[논문]인삼 뿌리썩음병균에 항균활성이 있는 방선균 BK185의 분리 및 특성

김병용; 배문형; 안재형; 원항연; 김성일; 김완규; 오동찬; 송재경

doi:10.7585/kjps.2014.18.4.396

인삼 뿌리썩음병균에 항균활성이 있는 방선균 BK185의 분리 및 특성
Isolation and Characterization of Actinomycete Strain BK185 Possessing Antifungal Activity against Ginseng Root Rot Pathogens 원문보기

농약과학회지 = The Korean journal of pesticide science, v.18 no.4, 2014년, pp.396 - 403

김병용 (농촌진흥청 국립농업과학원 농업미생물과) , 배문형 (강원도 농업기술원 인삼약초연구소) , 안재형 (농촌진흥청 국립농업과학원 농업미생물과) , 원항연 (농촌진흥청 국립농업과학원 농업미생물과) , 김성일 (서울대학교 약학대학 천연물연구소) , 김완규 (농촌진흥청 국립농업과학원 농업미생물과) , 오동찬 (강원도 농업기술원 인삼약초연구소) , 송재경 (농촌진흥청 국립농업과학원 농업미생물과)

초록
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인삼은 한국을 포함한 여러 국가에서 경제적으로 중요한 약용작물이다. 인삼에서 흔히 발생하는 뿌리썩음 병균을 친환경적으로 방제하기 위해서 병원균에 대해서 항균성이 있는 미생물을 탐색하였다. 토양에서 분리한 방선균 BK185균주는 인삼에 뿌리썩음병을 일으키는 병원균들(Cylindrocarpon, Fusarium, Rhizoctonia, Sclerotinia)에 대해서 높은 항균 활성을 보였다. 선발 균주 BK185의 동정을 위해서 16S rRNA 유전자 염기서열을 분석한 결과 Streptomyces 속에 해당하는 것으로 분석되었다. 특히, S. sporoclivatus 및 S. geldanamycininus와 99.6% 이상으로 매우 높은 유사도를 보였다. 선발 균주가 생산하는 2차 대사물질을 예측하기 위해서, 생산에 관여하는 생합성 유전자인PKS (Type-I polyketide synthase)와 NRPS (Non-ribosomal polypeptide synthetase) 유전자를 PCR반응을 통해 검출하였다. 검출된 유전자는 클로닝을 통해 염기서열을 결정하였다. 또한 최적 배양조건하에서 생산된 대사물질을 LC/MS로 분석하였고, geldanamycin 계열의 항생물질이 생산됨을 확인하였다.

Abstract ▼ AI-Helper

Ginseng (Panax ginseng C. A. Meyer) is an economically valuable pharmaceutical crop in Korea. In order to find promising biocontrol agents for soil-borne fungal pathogens which infect ginseng roots, we have isolated actinomycete, BK185 from soil. The isolate was investigated for the antifungal activity against to ginseng rot pathogens prior to testing genetic and chemical properties. The strain was identified as Streptomyces sp. using phylogenetic analysis based on 16S rRNA gene sequence. The most closely related species was S. sporoclivatus and S. geldanamycininus with high similarities (>99%). The isolate, BK185 showed positive reaction for PCR detection targeting biosynthetic gene clusters of PKS (Type-I polyketide synthase) and NRPS (Non-ribosomal polypeptide synthetase) genes. Major metabolite from the BK185 was analyzed by The LC/MS and identified to geldamycin, which was known to contained broad antibacterial, antifungal or anticancer activities. The results provide evidences that the strain, BK185 can be promising biocontrol agent for ginseng organic farming.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구에서는 인삼뿌리썩음병을 억제하는 항균활성 미생물제제를 개발하고자, 이들 병원균에 길항 효과를 갖는 유용미생물을 인삼토양에서 방선균을 선택적으로 분리, 선발하였다. 또한 선발 균주에 존재하는 2차 대사산물에 관여하는 유전자를 검출하여 염기서열을 분석함과 동시에, 화학분석을 통해 직접 방선균이 생산하는 2차 대사물질을 구명하고자 하였다.
본 연구에서는 인삼뿌리썩음병을 억제하는 항균활성 미생물제제를 개발하고자, 이들 병원균에 길항 효과를 갖는 유용미생물을 인삼토양에서 방선균을 선택적으로 분리, 선발하였다. 또한 선발 균주에 존재하는 2차 대사산물에 관여하는 유전자를 검출하여 염기서열을 분석함과 동시에, 화학분석을 통해 직접 방선균이 생산하는 2차 대사물질을 구명하고자 하였다.
선발 균주 BK185의 생산물질을 확인하기 위해서 대량배양을 통해 LC/MS를 이용하여 물질의 구조를 확인하고자 하였다. 전배양을 위해서 선발 균주 BK185를 125 ml 삼각플라스크에 50 mL YEME 액상 배지(4 g yeast extract, 10 g malt extract, 4 g glucose/1 L distilled water)에서 72시간 1차 배양하였다.
geldanamycininus NRRL B-3602가 보유한 geldanamycin 생합성 유전자와 94%의 상동성을 보였다. 이러한 결과는 BK185 균주가 PKS와 NRPS 계열의 2차 대사물질을 생산하는 가능성을 제시한다.

제안 방법

1차 시험 균주는 길항미생물에 대해 비교적 감수성이 크게 나타나는 Rhizoctonia solani KACC 40123으로 실시하였으며, 선발 균주중 총 15균주가 병원균의 균사 생장을 억제하는 것을 관찰하였다. 1차 선발된 균주는 Sclerotinia nivalis KACC 45152를 대상으로 병원균의 균사 생장 억제를 2차로 확인하였다. 2차 시험에서 총 4균주(BK120, BK185, BK190, BYK1158)가 높은 생장 억제 정도를 보였으며(Table 2), 이중에서 가장 큰 활성을 보이는 균주 BK185를 최종 선발하였다(Fig.
TSB (Trypticase Soy Broth; Difco)에 접종하여 30℃에서 24시간 배양 후 원심 분리하여 균체를 수확하였다. Genomic DNA extraction kit (iNtRON, Korea)를 사용하여 수확한 균체에서 DNA를 분리하였다. 16S rRNA 유전자를 증폭하기 위해서 universal primer인 27F와 1492R을 사용하여, Kim 등(2012)의 방법대로 PCR반응을 수행하였다.
전체 반응물 20 µl 내에 1 µl의 DNA (50 ng) 와 10 pmol primer들을 넣었다. PCR 반응 온도는 제조사의 안내서에 따라서 initial denaturation (95℃, 2분), 30회 반복으로 denaturation (95℃, 30초), annealing (55℃, 45초), elongation (72℃, 1분)을 하였으며, 최종 elongation 반응은 72℃에서 5분간 실시하였다. 증폭된 PCR산물은 전기영동을 통해서 예상된 크기의 산물임을 확인하였고, 클로닝에 사용하였다.
증폭된 산물은 클로닝을 통해 개별 콜로니를 분리하여 염기서열을 결정하였다. PCR 반응은 2X TOPsimple^TM DyeMIX-Tenuto PCR kit (Enzymonics Co., Korea)를 사용하였다. 전체 반응물 20 µl 내에 1 µl의 DNA (50 ng) 와 10 pmol primer들을 넣었다.
획득된 추출물을 Sep-Pak C₁₈ cartridge에 옮긴 후에 각각 20 mL의 20%, 40%, 60%, 80%, 100% 메탄올 용매를 사용하여 분획하였다. 각각의 분획물을 Mass (Agilent Technologies 6130 Quadrupole mass spectrometer, USA)가 장착된 액체 크로마토그래피(Agilent Technologies 1200 series, USA) 장비로 정밀 분석하였다. 분리용 컬럼은 C₁₈ reverse column (Phenomenex Luna, 100×4.
coli에 클로닝한 후에 NRPS 유전자 clone 8개와 PKS 유전자 clone 11개를 선별해서 염기서열을 분석하였다. 개별 clone들에서 결정된 염기서열을 바탕으로 NCBI Blast 검색을 수행하였다(Table 3). NRPS 유전자 clone 7개는 모두 S.
일반적으로 방선균이 생산하는 것으로 알려진 PKS (Type-I polyketide synthase)와 NRPS (Non-ribosomal polypeptide synthetase) 유전자의 검출을 위해서 기존 연구(Ayuso-Sacido and Genilloud, 2005)에서 보고된 PCR 특이 프라이머를 사용하여 선발 균주 BK185에서 PKS와 NRPS 생합성 유전자를 검출하였다. 검출된 PCR 산물로 E. coli에 클로닝한 후에 NRPS 유전자 clone 8개와 PKS 유전자 clone 11개를 선별해서 염기서열을 분석하였다. 개별 clone들에서 결정된 염기서열을 바탕으로 NCBI Blast 검색을 수행하였다(Table 3).
(Korea)에서 목적 유전자의 염기서열을 결정하였다. 결정된 염기서열은 NCBI의 Blast search 방법(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)으로 검색한 후 GenBank에 등재된 유전자중에서 상동성이 가장 높은 유전자들을 확인하였다.
nivalis KACC 45152)은 농촌진흥청 농업미생물은행(KACC)으로 부터 분양 받아 사용하였다. 공시한 각각의 병원균 균총을 8 mm cork borer를 이용하여 절단한 후 PDA (Potato Dextrose Agar; Difco) 배지 중앙에 치상한 후 분리균주를 대치 배양하였다. 대치 배양된 각각의 병원균을 최적 생장 온도(Cylindrocarpon destructans, Sclerotinia nivalis는 21℃, Fusarium oxysporum, Fusarium solani, Rhizoctonia solani는 25℃)에서 4-5일간 배양 한 후 선발 균주들의 균사 생장 억제 능력을 조사하였다.
공시한 각각의 병원균 균총을 8 mm cork borer를 이용하여 절단한 후 PDA (Potato Dextrose Agar; Difco) 배지 중앙에 치상한 후 분리균주를 대치 배양하였다. 대치 배양된 각각의 병원균을 최적 생장 온도(Cylindrocarpon destructans, Sclerotinia nivalis는 21℃, Fusarium oxysporum, Fusarium solani, Rhizoctonia solani는 25℃)에서 4-5일간 배양 한 후 선발 균주들의 균사 생장 억제 능력을 조사하였다.
분리용 컬럼은 C18 reverse column (Phenomenex Luna, 100×4.6 mm)을 사용하였으며, 20분 동안 10% acetonitrile에서 100% acetonitrile이 될 때까지 농도를 높이는 방법으로 이동상 조건을 설정하였다.
선발 균주를 동정하기 위해서 16S rRNA 유전자를 분석하였다. TSB (Trypticase Soy Broth; Difco)에 접종하여 30℃에서 24시간 배양 후 원심 분리하여 균체를 수확하였다.
선발 균주의 정확한 동정을 위해서 결정된 염기서열를 EzTaxon 데이터베이스(http://www.ezbiocloud.net)를 통해서 가장 높은 상동성 균주를 검색하였다. Streptomyces sporoclivatus와 S.
분리한 균주를 일차적으로 Rhizoctonia solani KACC 40123과 Sclerotinia nivalis KACC 45152 균주를 대상으로 생장 저해능을 검정하였으며, 이 중 길항능력이 가장 우수한 균주를 최종적으로 선발하였다. 선발된 균주를 대상으로 인삼 뿌리썩음병원균 5종(Cylindrocarpon destructans, Fusarium oxysporum, Fusarium solani, Rhizoctonia solani, Sclerotinia nivalis) 과 대치 배양하여 균사 생장 억제능력을 조사하였다. 공시 시험 균주들(C.
증폭된 PCR 산물은 QIAquick PCR Purification kit (Qiagen, USA)를 사용하여 정제하였다. 염기서열분석은 Genotech Co. (Korea) 에 의뢰하여 결정하였다. 비교 표준 균주의 염기서열은 EzTaxon 데이터베이스(http://www.
인삼의 뿌리썩음병에 방제효과를 갖는 토양 미생물을 선발하기 위해서 인삼 재배 토양에서 토양미생물을 분리하기 위해서 방선균의 선택배지를 사용하였다. 희석평판 배지로 부터 96균주를 분리하여 1차 항균성 능력을 조사하였다.
, 2010). 일반적으로 방선균이 생산하는 것으로 알려진 PKS (Type-I polyketide synthase)와 NRPS (Non-ribosomal polypeptide synthetase) 유전자의 검출을 위해서 기존 연구(Ayuso-Sacido and Genilloud, 2005)에서 보고된 PCR 특이 프라이머를 사용하여 선발 균주 BK185에서 PKS와 NRPS 생합성 유전자를 검출하였다. 검출된 PCR 산물로 E.
제조사의 사용법에 따라서 전체 부피 6 µl의 혼합물을 실내온도에 5분간 반응하였고, competent E. coli 세포에 열충격 방법으로 형질전환하였다.
16S rRNA 유전자를 증폭하기 위해서 universal primer인 27F와 1492R을 사용하여, Kim 등(2012)의 방법대로 PCR반응을 수행하였다. 증폭된 PCR 산물은 QIAquick PCR Purification kit (Qiagen, USA)를 사용하여 정제하였다. 염기서열분석은 Genotech Co.
선발 균주들이 생산하는 2차 대사 산물의 생합성에 관여하는 유전자를 확인하기 위해서 Ayuso-Sacido와 Genilloud (2005)의 방법대로 NRPS (Non-ribosomal peptide synthetase) 와 PKS (type I polyketide synthase) 유전자 특이 프라이머를 사용한 PCR 반응을 수행하였다(Table 1). 증폭된 산물은 클로닝을 통해 개별 콜로니를 분리하여 염기서열을 결정하였다. PCR 반응은 2X TOPsimple^TM DyeMIX-Tenuto PCR kit (Enzymonics Co.
이들네 개의 종(species)은 16S rRNA 유전자 서열만으로는 분류학적 구분이 불가능한 Taxonomic group으로 EzTaxon에 지정되어 있다. 한편, 16S rRNA 유전자 염기서열을 바탕으로 선발 균주의 분자계통도를 작성하였다(Fig. 2). 염기서열 상동성 비교와는 달리 분자 계통도에서는 선발 균주가 Streptomyces geldanamycininus NRRL B-3602^T 균주와 가장 가까운 근연 관계를 보였다.
coli 세포에 열충격 방법으로 형질전환하였다. 형질전환된 E. coli 세포들을 배양 16시간 후 white/blue 콜로니 선별방법으로 양성 세포들만 선별한 후, Plasmid mini-prep kit (iNtRON, Korea)로 형질전환된 plasmid를 추출하여 Genotech Co. (Korea)에서 목적 유전자의 염기서열을 결정하였다. 결정된 염기서열은 NCBI의 Blast search 방법(http://www.
추출된 에틸아세테이트층을 별도로 분리하여 sodium sulfate로 잔존 수분을 제거한 후 농축하여 추출물을 얻었다. 획득된 추출물을 Sep-Pak C₁₈ cartridge에 옮긴 후에 각각 20 mL의 20%, 40%, 60%, 80%, 100% 메탄올 용매를 사용하여 분획하였다. 각각의 분획물을 Mass (Agilent Technologies 6130 Quadrupole mass spectrometer, USA)가 장착된 액체 크로마토그래피(Agilent Technologies 1200 series, USA) 장비로 정밀 분석하였다.
인삼의 뿌리썩음병에 방제효과를 갖는 토양 미생물을 선발하기 위해서 인삼 재배 토양에서 토양미생물을 분리하기 위해서 방선균의 선택배지를 사용하였다. 희석평판 배지로 부터 96균주를 분리하여 1차 항균성 능력을 조사하였다. 1차 시험 균주는 길항미생물에 대해 비교적 감수성이 크게 나타나는 Rhizoctonia solani KACC 40123으로 실시하였으며, 선발 균주중 총 15균주가 병원균의 균사 생장을 억제하는 것을 관찰하였다.

대상 데이터

1차 선발된 균주는 Sclerotinia nivalis KACC 45152를 대상으로 병원균의 균사 생장 억제를 2차로 확인하였다. 2차 시험에서 총 4균주(BK120, BK185, BK190, BYK1158)가 높은 생장 억제 정도를 보였으며(Table 2), 이중에서 가장 큰 활성을 보이는 균주 BK185를 최종 선발하였다(Fig. 1).
선발된 균주를 대상으로 인삼 뿌리썩음병원균 5종(Cylindrocarpon destructans, Fusarium oxysporum, Fusarium solani, Rhizoctonia solani, Sclerotinia nivalis) 과 대치 배양하여 균사 생장 억제능력을 조사하였다. 공시 시험 균주들(C. destructans KACC 44656, C. destructans KACC 41077, F. oxysporum KACC 40037, F. solani KACC 44891, R. solani KACC 40123, S. nivalis KACC 45152)은 농촌진흥청 농업미생물은행(KACC)으로 부터 분양 받아 사용하였다. 공시한 각각의 병원균 균총을 8 mm cork borer를 이용하여 절단한 후 PDA (Potato Dextrose Agar; Difco) 배지 중앙에 치상한 후 분리균주를 대치 배양하였다.
도말한 배지는 30℃ 항온기에서 5일간 배양하였으며 형태적 차이를 보이는 콜로니를 대상으로 무작위적으로 100여 균주를 선별 분리하였다.
1 ml을 선택배지에 분주하여 도말하였다. 선택배지로는 AIG (Actinomycete Isolation Agar; BD, USA) 배지를 이용하였다. 도말한 배지는 30℃ 항온기에서 5일간 배양하였으며 형태적 차이를 보이는 콜로니를 대상으로 무작위적으로 100여 균주를 선별 분리하였다.
인삼뿌리썩음병의 생육을 억제하는 길항 방선균을 선택적으로 분리하기 위해서, 강원도 철원군 소재 강원도 농업기술원 포장에서 토양을 채취하였다. 토양시료 2g을 멸균 생리식염수로 희석하여 희석 현탁액(10-4~10-6)을 만든 후 0.

데이터처리

(Korea) 에 의뢰하여 결정하였다. 비교 표준 균주의 염기서열은 EzTaxon 데이터베이스(http://www.ezbiocloud.net)를 통해서 다운로드 받아, Clustal W 프로그램으로 염기서열의 정렬을 수행하였다(Chenna et al., 2003). 정렬된 염기서열은 MEGA 3.
, 2003). 정렬된 염기서열은 MEGA 3.0 프로그램(Kumar et al., 2004)을 사용하여 계통도를 작성하였다. 계통도 작성은 Neighbor-joining 알고리즘(Saitou and Nei, 1987)을 사용하였고, 계통도 견고성을 확인하기 위해서 1000회 반복으로 bootstrapping (Felsenstein, 1985)을 수행하여 수치를 계통도에 표시하였다.

이론/모형

Genomic DNA extraction kit (iNtRON, Korea)를 사용하여 수확한 균체에서 DNA를 분리하였다. 16S rRNA 유전자를 증폭하기 위해서 universal primer인 27F와 1492R을 사용하여, Kim 등(2012)의 방법대로 PCR반응을 수행하였다. 증폭된 PCR 산물은 QIAquick PCR Purification kit (Qiagen, USA)를 사용하여 정제하였다.
, 2004)을 사용하여 계통도를 작성하였다. 계통도 작성은 Neighbor-joining 알고리즘(Saitou and Nei, 1987)을 사용하였고, 계통도 견고성을 확인하기 위해서 1000회 반복으로 bootstrapping (Felsenstein, 1985)을 수행하여 수치를 계통도에 표시하였다. 분석된 16S rRNA 유전자 서열은 GenBank 온라인 데이터베이스에 등록(accession number FR692113) 하였다.
선발 균주들이 생산하는 2차 대사 산물의 생합성에 관여하는 유전자를 확인하기 위해서 Ayuso-Sacido와 Genilloud (2005)의 방법대로 NRPS (Non-ribosomal peptide synthetase) 와 PKS (type I polyketide synthase) 유전자 특이 프라이머를 사용한 PCR 반응을 수행하였다(Table 1). 증폭된 산물은 클로닝을 통해 개별 콜로니를 분리하여 염기서열을 결정하였다.

성능/효과

iranensis가 보유한 amino acid adenylation domain 유전자와 높은 상동성(94%)를 보였다. 11개의 PKS 유전자 clone들은 모두 5개 그룹의 S. hygroscopicus clade 의 종들에서 유래된 polyketide synthase 유전자들과 높은 상동성(83~99%)을 보였다. 특히 4개의 clone들(#11, #13, #14, #21)은 S.
희석평판 배지로 부터 96균주를 분리하여 1차 항균성 능력을 조사하였다. 1차 시험 균주는 길항미생물에 대해 비교적 감수성이 크게 나타나는 Rhizoctonia solani KACC 40123으로 실시하였으며, 선발 균주중 총 15균주가 병원균의 균사 생장을 억제하는 것을 관찰하였다. 1차 선발된 균주는 Sclerotinia nivalis KACC 45152를 대상으로 병원균의 균사 생장 억제를 2차로 확인하였다.
추출물을 각기 다른 농도의 메탄올 용매로 분획하였고, 그 중 60%와 80% 메탄올 농도의 분획에서 가장 많은 물질들이 모인 것을 확인할 수 있었다. 60%와 80% 농도의 분획물을 대상으로 LC/MS를 사용하여 추출된 대사 물질을 분석한 결과, 각각 12분대와 17분대에서 특이적인 UV spectrum과 Mass spectrum을 갖는 물질을 검출하였다(Fig. 3). 두 개의 peak중 17분대의 peak가 UV diode array absorbance 유형과 mass spectrum 비교를 통해 geldanamycin계열의 항생물질임을 확인하였다.
개별 clone들에서 결정된 염기서열을 바탕으로 NCBI Blast 검색을 수행하였다(Table 3). NRPS 유전자 clone 7개는 모두 S. rapamycinicus NRRL 5491 균주가 보유하는 Enterobactin synthase 유전자와 높은 상동성(93%)을 보였으며, 1개의 clone은 S. iranensis가 보유한 amino acid adenylation domain 유전자와 높은 상동성(94%)를 보였다. 11개의 PKS 유전자 clone들은 모두 5개 그룹의 S.
net)를 통해서 가장 높은 상동성 균주를 검색하였다. Streptomyces sporoclivatus와 S. antimycoticus 종의 표준균주와 99.86%의 높은 상동성을 보였다. 이것은 비교된 16S rRNA 유전자의 전체 1465개 nucleotides 중에서 2개의 nucleotide가 차이를 보이는 결과이다.
결론적으로, 본 연구를 통해 선발된 방선균 균주가 인삼의 뿌리썩음병에 강한 길항능과 이에 관여하는 2차 대사물질이 존재하는 것을 분자생물학적 실험과 화학적 분석 방법으로 증명하였다.
3). 두 개의 peak중 17분대의 peak가 UV diode array absorbance 유형과 mass spectrum 비교를 통해 geldanamycin계열의 항생물질임을 확인하였다. Geldanamycin은 Streptomyces hygroscopicus의 유사종들 의해 생산되는 물질로 herbimycin이나 macbecin과 같은 benzoquinone ansamycin계열의 항생물질이다(DeBoer et al.
이것은 비교된 16S rRNA 유전자의 전체 1465개 nucleotides 중에서 2개의 nucleotide가 차이를 보이는 결과이다. 또한 S. melanosporofaciens와 S. castelarensis도 각각 99.79%와 99.66%의 높은 상동성을 보였다. 이들네 개의 종(species)은 16S rRNA 유전자 서열만으로는 분류학적 구분이 불가능한 Taxonomic group으로 EzTaxon에 지정되어 있다.
분리한 균주를 일차적으로 Rhizoctonia solani KACC 40123과 Sclerotinia nivalis KACC 45152 균주를 대상으로 생장 저해능을 검정하였으며, 이 중 길항능력이 가장 우수한 균주를 최종적으로 선발하였다. 선발된 균주를 대상으로 인삼 뿌리썩음병원균 5종(Cylindrocarpon destructans, Fusarium oxysporum, Fusarium solani, Rhizoctonia solani, Sclerotinia nivalis) 과 대치 배양하여 균사 생장 억제능력을 조사하였다.
선발 균주 BK185를 6일간 배양 후에 에틸아세테이트로 추출하여 농축한 결과, 총 9L의 배양액으로부터 총 3g의 추출물을 얻을 수 있었다. 추출물을 각기 다른 농도의 메탄올 용매로 분획하였고, 그 중 60%와 80% 메탄올 농도의 분획에서 가장 많은 물질들이 모인 것을 확인할 수 있었다.
2). 염기서열 상동성 비교와는 달리 분자 계통도에서는 선발 균주가 Streptomyces geldanamycininus NRRL B-3602^T 균주와 가장 가까운 근연 관계를 보였다. 그러나 상동성은 99.
최종 선발 균주 BK185를 인삼 뿌리 썩음 병원균 5종 (Cylindrocarpon destructans, Fusarium oxysporum, Fusarium solani, Rhizoctonia solani, Sclerotinia nivalis)과 대치 배양하여 균사 생장 억제능력을 조사한 결과, 모든 병원균에 대해서 항균활성을 보였다. 특히, 인삼뿌리썩음병의 주 원인균인 Fusarium oxysporum과 Cylindrocarpon destructans 균주에 대한 높은 길항능을 보였다(Table 2).
선발 균주 BK185를 6일간 배양 후에 에틸아세테이트로 추출하여 농축한 결과, 총 9L의 배양액으로부터 총 3g의 추출물을 얻을 수 있었다. 추출물을 각기 다른 농도의 메탄올 용매로 분획하였고, 그 중 60%와 80% 메탄올 농도의 분획에서 가장 많은 물질들이 모인 것을 확인할 수 있었다. 60%와 80% 농도의 분획물을 대상으로 LC/MS를 사용하여 추출된 대사 물질을 분석한 결과, 각각 12분대와 17분대에서 특이적인 UV spectrum과 Mass spectrum을 갖는 물질을 검출하였다(Fig.
hygroscopicus clade 의 종들에서 유래된 polyketide synthase 유전자들과 높은 상동성(83~99%)을 보였다. 특히 4개의 clone들(#11, #13, #14, #21)은 S. geldanamycininus NBRC 14620 균주에서 유래한 PKS 유전자와 매우 높은 상동성(99%)을 보였고, 1개의 clone (#9)은 표준균주인 S. geldanamycininus NRRL B-3602가 보유한 geldanamycin 생합성 유전자와 94%의 상동성을 보였다. 이러한 결과는 BK185 균주가 PKS와 NRPS 계열의 2차 대사물질을 생산하는 가능성을 제시한다.
최종 선발 균주 BK185를 인삼 뿌리 썩음 병원균 5종 (Cylindrocarpon destructans, Fusarium oxysporum, Fusarium solani, Rhizoctonia solani, Sclerotinia nivalis)과 대치 배양하여 균사 생장 억제능력을 조사한 결과, 모든 병원균에 대해서 항균활성을 보였다. 특히, 인삼뿌리썩음병의 주 원인균인 Fusarium oxysporum과 Cylindrocarpon destructans 균주에 대한 높은 길항능을 보였다(Table 2). 추후 실외 생물 검정을 통해 생물적 방제제로서의 가능성을 추가적으로 확인해야 할 것으로 판단된다.

후속연구

59%로 비교된 전체 1446개의 nucleotide들 중에서 6개의 nucleotide가 달라서 비교적 앞에 기술한 다른 종들에 비해서 상동성은 낮게 나타났다. 계통도의 안정성을 확인하기 위한 Bootstrap 값도 87%로 높은 수치를 보이고 있어, 이 균주는 S. geldanamycininus와 근연종의 균주로 추정되지만, 정확한 분류학적 종 동정(Taxonomic identification)을 위해서는 여러 가지 생리생화학적 검사와 비교 균주들과의 DNA-DNA relatedness 실험이 추가적으로 필요하다(Wayne et al., 1987). 가장 가까운 근연종인 S.
특히, 인삼뿌리썩음병의 주 원인균인 Fusarium oxysporum과 Cylindrocarpon destructans 균주에 대한 높은 길항능을 보였다(Table 2). 추후 실외 생물 검정을 통해 생물적 방제제로서의 가능성을 추가적으로 확인해야 할 것으로 판단된다.

질의응답

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	인삼이 토양 내에서 뿌리썩음병의 피해가 큰 이유는?	Meyer)은 경제적 가치가 매우 높은 약용작물로서 일본, 중국, 한국 등 아시아 국가들과 미국, 캐나다 등의 북미지역에서 주로 재배되고 있다. 인삼은 동일 경작지에서 4~6년간 재배하기 때문에 토양 내에서 뿌리썩음병의 피해가 매우 크다(Jang et al., 2005).
	뿌리썩음병의 주 원인균에는 어떤 것들이 있는가?	, 2005). 인삼뿌리썩음병을 유발시키는 병원균으로는 세균, 선충, 곰팡이 등의 다양한 토양 병원체들이 알려져 있는데, 이중에서 Cylindrocarpon, Fusarium, Rhizoctonia, Sclerotinia 등의 진균 병원균이 뿌리썩음병의 주 원인균으로 보고되어 있다. 특히, Cylindrocarpon destructans, Fusarium solani 균은 인삼의 뿌리에서 갈변 증상을 일으키면서 식물 전체를 죽게 하는 전신감염성의 병해를 초래한다(Lee, 2004).
	인삼뿌리썩음병을 유발시키는 병원균에 인삼이 감염되면 어떤 병징이 나타나는가?	특히, Cylindrocarpon destructans, Fusarium solani 균은 인삼의 뿌리에서 갈변 증상을 일으키면서 식물 전체를 죽게 하는 전신감염성의 병해를 초래한다(Lee, 2004). 이들 병원균은 초기에는 인삼뿌리의 끝에서 병징이 나타나면서 잔뿌리들을 파괴하고, 점차 뿌리 바깥 층에 영향을 미치면서 수관 중심부로 발병이 진전되어 뿌리 전체를 부패시킨다 (Jang et al., 2010).

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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