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문제 정의
- 본 연구에서는 방사선 조사에 의한 흰쥐 정소의 세포및 정자의 변화를 기존의 정성적 방법과 함께 영상처리에 의한 정량적 방법을 수행하여 접근 가능성을 제시하였다. 다양한 방법으로 염색된 세포 영상을 정량화 하여 분석하는 시도가 많이 되고 있지만 [6, 7], 조직 및 세포 영상마다의 특성에 맞는 방법은 각각의 조건에 맞게 변화되어야 하는 난제가 있다.
- 이 연구에서는 방사선 조사에 의한 정소의 변화를 정자에 중점을 두어 정량화 하여 보다 객관적인 결과를 얻을 수 있었다. 그러나 방사선조사에 의해서 Type A dark spermatogonia, Type A pale spermatogonia, Type B spermatogonia과 같은 정조세포뿐만 아니라 1차정모세포 및 2차정모세포의 정량적 분석에는 접근하지 못한 한계를 가지고 있다.
제안 방법
- 이때 흰쥐위에 스티로폼을 올려놓고 케이지의 윗 커버를 닫아 흰쥐를 엎드린 자세로 하고 압박하여 흰쥐가 움직이지 못하게 하면서 조사하였다. Gantry는 180o방향에서 Dmax를 맞추기 위해 정소가 있는 깊이를 고려하여 1cm SolidWaterPantom(Gammex,USA)위에 케이지를 올려놓고 조사하였다.
- 원래 영상과 윈도우 영상을 사용하여 역치 값을 사용하여 관심 영역 내 정자를 영상분할을 하였다. 그 다음, 에지 획득(EdgeDetection)하여 정자의 외곽을 결정하였다. 이를 통해 획득된 정자는 정량화를 위해,윤곽의 수 (Count),윤곽의 전체 영역(TotalArea), 전체영상대비 정자의 비중(% Area), 정자의 평균 화소값(Mean), 누적 화소값(IntDen)를 계산하였다.
- 먼저, 영상의 히스토그램 분포를 평활하게 하여 대조도를 향상시키기 위하여 히스토그램 평활화(histogramequalization)를 수행하였다.그리고 정자의 윤곽을 선명하게 유도하기 위하여 2D FFT(FastFourierTransform)을 수행 후, 고주파필터 (HighPassFilter)처리를 하였다. 정확한 정자의 영상분할을 위해 염색된 영상 중 Red채널의 영상을 분리하였고, MagicWand처리기법을 사용하여 관심영역(Region ofInterest)을 설정하여 윈도우(Window)를 생성하였다.
- 각 그룹별 정소 내 정자를 분석하기 위하여 다음과 같은 영상처리를 수행하였다. 먼저, 영상의 히스토그램 분포를 평활하게 하여 대조도를 향상시키기 위하여 히스토그램 평활화(histogramequalization)를 수행하였다.그리고 정자의 윤곽을 선명하게 유도하기 위하여 2D FFT(FastFourierTransform)을 수행 후, 고주파필터 (HighPassFilter)처리를 하였다.
- 본 연구는 방사선 조사 후 즉시, 2, 4, 8, 24시간 까지 시간이 경과하는데 따른 현미경학적으로 얻어진 영상자료를 토대로 영상처리에 의해 정량분석을 함으로서 보다 객관적인 평가결과를 얻었으며 이를 통계적으로 분석하였다.
- 실험 방법으로 흰쥐는 케이지에 5마리씩 나누어서 총 25마리를 5그룹으로 나누어 조사하였다.정소에 선량을 2 Gy를 조사하기 위해 선형가속기 ONCOR Expression(Siemens,Germany)를 이용하여 에너지 6 MV X선을 선량률 300R/min, 조사면 40×40cm,Dmax 1.
- 실험동물의 사육은 온도 23±1oC,습도 40～60%,명암 주기는 12시간 조건에서 실시하였다.
- 정확한 정자의 영상분할을 위해 염색된 영상 중 Red채널의 영상을 분리하였고, MagicWand처리기법을 사용하여 관심영역(Region ofInterest)을 설정하여 윈도우(Window)를 생성하였다. 원래 영상과 윈도우 영상을 사용하여 역치 값을 사용하여 관심 영역 내 정자를 영상분할을 하였다. 그 다음, 에지 획득(EdgeDetection)하여 정자의 외곽을 결정하였다.
- 이때 흰쥐위에 스티로폼을 올려놓고 케이지의 윗 커버를 닫아 흰쥐를 엎드린 자세로 하고 압박하여 흰쥐가 움직이지 못하게 하면서 조사하였다. Gantry는 180o방향에서 Dmax를 맞추기 위해 정소가 있는 깊이를 고려하여 1cm SolidWaterPantom(Gammex,USA)위에 케이지를 올려놓고 조사하였다.
- 그 다음, 에지 획득(EdgeDetection)하여 정자의 외곽을 결정하였다. 이를 통해 획득된 정자는 정량화를 위해,윤곽의 수 (Count),윤곽의 전체 영역(TotalArea), 전체영상대비 정자의 비중(% Area), 정자의 평균 화소값(Mean), 누적 화소값(IntDen)를 계산하였다. 정량화 분석을 위해 매트랩 소프트웨어 프로그램(Matlab 2013a; MathWorks, Natick, MA, USA)을 이용하여 코딩 후 분석하였으며, 정량화된 값은 SPSS12.
- 정소에 선량을 2 Gy를 조사하기 위해 선형가속기 ONCOR Expression(Siemens,Germany)를 이용하여 에너지 6 MV X선을 선량률 300R/min, 조사면 40×40cm,Dmax 1.2cm, outputfactor1.12를 설정하여 모니터선량 183 MU를 조사하였다.
- 포매 과정을 통해 파라핀 블록을 만들고, 회전형 박절기(ReichertJung,Germany)를 사용하여 4㎛ 두께로 박절하여 조직절편 슬라이드를 제작하였다. 제작된 슬라이드는 VENTANA NEXESspecialstain(USA)를 이용하여 PeriodicacidSchiff염색을 시행하였으며, 염색과정은 탈 파라핀과 함수과정을 마친 후 0.5% periodic acid(JUNSEI.Japan)수용액에 10분간 산화, 흐르는 물에 5분 동안 수세 한 후 Schiff시약(pararosaniline hydrochloride,sigma)으로 10분 동안 염색한 후 흐르는 물에 10분간 수세하였다. 핵을 관찰하기 위하여 harris hematoxylin(영동제약) 용액에 3분간 염색 후 1% HCl-70% ethanol에 분별한 후, ammoniawater수용액으로 30초간 중화과정을 거쳐 흐르는 물에 10분간 방치 청색화 시킨 후 탈수, 투명과정을 거쳐 DAKOMounting Medium (DAKO,USA)을 사용하여 봉입하고 현미경 (DigitalImageSystem,SEDASMEDIA Co.
- 조직학적 변화를 관찰하기 위하여 조직을 채취하여 10% Neutralbufferformalin(Medilab,Korea)용액으로 고정한 후, Tissue-TekTEC5자동조직처리기 (Sakura co,Japan)를 사용하여 탈수, 투명, 파라핀 침투과정을 실시하였다. 포매 과정을 통해 파라핀 블록을 만들고, 회전형 박절기(ReichertJung,Germany)를 사용하여 4㎛ 두께로 박절하여 조직절편 슬라이드를 제작하였다.
- 즉, G1(정상대조군), G2(조사 즉시), G3(조사 2시간 후) G4(조사 4시간 후), G5(조사 8시간 후), G6(조사 24시간 후)로 구성하여 실험하였다[4].
- 조직학적 변화를 관찰하기 위하여 조직을 채취하여 10% Neutralbufferformalin(Medilab,Korea)용액으로 고정한 후, Tissue-TekTEC5자동조직처리기 (Sakura co,Japan)를 사용하여 탈수, 투명, 파라핀 침투과정을 실시하였다. 포매 과정을 통해 파라핀 블록을 만들고, 회전형 박절기(ReichertJung,Germany)를 사용하여 4㎛ 두께로 박절하여 조직절편 슬라이드를 제작하였다. 제작된 슬라이드는 VENTANA NEXESspecialstain(USA)를 이용하여 PeriodicacidSchiff염색을 시행하였으며, 염색과정은 탈 파라핀과 함수과정을 마친 후 0.
- Japan)수용액에 10분간 산화, 흐르는 물에 5분 동안 수세 한 후 Schiff시약(pararosaniline hydrochloride,sigma)으로 10분 동안 염색한 후 흐르는 물에 10분간 수세하였다. 핵을 관찰하기 위하여 harris hematoxylin(영동제약) 용액에 3분간 염색 후 1% HCl-70% ethanol에 분별한 후, ammoniawater수용액으로 30초간 중화과정을 거쳐 흐르는 물에 10분간 방치 청색화 시킨 후 탈수, 투명과정을 거쳐 DAKOMounting Medium (DAKO,USA)을 사용하여 봉입하고 현미경 (DigitalImageSystem,SEDASMEDIA Co.Korea)을 통해 400배로 관찰하여 촬영하였다.
- 흰쥐의 정소에 방사선을 2Gy를 조사 후 대조군과 각각의 실험군의 정소에 방사선 조사 후 대해 조직표본 완성 후 현미경을 이용하여 400배로 관찰하여 촬영하였다.
대상 데이터
- Rat(male,250±20g,Sprague-Dawley)은 한국 셈타코로부터 구입하였으며,구입 후 1일간 계류시켜 적응 시킨 다음 실험에 사용하였다.
- 사료는 퓨리나사로 충분히 공급하였으며,식수는 제한 없이 공급하였다. 정상대조군과 실험군은 총 30마리의 동물을 각 군 5마리씩, 6군으로 구성하였다.
데이터처리
- 정량화 분석을 위해 매트랩 소프트웨어 프로그램(Matlab 2013a; MathWorks, Natick, MA, USA)을 이용하여 코딩 후 분석하였으며, 정량화된 값은 SPSS12.0(SPSSInc,Chicago,IL,USA)를 사용하여 Student'spairedt-test에 대한 유의성 검정을 수행하였다.
이론/모형
- 그리고 정자의 윤곽을 선명하게 유도하기 위하여 2D FFT(FastFourierTransform)을 수행 후, 고주파필터 (HighPassFilter)처리를 하였다. 정확한 정자의 영상분할을 위해 염색된 영상 중 Red채널의 영상을 분리하였고, MagicWand처리기법을 사용하여 관심영역(Region ofInterest)을 설정하여 윈도우(Window)를 생성하였다. 원래 영상과 윈도우 영상을 사용하여 역치 값을 사용하여 관심 영역 내 정자를 영상분할을 하였다.
성능/효과
- 2, (d), (e), (f).] 방사선 조사한 후 24시간의 경우 정모세포와 정자세포가 손상을 받고, 정조세포가 농축 변화하며 정자 수가 현저히 줄어들고 정세관 내강이 확장되는 것을 확인 할 수 있었다 [Fig. 2, (f).
- 2, (c).]조사 4시간 이후부터 많은 수의 정자발생이 줄어 들고 관내강이 확장되는 것을 관찰 할 수 있었으며[Fig. 2, (d), (e), (f).
- 방사선 조사 시간대별 정자 형태의 수는 모든 그룹이 조사 후 24시간 경과 후와 비교하였을 때, 통계적으로 유의한 수준에서 감소하였다. 조사 4시간 후에도 정상대조군과 비교하였을 때 유의하게 감소하였으나, 조사 8시간 후에는 오히려 조사 4시간 후 보다 증가하였다 [Fig.
- 방사선조사 후 시간이 지날수록 24시간 까지는 일반 적으로 시간적 변화에 따른 정소세포수와 정자수가 감소 하는 것을 정성적으로 확인할 수 있었으며, 영상처리에 의한 다양한 분석결과에서도 방사선조사 후 24시간 후에 정자수가 유의 수준에서 감소함을 정성적 평가와 동일하게 확인할 수 있었다.
후속연구
- 다양한 방법으로 염색된 세포 영상을 정량화 하여 분석하는 시도가 많이 되고 있지만 [6, 7], 조직 및 세포 영상마다의 특성에 맞는 방법은 각각의 조건에 맞게 변화되어야 하는 난제가 있다.따라서 많은 조직영상에 대한 최적화 연구가 향후 진행되어야 할 것으로 사료된다.
- 그러나 방사선조사에 의해서 Type A dark spermatogonia, Type A pale spermatogonia, Type B spermatogonia과 같은 정조세포뿐만 아니라 1차정모세포 및 2차정모세포의 정량적 분석에는 접근하지 못한 한계를 가지고 있다.따라서 추가적으로 세포의 변화의 특성을 반영할 수 있는 연구가 후행되어야 할 것이다.
- 또한 정량적 분석법에서는 정성적으로는 분석하기 어려웠던 구체적 변화를 알 수 있었으며, 향후 추가적인 연구를 통해 분석방법, 영상처리법 등 조직화학적 염색의 정량적 연구가능성을 확인하는데 의미를 둘 수 있다.
- 이러한 조직화학적 결과를 토대로 정량적 분석의 실험군 고찰에서는 조사 4시간 후에도 조사전과 비교하였을 때 정자로 판단되는 형태의 수는 유의하게 감소하였으나, 조사 8시간 후에는 오히려 조사 4시간 후 보다 증가하는 것을 보여 통계적으로 의미 있는 값을 도출하기 위해서 추가적 검증 실험이 필요할 것으로 사료된다.
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