전통 장류에서 분리된 알칼리성 Cellulase 생성 Bacillus subtilis 4-1 균주의 효소학적 특성 Characterization of alkaline cellulase from Bacillus subtilis 4-1 isolated from Korean traditional soybean paste원문보기
수집한 장류 시료에서 분리한 균주들을 CMC를 함유하는 배지에 접종하여 섬유소 분해 활성이 우수한 4-1 균주를 선발하였다. 4-1 균주의 16S rRNA 염기서열을 분석한 결과, B. subtilis로 동정되었다. B. subtilis 4-1의 효소생산을 위한 최적 배양조건은 탄소원으로 1.0% soluble starch와 질소원으로 0.1% yeast extract를 첨가하여 $45^{\circ}C$에서 24시간 배양하였을 때로 나타났다. 최적 배양 pH를 조사한 결과, pH 5.0~9.0에서 cellulase 효소활성이 높았다. B. subtilis 4-1의 조효소 특성은 효소반응의 최적 pH가 pH 9.0, 반응온도는 $60^{\circ}C$에서 효소활성이 가장 높았으며, $20{\sim}90^{\circ}C$ 온도에서 60분간 열처리시 효소 활성이 80%이상 유지되었다. 따라서 B. subtilis 4-1에 의해 생산되는 cellulase는 내알칼리성 효소로 추정되며, 높은 열에도 안정한 것으로 나타났다. B. subtilis 4-1이 생산하는 cellulase는 CMC에 가장 높은 효소활성을 나타내었으며 avicel과 pNPG에서도 활성을 보여 복합효소로 생각된다.
수집한 장류 시료에서 분리한 균주들을 CMC를 함유하는 배지에 접종하여 섬유소 분해 활성이 우수한 4-1 균주를 선발하였다. 4-1 균주의 16S rRNA 염기서열을 분석한 결과, B. subtilis로 동정되었다. B. subtilis 4-1의 효소생산을 위한 최적 배양조건은 탄소원으로 1.0% soluble starch와 질소원으로 0.1% yeast extract를 첨가하여 $45^{\circ}C$에서 24시간 배양하였을 때로 나타났다. 최적 배양 pH를 조사한 결과, pH 5.0~9.0에서 cellulase 효소활성이 높았다. B. subtilis 4-1의 조효소 특성은 효소반응의 최적 pH가 pH 9.0, 반응온도는 $60^{\circ}C$에서 효소활성이 가장 높았으며, $20{\sim}90^{\circ}C$ 온도에서 60분간 열처리시 효소 활성이 80%이상 유지되었다. 따라서 B. subtilis 4-1에 의해 생산되는 cellulase는 내알칼리성 효소로 추정되며, 높은 열에도 안정한 것으로 나타났다. B. subtilis 4-1이 생산하는 cellulase는 CMC에 가장 높은 효소활성을 나타내었으며 avicel과 pNPG에서도 활성을 보여 복합효소로 생각된다.
In this study, we isolated a cellulase-producing bacterium isolated from traditional Korean fermented soybean paste and investigated the effect of culture conditions on the production of cellulase. This bacterium, which was identified as Bacillus subtilis 4-1 through 16S rRNA gene sequence analysis,...
In this study, we isolated a cellulase-producing bacterium isolated from traditional Korean fermented soybean paste and investigated the effect of culture conditions on the production of cellulase. This bacterium, which was identified as Bacillus subtilis 4-1 through 16S rRNA gene sequence analysis, showed the highest cellulase activity when the cells were grown at $45^{\circ}C$ for 24 hours in the CMC medium supplemented with 1.0% of soluble starch and 0.1% yeast extract. The initial optimum pH of the medium was observed in the range of 5.0~9.0. The optimal pH and temperature for the production of cellulase from B. subtilis 4-1 were pH 9.0 and $60^{\circ}C$ respectively. In addition, the enzyme showed significant activity in the temperature range of $20{\sim}90^{\circ}C$, which indicates that B. subtilis 4-1 cellulase is an alkaline-resistance and thermo-stable enzyme. This enzyme showed higher activity with CMC as the substrate for endo-type cellulase than avicel or pNPG as the exo-type substrates for exo-type cellulase and ${\beta}$-glucosidase. These results suggest that the cellulase produced from B. subtilis 4-1 is a complex enzyme rather than a mono-enzyme.
In this study, we isolated a cellulase-producing bacterium isolated from traditional Korean fermented soybean paste and investigated the effect of culture conditions on the production of cellulase. This bacterium, which was identified as Bacillus subtilis 4-1 through 16S rRNA gene sequence analysis, showed the highest cellulase activity when the cells were grown at $45^{\circ}C$ for 24 hours in the CMC medium supplemented with 1.0% of soluble starch and 0.1% yeast extract. The initial optimum pH of the medium was observed in the range of 5.0~9.0. The optimal pH and temperature for the production of cellulase from B. subtilis 4-1 were pH 9.0 and $60^{\circ}C$ respectively. In addition, the enzyme showed significant activity in the temperature range of $20{\sim}90^{\circ}C$, which indicates that B. subtilis 4-1 cellulase is an alkaline-resistance and thermo-stable enzyme. This enzyme showed higher activity with CMC as the substrate for endo-type cellulase than avicel or pNPG as the exo-type substrates for exo-type cellulase and ${\beta}$-glucosidase. These results suggest that the cellulase produced from B. subtilis 4-1 is a complex enzyme rather than a mono-enzyme.
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문제 정의
본 연구에서는 한국의 대표 발효식품인 장류에서 cellulase 분비능이 뛰어난 균주를 분리·동정하였으며, 이들 미생물의 배양조건과 효소적 특성을 조사·분석함으로써 산업적으로 활용하는데 있어 기초자료를 제공하고자 한다.
제안 방법
B. subtilis 4-1 균주가 생산하는 cellulase 기질 특이성 확인을 위해, 각각 다른 기질(Avicel, Filter paper, CMC, pNPG)을 이용하여 효소활성을 측정하였다(Fig. 10). 분리균 B.
Cellulase 활성과 반응에 미치는 pH 및 온도 영향을 조사하기 위해, 선발 균주가 생산하는 조효소액을 사용하였다. 효소의 최적 pH를 조사하기 위해서, 조효소액을 아래의 각 pH별 완충용액에 넣고 50℃에서 반응시킨 후, 활성을 비교하였다.
16S rRNA 염기서열 확인은 (주)제노셀사에 의뢰하여 확인하였다(12). Lasergene사의 DNASTAR pro software(SeqMan Pro V8.0)와 The National Center for Biotechnology Information(NCBI, http://www. ncbi.nlm.nih.gov/)에서 제공하는 advanced blast search 프로그램을 통하여 GenBank에 보고된 유사 균주와의 염기서열을 비교하여 계통분류학적 유연관계를 분석한 후, MEGA v4.0을 이용하여 Tamura-Nei distance model과 neighbor-joining method에 의해 계통수를 작성하였다(13,14).
2% plant agar가 첨가된 R2A (LAB M, Lancashire, UK)배지에 도말하고 30℃에서 배양하였다. 각 배지에서 얻은 단일 균주의 replica plate를 만들고 24시간 배양한 후, 0.1% Congo red(Sigma) 용액으로 염색하였으며, 1 M NaCl로 세척한 후, 나타나는 투명환이 큰 균주들을 선발하였다.
0)에 접종하고, 30℃, 120 rpm에서 진탕 배양하면서 일정시간 별로 시료를 채취하였다. 배양온도는 20℃, 30℃, 37℃ 및 45℃, 초발 pH는 5.0～10.0로 각각 조절하였다. 영양원인 탄소원의 경우, CMC 대신 glucose, xylose, soluble starch, dextrin, cellulose를 각각 1.
본 실험에 수집한 전통 장류에서 시료를 채취하여 멸균된 생리식염수 (0.85% NaCl)에 현탁시켰으며, 각 단계별 희석액을 0.4% Na-carboxymethyl cellulose(Sigma, St. Louis, MO, USA)과 1.2% plant agar가 첨가된 R2A (LAB M, Lancashire, UK)배지에 도말하고 30℃에서 배양하였다. 각 배지에서 얻은 단일 균주의 replica plate를 만들고 24시간 배양한 후, 0.
선발된 균주는 16S rRNA 염기서열을 분석하여 균주를 최종 동정하였다. 선발된 균주의 16S rRNA 염기서열을 분석하기 위해, genomic DNA extraction kit(Qiagen, Germany)로 분리 균주의 genomic DNA를 추출하였으며, 유전자를 증폭하기 위해 primer로는 27F primer (AGAGTTTGATCMTGGCTCAG)와 1492R primer(TACGGYTACCTTGTTACGACTT)를 사용하였고, PCR은 initial denaturation 5분, 그리고 94°C에서 45초간 denaturation, 55°C에서 60초간 annealing 및 72°C에서 60초간 extension cycle을 35회 수행하였다.
선발된 균주의 16S rRNA 염기서열을 분석하기 위해, genomic DNA extraction kit(Qiagen, Germany)로 분리 균주의 genomic DNA를 추출하였으며, 유전자를 증폭하기 위해 primer로는 27F primer (AGAGTTTGATCMTGGCTCAG)와 1492R primer(TACGGYTACCTTGTTACGACTT)를 사용하였고, PCR은 initial denaturation 5분, 그리고 94°C에서 45초간 denaturation, 55°C에서 60초간 annealing 및 72°C에서 60초간 extension cycle을 35회 수행하였다.
0% CMC 용액을 기질로 사용하여 20℃에서 70℃까지 구간별로 반응시킨 후, 효소활성법(15)으로 측정하였다. 온도 안정성은 0.2 M sodium phosphate buffer(pH 7.0)에 1.0% CMC 용액을 기질로 사용하여 조효소액을 20℃에서 90℃까지 15～60분 동안 15분 간격으로 열처리한 후, 효소 활성을 분석(15)하였다.
조효소의 기질 특이성은 Avicel, filter paper (Whatman NO.1), CMC, p-nitrophenyl-β-D-glucoside (p-NPG) (Sigma,)를 각각 1% 기질용액을 제조하여 상기 서술한 효소 활성 측정법으로 효소활성을 비교하여 기질 특이성을 확인하였다(16,17).
Cellulase 활성과 반응에 미치는 pH 및 온도 영향을 조사하기 위해, 선발 균주가 생산하는 조효소액을 사용하였다. 효소의 최적 pH를 조사하기 위해서, 조효소액을 아래의 각 pH별 완충용액에 넣고 50℃에서 반응시킨 후, 활성을 비교하였다. 사용한 완충액은 0.
효소활성에 미치는 각종 저해제의 영향을 조사하기 위하여, phenylmethylsulfonyl fluoride(PMSF)(Sigma), ethylenediaminetetra acetic acid(EDTA)(Sigma), Iodoacetate, 1,10-phenanthroline(Sigma)과 p-chloro mercuribenzoate (p-CMB)(Sigma) 등 5종류의 저해제를 조효소액에 최종농도가 각각 1 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM과 40 mM이 되도록 첨가하여 50℃에서 30분간 처리한 후 효소활성을 측정하였다(15-17). 조효소의 기질 특이성은 Avicel, filter paper (Whatman NO.
대상 데이터
수집한 장류 시료에서 분리한 균주들을 CMC를 함유하는 배지에 접종하여 섬유소 분해 활성이 우수한 4-1 균주를 선발하였다. 4-1 균주의 16S rRNA 염기서열을 분석한 결과, B.
장류 시료에서 미생물을 1차 선별한 후, CMC를 함유한 배지에 접종하여 섬유소 분해 활성을 보유한 균주 중 가장 넓은 투명 환을 보여주는 4-1 균주를 선발하였다. 그리고 표준 균주(Bacillus subtilis KACC10114)와 분리균 4-1의 섬유소분해 효소활성 결과를 Fig.
이론/모형
선발된 균주의 16S rRNA 염기서열을 분석하기 위해, genomic DNA extraction kit(Qiagen, Germany)로 분리 균주의 genomic DNA를 추출하였으며, 유전자를 증폭하기 위해 primer로는 27F primer (AGAGTTTGATCMTGGCTCAG)와 1492R primer(TACGGYTACCTTGTTACGACTT)를 사용하였고, PCR은 initial denaturation 5분, 그리고 94°C에서 45초간 denaturation, 55°C에서 60초간 annealing 및 72°C에서 60초간 extension cycle을 35회 수행하였다. 16S rRNA 염기서열 확인은 (주)제노셀사에 의뢰하여 확인하였다(12). Lasergene사의 DNASTAR pro software(SeqMan Pro V8.
Cellulase 활성도는 DNS 환원당 정량법으로 측정하였다(15). 즉, 1.
즉, 1.0% CMC 500 μL, 200 mM sodium phosphaste buffer(pH 7.0) 250 μL를 2.0 mL tube에 넣은 후, 효소액 250 μL를 첨가하여 50℃에서 15분간 반응시킨 후, CMC로부터 유리된 glucose 함량을 DNS 환원당 정량법으로 측정하였다(15).
0% CMC 용액을 기질로 사용하여 cellulase 활성측정 방법(15)에 따라 측정하였다. 효소 반응의 최적온도를 조사하기 위해, 조효소액을 0.2 M sodium phosphate buffer(pH 7.0)에서 1.0% CMC 용액을 기질로 사용하여 20℃에서 70℃까지 구간별로 반응시킨 후, 효소활성법(15)으로 측정하였다. 온도 안정성은 0.
0)이다. 효소의 pH 안정성은 pH 4.0에서 pH 10.0까지 각 pH별 완충용액에 조효소액을 첨가하여 4℃에서 24시간 방치한 후, 각각 0.2 M sodium phosphate buffer(pH 7.0)에 1.0% CMC 용액을 기질로 사용하여 cellulase 활성측정 방법(15)에 따라 측정하였다. 효소 반응의 최적온도를 조사하기 위해, 조효소액을 0.
수집한 장류 시료에서 분리한 균주들을 CMC를 함유하는 배지에 접종하여 섬유소 분해 활성이 우수한 4-1 균주를 선발하였다. 4-1 균주의 16S rRNA 염기서열을 분석한 결과, B. subtilis로 동정되었다. B.
7(A)에 나타내었다. B. subtilis 4-1 균주가 생산하는 cellulase 활성은 pH 4.0에서 가장 낮았고, pH 5.0～10.0에서 모두 높게 나타났다. Kim 등(18)의 실험에서 B.
0에서 cellulase 효소활성이 높았다. B. subtilis 4-1의 조효소 특성은 효소반응의 최적 pH가 pH 9.0, 반응온도는 60℃에서 효소활성이 가장 높았으며, 20～90℃ 온도에서 60분간 열처리시 효소 활성이 80%이상 유지되었다. 따라서 B.
subtilis로 동정되었다. B. subtilis 4-1의 효소생산을 위한 최적 배양조건은 탄소원으로 1.0% soluble starch와 질소원으로 0.1% yeast extract를 첨가하여 45℃에서 24시간 배양하였을 때로 나타났다. 최적 배양 pH를 조사한 결과, pH 5.
8(A)와 같다. B.subtilis 4-1 균주가 생산하는 cellulase는 반응온도가 높아질수록 효소활성은 비례적으로 상승하였다. 그리고 반응온도 60℃에서 효소활성이 가장 높게 나타났으며, 70℃에서는 효소활성이 더 이상 증가하지는 않지만 60℃와 유사한 값으로 효소활성이 높게 유지되었다.
Hahm 등(21)은 Bacillus sp.가 CMC를 탄소원으로 사용하였을 때, 가장 높은 효소활성이 있다고 보고하였으나, 분리균 B. subtilis 4-1의 cellulase 활성을 분석한 결과(Fig. 5), soluble starch를 탄소원으로 사용하였을 때 가장 높은 효소활성이 나타났고 dextrin 첨가시에도 비교적 효소활성이 높게 나타났다. 그러나 soluble starch, dextrin과 CMC를 제외한 다른 탄소원을 사용하였을 때는 cellulase 활성이 나타나지 않았다.
6에 나타내었다. 균의 성장은 yeast extract를 질소원으로 첨가하였을 때 가장 높게 관찰되었으며, tryptone, skim milk, peptone, ammonium sulfate, ammonium chloride 순으로 균주의 생육이 저조한 것으로 나타났다. 특히, 균의 생육도와 같이 yeast extract를 질소원으로 첨가하였을 때 효소활성이 가장 높았는데 이는 Hahm 등(21)과 Jeong 등(24)이 질소원으로 1% yeast extract를 첨가하였을 때, 효소 활성이 가장 높았다는 결과와 일치하였다.
licheniformis DK42가 생산하는 cellulase는 45℃에서 효소활성이 매우 안정하게 유지되었으나 55℃ 이상의 온도에서는 거의 소실된다고 보고하였다. 그러나 B. subtilis 4-1 균주가 생산한 cellulase는 20～90℃에서 60분간 열처리를 하여도 효소활성이 80% 이상 유지되는 것으로 보아 분리균인 B. subtilis 4-1이 생성하는 cellulase는 높은 열에도 비교적 안정한 것으로 나타났다.
0에서 cellulase 활성이 60% 이상 유지되었다고 보고하였다. 그러나 B. subtilis 4-1이 생산하는 cellulase는 pH 4.0에서 효소활성이 약 70～80% 정도 유지되어 상대적으로 낮게 나타났지만, pH 5.0～10.0에서는 효소활성이 비교적 안정하여 거의 100%로 유지되었다. 따라서 B.
분리 균주의 생육은 30～37℃ 중온 조건에서 높은 생육활성을 보였으며, 특히 37℃ 배양조건에서 48시간 때 최대 생육활성을 나타내었다. 그러나 낮은 온도인 20℃에서는 초기 생육활성이 중온배양 조건에 비해 느리게 나타났으며, cellulase 활성 또한 완만히 증가하는 것으로 나타났다. 45℃ 배양조건에서는 배양 초기에 급격한 생육을 보였으며 배양 12시간째에 최대 생육을 보인 정지기에 도달한 후, 급격한 생육 저하로 완만한 곡선을 나타내었다.
와 높은 상동성을 가지고 있었다. 그리고 4-1 균주의 계통학적 유연관계를 16S rRNA 유전자의 염기서열을 기초로 Bacillus 속의 표준 종과의 유사도를 분석한 결과, B. subtilis로 동정되어 B. subtilis 4-1로 명명하였다(Fig. 2).
subtilis 4-1 균주가 생산하는 cellulase는 반응온도가 높아질수록 효소활성은 비례적으로 상승하였다. 그리고 반응온도 60℃에서 효소활성이 가장 높게 나타났으며, 70℃에서는 효소활성이 더 이상 증가하지는 않지만 60℃와 유사한 값으로 효소활성이 높게 유지되었다. 따라서 B.
0에서는 효소활성이 비교적 안정하여 거의 100%로 유지되었다. 따라서 B. subtilis 4-1 균주가 생산한 조효소의 pH 안정성은 매우 높은 것으로 나타났다.
그리고 반응온도 60℃에서 효소활성이 가장 높게 나타났으며, 70℃에서는 효소활성이 더 이상 증가하지는 않지만 60℃와 유사한 값으로 효소활성이 높게 유지되었다. 따라서 B. subtilis 4-1 균주의 효소반응 최적온도는 60～70℃인 것으로 나타났다. 이는 Jeong(25)이 분리한 Bacillus sp.
0, 반응온도는 60℃에서 효소활성이 가장 높았으며, 20～90℃ 온도에서 60분간 열처리시 효소 활성이 80%이상 유지되었다. 따라서 B. subtilis 4-1에 의해 생산되는 cellulase는 내알칼리성 효소로 추정되며, 높은 열에도 안정한 것으로 나타났다. B.
subtilis 449 반응 최적온도가 20℃로 나타난 결과보다 매우 높은 온도이다. 따라서 본 실험에서 분리한 B. subtilis 4-1 균주가 생산하는 cellulase의 최적반응 온도는 매우 높은 것으로 생각된다. 조효소의 온도 안정성을 조사하기 위하여, B.
3에 나타내었다. 분리 균주의 생육은 30～37℃ 중온 조건에서 높은 생육활성을 보였으며, 특히 37℃ 배양조건에서 48시간 때 최대 생육활성을 나타내었다. 그러나 낮은 온도인 20℃에서는 초기 생육활성이 중온배양 조건에 비해 느리게 나타났으며, cellulase 활성 또한 완만히 증가하는 것으로 나타났다.
10). 분리균 B. subtilis 4-1은 전체 cellulase의 활성을 나타내는 Filter paper activity(FPase) 뿐만 아니라 avicel과 pNPG에 대해서도 효소활성이 확인되었고, CMC를 기질로 사용하였을 때 가장 높은 효소활성을 나타냈다. 이는 섬유소를 분해하는 세균이 생산하는 cellulase가 avicel을 기질로 이용했을 때, 가장 많은 효소가 생산된다는 Chey 등(5)의 보고와는 차이가 있었지만 Kim 등(20)이 분리한 B.
21)의 기질로 이용되고 있는 pNPG에서도 활성이 나타났다. 이러한 결과로부터 B. subtilis 4-1 균주가 생성하는 cellulase는 단일 효소가 아니라 복합효소인 것으로 생각된다.
1% yeast extract를 첨가하여 45℃에서 24시간 배양하였을 때로 나타났다. 최적 배양 pH를 조사한 결과, pH 5.0～9.0에서 cellulase 효소활성이 높았다. B.
5에 나타내었다. 탄소원으로 1.0% soluble starch를 첨가하였을 때, 균의 생육과 효소활성이 가장 높게 나타났지만 glucose, xylose, dextrin, cellulose 첨가시 균의 생육이 매우 낮았다. Hahm 등(21)은 Bacillus sp.
후속연구
섬유소를 활용하기 위해, 이들 중합체를 분해하는 미생물 유래의 효소 발굴이 무엇보다도 중요한 연구 중의 하나라고 할 수 있으며, 향후 산업적으로 효소 자원을 활용하기 위해, 대량생산 및 유전자 확보 또한 효소 자원 발굴과 함께 반드시 병행되어야 할 중요한 연구 분야라고 할 수 있다(9).
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
알칼리성 유래 미생물이 생산하는 효소의 특징은?
0의 강알칼리 환경에서 생육하지만 중성 이하에서는 생육이 느린 미생물이다(1). 알칼리성 유래 미생물은 Bacillus 속 세균이 많이 분리되었고 이들이 생산하는 효소는 잡균 오염방지와 더불어 발효공업, 식품공업 및 세제공업 등 생물화학공업에 안정성을 부여하여 산업적으로 이용하려는 연구가 진행되고 있다(2).
알칼리 내성 미생물이란?
이러한 특수 환경에 서식하는 생물은 주변 환경조건에 적응할 수 있는 특별한 효소나 각종 대사산물을 생성하며 이들을 산업적으로 유용하게 활용할 수 있다. 그 중 알칼리 내성 미생물은 pH 9.0∼11.0의 강알칼리 환경에서 생육하지만 중성 이하에서는 생육이 느린 미생물이다(1). 알칼리성 유래 미생물은 Bacillus 속 세균이 많이 분리되었고 이들이 생산하는 효소는 잡균 오염방지와 더불어 발효공업, 식품공업 및 세제공업 등 생물화학공업에 안정성을 부여하여 산업적으로 이용하려는 연구가 진행되고 있다(2).
섬유소는 영양소 섭취라는 관점에서 어떻게 활용되고 있는가?
섬유소(cellulose)는 식물 세포막의 주요성분이며, 자연계에 널리 분포되어 있는 고분자 유기물질로 활용가치가 매우 높은 자원임에도 불구하고 이용은 제한적이다. 또한 영양소 섭취라는 관점에서는 부분적으로 반추동물이나 일부 미생물에 의해 분해․이용될 뿐 대부분이 그대로 폐기되고 있는 실정이다(3).
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