는 과정에서 뿌리 표면에 적변증상을 나타내어 상품성을 저하시키기 때문에 재배중 약제 방제를 실시하여도 효율이 높지 않아 매우 제한적이다(Rahman과 Punja, 2005). 본 연구에서 4년근에 대한 분리균의 병원성 검정 결과 C. destructans 분리균 61%는 무상처 접종에서는 병반이 형성되지 않고 상처 접종처리구에서 병반이 형성된 것으로 보아 병원성이 약한 것으로 분류하였다. 이러한 병원성이 약한 균들은 포장재배시 인삼 뿌리썩음병 발병 및 확산을 위해서는 상처 유무가 매우 중요하다고 판단된다.
- 1년근에서 뿌리썩음병 감염 빈도가 낮은 것은 토양내 존재하는 병원균 접종원과 접할 수 있는 표면적이 낮다는 것을 의미한다고 볼 수도 있으며, 재배기간이 길어질수록 뿌리에 펙틴과 다른 여러 세포벽 구성성분이 축적되면 뿌리썩음병 감염에 대한 저항력도 있다고 할 수 있다(Reeleder 등, 2003). 본 연구에서도 비록 어린뿌리에서 낮은 발병률이 확인되었지만, 이미 발병된 어린뿌리는 높은 발병정도를 보였다.
- 보다 생장속도가 빠른 특성을 나타내었다. 분리된 C. destructans 57균주중에서 61%(34균주)는 병원성이 낮았으며, 나머지 37%(21균주)는 무상처 접종에서도 병반을 형성하여 강한 병원성을 나타내었다(Fig. 1A). 또한 이들 분리균들을 PDA 배지에서 2주 생장시킨 결과 강한 병원성을 나타낸 균주들의 표면은 짙은 갈색을 나타낸 반면 병원성이 약한 균주들은 베이지색 또는 옅은 갈색을 나타내었다(Fig.
- 균접종 농도가 발병에 미치는 영향. 뿌리썩음병 발병정도는 토양 내 접종 병원균의 밀도에 따라 크게 영향을 받는 것으로 나타났다. 뿌리썩음병 발병정도는 병원균 접종농도 3.
- 0에서의 발병도가 훨씬 더 낮았으며, 병반이 상처 접종 뿌리에서 보다 현저히 늦게 형성되었다. 뿌리썩음병원균의 균사생장에 미치는 pH 효과를 PDB 배지에서 조사한 결과 pH 3.0과 7.0에서보다 pH 5.0에서 현저하게 높게 생장되었으며, pH 3.0보다는 pH 7.0에서 더 양호한 결과를 나타내었다(Fig. 5).
- 4에 나타내었다. 상처접종 뿌리에서의 병반은 pH에 관계없이 접종 후 5일에 나타났으나, 전체적인 발병도는 pH 5.0에서 보다 pH 7.0에서 현저히 낮았다(Fig. 4). 또한, 무상처 접종 뿌리에서도 pH 7.
- 인삼 연령별 포트내 이식을 위해 인삼 뿌리썩음병이 다발생하여 고사한 충북 음성의 인삼 재배농가로부터 재배토양을 수집하였다. 수집토양 분석 결과 유기물 함량 4.5%, NO3 27 ppm, P 108 ppm, K 525 ppm, Ca 950 ppm, Mg 880 ppm, S 66 ppm이었다. 이들 토양을 45×70 cm 포트에 담아 차광 온실내에서 유지하였고 대조구는 처녀지 토양을 이용하였다.
- destructans 57균주를 분리하였다(Table 1). 수집한 1-4년생 발병 뿌리로부터 뿌리썩음병 평균 분리률은 55%였으며, 1, 2년생 뿌리에서의 뿌리썩음병균 분리률은 65%, 3, 4년생 뿌리에서의 분리률은 35%를 나타내었다. C.
- 한편, Cylindrocarpon spp.에 의한 발병 및 진전에 영향을 미치는 온도범위를 조사한 결과 병원체 생장에 최적 온도 범위인 20℃에서 가장 높게 나타내었으며, 10, 25℃ 처리구에서는 낮은 생장량을 보였다. 또한, Rahman과 Punja(2005)의 토양 속 습도변화 연구에서 –0.
- 인삼을 수경재배 형태로 재배하면서 뿌리에 상처 발생 후 뿌리썩음병원균의 접종농도를 2.0×103 cfu/g으로 처리한 결과 발병정도는 낮은 밀도에서 보다 높게 나타났으며, 높은 접종농도 3.5×103 cfu/g 처리구에서도 비슷한 발병정도를 나타내었다.
- destructans 분리 및 병원성 검정. 짙은 갈색의 뚜렷한 인삼뿌리썩음병 증세를 보이는 뿌리조직으로부터 C. destructans 57균주를 분리하였다(Table 1). 수집한 1-4년생 발병 뿌리로부터 뿌리썩음병 평균 분리률은 55%였으며, 1, 2년생 뿌리에서의 뿌리썩음병균 분리률은 65%, 3, 4년생 뿌리에서의 분리률은 35%를 나타내었다.
- 2×108의 포자를 생성하였다. 한편, C. destructans 분리균을 5-35℃의 온도범위에 노출시켜 생장 시킨 결과 강한 병원성을 지닌 CD-2는 20℃가 생육적온이었고 (Fig. 3A), 약한 병원성을 나타낸 CD-16 균주도 20℃가 생육적온이었다(Fig. 3B). 두 분리균 모두 5℃에서는 생장이 낮았으며, CD-2가 CD-16보다 생장이 느린 경향이었으며, 35℃에서는 두 분리균 모두 생장하지 못하였다.
후속연구
- 또한 뿌리의 상처는 토양의 pH보다 발병도를 높이는 것으로 확인되어 토양 해충 등에 의한 상처도 인삼 뿌리썩음병의 발생이 크게 증가시킬 수 있음을 확인할 수 있었다. 무엇보다 직파보다 묘삼의 이식재배가 널리 보급된 국내 인삼 재배 여건을 감안할 때 2년생 뿌리에서 가장 높은 발병을 보인 점도 향후 인삼의 재배 방법 및 이식 시기에 관한 연구도 뒤따라야 할 것으로 생각된다.
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