본 연구의 목적은 항생제 내성 균과 유전자 및, 항생제 내성 전달을 제어하는데 필요한 살균능 (CT, 농도 * 접촉 시간)을 서로 비교하는데 있다. 이를 위하여, 이를 위해 각기 다른 염소 주입농도(C)와 접촉시간(T)에 따라 각각의 항생제 내성 제거를 산정하였다. 그 결과 항생제 내성균 90%(1 log)이상 제어를 위해서는 CT 값(176~353 mg min/L)이 필요하였으며, 항생제 내성 유전자의 제거를 위한 CT 값은 195~372 mg min/L 이었다. 또한 항생제 내성 유전자의 전이 90% 이상 제거를 위한 CT 값은 187~489 mg min/L이었다. 따라서, 본 연구조건에서는 항생제 내성 유전자 및 유전자의 전이에 대한 제어를 위해서는 항생제 내성균 제어보다 더 높은 소독능이 필요함을 알 수 있었다.
본 연구의 목적은 항생제 내성 균과 유전자 및, 항생제 내성 전달을 제어하는데 필요한 살균능 (CT, 농도 * 접촉 시간)을 서로 비교하는데 있다. 이를 위하여, 이를 위해 각기 다른 염소 주입농도(C)와 접촉시간(T)에 따라 각각의 항생제 내성 제거를 산정하였다. 그 결과 항생제 내성균 90%(1 log)이상 제어를 위해서는 CT 값(176~353 mg min/L)이 필요하였으며, 항생제 내성 유전자의 제거를 위한 CT 값은 195~372 mg min/L 이었다. 또한 항생제 내성 유전자의 전이 90% 이상 제거를 위한 CT 값은 187~489 mg min/L이었다. 따라서, 본 연구조건에서는 항생제 내성 유전자 및 유전자의 전이에 대한 제어를 위해서는 항생제 내성균 제어보다 더 높은 소독능이 필요함을 알 수 있었다.
The purpose of this study is to compare CT (disinfectant concentration * time) values in removing the antibiotic resistance bacteria, antibiotic resistance gene and transfer of antibiotic resistance genes. Different concentration of chlorine(C) and contact time(T) according to the removal of antibio...
The purpose of this study is to compare CT (disinfectant concentration * time) values in removing the antibiotic resistance bacteria, antibiotic resistance gene and transfer of antibiotic resistance genes. Different concentration of chlorine(C) and contact time(T) according to the removal of antibiotic resistance was calculated for each. As a result, for the 90% removal of antibiotic resistant bacteria, around 176~353 mg min/L CT values are needed. For the removal of the antibiotic resistance gene, 195~372 mg min/L CT values are required. For the 90% reduction of antibiotic resistance gene transfer by chlorine disinfection, 187~489 mg min/L CT values are needed. Based on our results, higher CT value was required for removing antibiotic resistant genes rather than antibiotic resistance bacteria.
The purpose of this study is to compare CT (disinfectant concentration * time) values in removing the antibiotic resistance bacteria, antibiotic resistance gene and transfer of antibiotic resistance genes. Different concentration of chlorine(C) and contact time(T) according to the removal of antibiotic resistance was calculated for each. As a result, for the 90% removal of antibiotic resistant bacteria, around 176~353 mg min/L CT values are needed. For the removal of the antibiotic resistance gene, 195~372 mg min/L CT values are required. For the 90% reduction of antibiotic resistance gene transfer by chlorine disinfection, 187~489 mg min/L CT values are needed. Based on our results, higher CT value was required for removing antibiotic resistant genes rather than antibiotic resistance bacteria.
* AI 자동 식별 결과로 적합하지 않은 문장이 있을 수 있으니, 이용에 유의하시기 바랍니다.
문제 정의
또한 염소 소독 이후에도 잔류할 수 있는 내성 유전자(pB10 플라스미드)가 다른 환경 미생물로의 2차 오염을 야기시킬 수 있다. 따라서 본 연구에서는 mating 실험을 통하여 염소로 소독을 시킨 샘플의 내성 유전자가 다른 환경 미생물(Pseudomonas aeruginosa)로의 전이를 알아보았다. 그림 3의 결과를 보면, 내성 유전자의 전이 감소율, 90% 이상(1log, 2log, 3log)을 위한 CT값은 적어도 187∼489 mg·min/L이 필요하였다.
즉 수계에서의 항생제 내성유전자의 사멸 또는 전이정도를 파악하는 기법을 개발하여 항생제 내성균의 사멸과의 비교가 필요하다. 따라서, 본 연구의 목표는 항생제 내성균의 제거, 항생제 내성 유전자의 제거 및 항생제 내성 전달의 감소에 필요한 소독능을 비교 검토하는데 있다.
본 연구에서는 기존의 염소 소독공정을 continuous test로 구현하고 항생제 내성균 및 내성 유전자의 제어를 위한 CT 값을 산정하였다. 이에 따른 결론은 다음과 같다.
본 연구에서는 완전한 항생제 내성 제어를 위해선 항생제 내성균뿐만 아니라 유전자 및 유전자 전달에 대한 제어가 필요하고 이에 대한 더 높은 CT 값이 필요함을 알 수 있었다. 즉 소독공정 이후 항생제 내성균이 90%이상 제어 되었음에도 불구하고 잔류하게 되는 항생제 내성 유전자는 수계내에 존재하여 추후 다른 미생물로 전이가 되고, 소독으로 사멸되거나 피해를 입은 항생제 내성균 역시 불활성화 되는 것이 아니라 다른 미생물로의 전이가 가능할 수도 있다.
제안 방법
2.2.2 항생제 내성 유전자 전이 감소율 산정 앞선 결과에서는 항생제 내성균과 항생제 내성 유전자의 소독 효율을 CT값에 따라 비교하였다. 그 결과, 항생제 내성균과 내성 유전자의 90% 이상 제어함에 있어, 내성균의 제어 보다는 내성 유전자의 제어에 높은 소독능(CT값)이 필요하다.
염소 소독 후에 제어된 항생제 내성은 다음의 세 가지 기법을 확립하여 소독능을 비교하는데 사용되었다. 판단 기법으로는 1) 항생제 내성균(Antibiotic Resistance Bacteria), 2) 항생제 내성 유전자(Antibiotic Resistance Gene), 3) 항생제 내성 유전자 전달율(Antibiotic Resistance Gene Transfer)순으로 선정하여 판단하였다.
Continuous 조건에서 염소 소독 kinetic 값을 Chick & Waston equation을 이용하여 항생제 내성균, 항생제 내성 유전자 및 내성 유전자의 전달율로 각각 산정하고, 1 3 Log가 되는 CT 값을 산출하여 비교 하였다.
또한 소독에 영향을 받지 않은 항생제 내성 유전자(pB10 plasmid, standard solution)를 10배씩 희석을 하여 PCR template에 주입을 함으로서 순수 pB10 plasmid 의 검량선(standard curve)를 작성할 수 있도록 하였다. SYBR Green PCR Master Mix(PKT) 10ul 와 P1 primer 1ul, P2 Primer 1ul를 주입하고 마지막으로 희석된 sample 또는 standard solution을 각각 8ul 씩 주입하여 template의 각 셀에 총 20ul가 되도록 한다. 이후 1500rpm 으로 약 20초간 centrifuge를 시킨 후 qPCR을 진행한다.
kinetic 실험을 통하여 구해진 각각의 1log, 2log와 3log 까지의 제거율에 필요한 CT값을 각각 산출하였다.
6으로 맞춘 후에 원심분리기를 이용하여 cell을 모았다. 또한 Recipient인 Pseudomonas aeruginosa를 Donor [E.coli DH5ɑ(pB10)]와 같은 광학 밀도(OD = 1.3)로 배양 한 후 같은 방법으로 cell을 모았다. 이후 두 개의 cell을 혼합하여 LB+Agar plate를 37℃ 의 incubator에서 16시간 동안 배양시켰다.
플라스미드 sample을 총 부피 15ul, 플라스미드 농도가 5ug/ul가 되도록 PCR template에 주입한다. 또한 소독에 영향을 받지 않은 항생제 내성 유전자(pB10 plasmid, standard solution)를 10배씩 희석을 하여 PCR template에 주입을 함으로서 순수 pB10 plasmid 의 검량선(standard curve)를 작성할 수 있도록 하였다. SYBR Green PCR Master Mix(PKT) 10ul 와 P1 primer 1ul, P2 Primer 1ul를 주입하고 마지막으로 희석된 sample 또는 standard solution을 각각 8ul 씩 주입하여 template의 각 셀에 총 20ul가 되도록 한다.
coli(pB10))의 제거 여부는 LB+Agar 배지에 살균된 시료를 희석배수에 맞춰 도말하여 16시간동안 37℃ incubator에서 배양을 하고 자라난 콜로니 (colony, CFU/mL) 수로 판단하였다. 또한 염소소독을 실시하지 않은 시료에서 자란 콜로니수를 상대적으로 비교하여 생존율을 계산하였다(%).
또한 항생제 내성균과 동일한 소독 실험을 진행하여 추출된 샘플에서 항생제 내성균과 마찬가지로 항생제 내성 유전자의 제거효율을 산정하였다. 그림 2에서는 항생제 내성 유전자90% 이상의 제거율(1log, 2log, 3log)에 필요한 CT값을 나타낸 그림이다.
Continuous 조건에서 염소 소독 kinetic 값을 Chick & Waston equation을 이용하여 항생제 내성균, 항생제 내성 유전자 및 내성 유전자의 전달율로 각각 산정하고, 1 3 Log가 되는 CT 값을 산출하여 비교 하였다. 먼저 각 시간별로 소독에 의해 생존한 항생제 내성균 및 내성 유전자와 내성 유전자의 전달율(Nt) 대비 소독에 영향을 받지 않은 항생제 내성균 및 내성 유전자와 내성 전달율(N0)에 자연로그 ln을 곱하여 시간별 --ln(Nt/N0)값의 그래프를 그렸다. 각각의 그래프에서 90%이상의 제거되는 즉, -ln(1/100) = 2.
본 연구에서는 항생제 내성균(E.coli(pB10)) 제어를 위한 CT값을 산정하였다. 항생제 내성균과 농도(C) 별로 염소를 접촉하였고 시간(T)에 따른 항생제 내성균의 제어를 chick & watson 공식을 이용하여 값을 도출하였다.
6을 유지하도록 하였다. 사용된 염소농도(Cl2)는 각각 0, 3, 7.5, 20 mg/L를 사용하였으며, 접촉시간동안에는 20℃ Incubator에서 150rpm으로 지속적으로 혼합시켰다. 이 염소 소독 실험은 각각 2번씩 실시하여 결과의 재연성을 살펴보았다.
coli DH5ɑ(pB10)은 gentamycin에 대해 살아남을 수 없기에 두 개의 항생제가 혼합된 media에서 살아남은 미생물은 Pseudomonas aeruginosa (pB10)만 된다. 소독에 따른 전이 감소율은 소독하지 않은 혼합균주 내에서 pB10플라스미드를 전달받은 recipient colony 수(CFU/mL) 대비, 소독에 노출된 donor와 혼합된 균주 내에서 pB10 플라스미드를 받은 recipient 콜로니수(CFU/mL)로 산정하였고 이를 식으로 나타내면 다음과 같다.
염소 소독 후에 제어된 항생제 내성은 다음의 세 가지 기법을 확립하여 소독능을 비교하는데 사용되었다. 판단 기법으로는 1) 항생제 내성균(Antibiotic Resistance Bacteria), 2) 항생제 내성 유전자(Antibiotic Resistance Gene), 3) 항생제 내성 유전자 전달율(Antibiotic Resistance Gene Transfer)순으로 선정하여 판단하였다.
염소소독 이후 항생제 내성 유전자(pB10 플라스미드)의 제거 여부를 판단하기 위해서 정량 PCR(quantitative PCR, qPCR)을 진행하였다. 이를 위한 방법은 다음과 같다.
염소소독 이후 항생제 내성 유전자가 다른 환경 미생물(Pseudomonas aeruginosa)로의 전이율을 산정하기 위하여 다음의 mating 실험방법을 수행하였다.
염소소독을 마친 시료에서의 항생제 내성균(E.coli(pB10))의 제거 여부는 LB+Agar 배지에 살균된 시료를 희석배수에 맞춰 도말하여 16시간동안 37℃ incubator에서 배양을 하고 자라난 콜로니 (colony, CFU/mL) 수로 판단하였다. 또한 염소소독을 실시하지 않은 시료에서 자란 콜로니수를 상대적으로 비교하여 생존율을 계산하였다(%).
5, 20 mg/L를 사용하였으며, 접촉시간동안에는 20℃ Incubator에서 150rpm으로 지속적으로 혼합시켰다. 이 염소 소독 실험은 각각 2번씩 실시하여 결과의 재연성을 살펴보았다.
이후 두 개의 cell을 혼합하여 LB+Agar plate를 37℃ 의 incubator에서 16시간 동안 배양시켰다. 이후 배지에서 donor cell로부터 pB10 플라스미드를 받은 recipient cell(transconjugant cell)을 개수하기 위하여 두 개의 항생제(tetracycline 2ppm + gentamycin 10ppm)가 들어있는 plate에 다시 배양시켜 개수하였다. 사용된 Pseudomonas aeruginosa는 gentamycin에 저항성을 가지나, E.
준비된 항생제 내성균 시료의 농도는 108 CFU/mL 이었다. 준비된 시료에 차아염소산 나트륨(NaOCl)으로 특정 염소 농도를 주입하여 시간별로 시료를 추출하여 항생제 내성의 제거 정도를 살펴보았다. 반응 시간 동안에는 염산(HCl 1+500)을 이용하여 초기 pH 7.
, 2003). 항생제 내성 유전자 전달은 위의 E.coli DH5./pB10를 donor로 사용하고 gentamycin에 저항을 가지면서 tetracycline에는 감수성을 가진 Pseudomonas aeruginosa를 recipient로 사용하여 실시하였다. 각각에 대한 자세한 소독 방법에 따른 산정방법은 아래 2.
항생제 내성 제거를 위한 염소 소독 실험은 continous 조건에서 진행하였다. 이를 위해 O.
대상 데이터
본 연구에서는 항생제 다제 내성 플라스미드(pB10)를 포함한 Escherichia coli DH5.(이하 E.coli DH5./pB10)를 모델 항생제 내성균으로 사용하였다. 모델 항생제 내성유전자는 pB10을 사용하였는데 이는 다제 항생제 내성(amoxicillin, streptomycin, sulfame thoxazole, tetracycline) 및 수은(mercury) 내성 플라스미드로, 여러 종류의 환경 미생물들에 전달될 수 있는 플라스미드이다(Schluter et al.
이론/모형
항생제 내성균과 농도(C) 별로 염소를 접촉하였고 시간(T)에 따른 항생제 내성균의 제어를 chick & watson 공식을 이용하여 값을 도출하였다.
성능/효과
1) 항생제 내성균(E.coli DH5./pB10)의 1 log 이상의 제어를 위해서는 176∼353 mg·min/L 이상의 CT값이 필요하다.
2) 항생제 내성 유전자(pB10 플라스미드)의 1 log 이상의 제어 또한 195∼372 mg·min/L 이상의 CT값이 필요하다. 하지만 전체적으로 항생제 내성 유전자는 항생제 내성균에 비해 약 5∼10%이상 높은 생존율을 보이고 있다.
3) 항생제 내성 유전자와 비슷한 형태로 환경미생물로의 내성 유전자 전이율도 내성균의 제어에 비해 높았다. 따라서 항생제 내서 유전자의 제어를 위해서는 내성균의 제어보다는 높은 살균 효율이 필요하다.
2 항생제 내성 유전자 전이 감소율 산정 앞선 결과에서는 항생제 내성균과 항생제 내성 유전자의 소독 효율을 CT값에 따라 비교하였다. 그 결과, 항생제 내성균과 내성 유전자의 90% 이상 제어함에 있어, 내성균의 제어 보다는 내성 유전자의 제어에 높은 소독능(CT값)이 필요하다. 또한 염소 소독 이후에도 잔류할 수 있는 내성 유전자(pB10 플라스미드)가 다른 환경 미생물로의 2차 오염을 야기시킬 수 있다.
그림 1의 결과 그림을 살펴보면, 90% 내성균 제어를 위해서는 176 353의 CT값(mg·min/L)이 필요하고, 99%(2 log), 99.9%(3 log) 의 내성균 제어를 위해서는 각각 369 739 mg·min/L, 553 1107 mg·min/L의 CT값이 요구된다.
기존의 하수처리장에서 사용되는 염소 농도 및 접촉시간이 10∼20 mg/L와 10분(Ministry of Environment, 2009)이라고 볼 때, 현재 사용되는 CT값의 최대치는 100∼200 mg·min/L 로 보여지며, 본 연구를 기준으로 보았을 때, 90%의 항생제 내성균, 내성 유전자 및 내성 유전전이를 제어하기에 부족한 것으로 보여진다.
따라서 본 연구의 목적인 90%(1 log)이상의 내성균 제어를 위해서는 적어도 176 353 이상의 CT값(mg·min/L)이 필요하다.
즉 소독공정 이후 항생제 내성균이 90%이상 제어 되었음에도 불구하고 잔류하게 되는 항생제 내성 유전자는 수계내에 존재하여 추후 다른 미생물로 전이가 되고, 소독으로 사멸되거나 피해를 입은 항생제 내성균 역시 불활성화 되는 것이 아니라 다른 미생물로의 전이가 가능할 수도 있다. 따라서, 염소로 항생제 내성을 제어하기 위해서는 항생제 내성균뿐만 아니라 항생제 내성 유전자에 대해서도 필요함을 알 수 있었다.
또한 항생제 내성균 제어에 필요한 CT값에 비해 항생제 내성 유전자 제어에 필요한 CT값이 약 5∼10% 이상 높은 걸로 보아 항생제 내성 유전자의 제어를 위해서는 내성균보다 높은 소독능이 필요함을 알 수 있다.
9%(3 log)의 제거율을 위해서는 614∼1167 CT값(mg·min/L)이 필요하였다. 본 연구에서 산출한 항생제 내성균 및 내성 유전자의 제거율을 위한 CT값은 기존 연구에서 제시한 박테리아 및 바이러스 제거를 위한 CT값에 비해 약 10배 이상 높았다. 또한 항생제 내성균 제어에 필요한 CT값에 비해 항생제 내성 유전자 제어에 필요한 CT값이 약 5∼10% 이상 높은 걸로 보아 항생제 내성 유전자의 제어를 위해서는 내성균보다 높은 소독능이 필요함을 알 수 있다.
항생제 내성 유전자의 CT값(195∼372 mg·min/L)과 항생제 내성균의 CT값(176∼353 mg·min/L)과 비교해 보았을 때, 항생제 내성 유전자의 감소와 항생제 내성 전이율은 연관이 있어 보이고, 가장 높은 CT 값을 요구한다.
후속연구
기존의 하수처리장에서 사용되는 염소 농도 및 접촉시간이 10∼20 mg/L와 10분(Ministry of Environment, 2009)이라고 볼 때, 현재 사용되는 CT값의 최대치는 100∼200 mg·min/L 로 보여지며, 본 연구를 기준으로 보았을 때, 90%의 항생제 내성균, 내성 유전자 및 내성 유전전이를 제어하기에 부족한 것으로 보여진다. 물론 본 연구는 실험실 조건에서 이루어진 연구이기에 일반화 하기는 어려우나, 이전연구에서도 염소소독에 의한 항생제 내성균 및 유전자 제어가 쉽지 않음을 보고하므로(Murray, 1984) 이에 대한 추가적인 연구가 필요하다.
본 연구에서는 완전한 항생제 내성 제어를 위해선 항생제 내성균뿐만 아니라 유전자 및 유전자 전달에 대한 제어가 필요하고 이에 대한 더 높은 CT 값이 필요함을 알 수 있었다. 즉 소독공정 이후 항생제 내성균이 90%이상 제어 되었음에도 불구하고 잔류하게 되는 항생제 내성 유전자는 수계내에 존재하여 추후 다른 미생물로 전이가 되고, 소독으로 사멸되거나 피해를 입은 항생제 내성균 역시 불활성화 되는 것이 아니라 다른 미생물로의 전이가 가능할 수도 있다. 따라서, 염소로 항생제 내성을 제어하기 위해서는 항생제 내성균뿐만 아니라 항생제 내성 유전자에 대해서도 필요함을 알 수 있었다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
본 연구에서 항생제 내성 제거를 위한 염소 소독 실험은 어떻게 진행되었는가?
항생제 내성 제거를 위한 염소 소독 실험은 continous 조건에서 진행하였다. 이를 위해 O.D. 값이 1.3에 도달한 항생제 내성균 (E.coli DH5./pB10) 50mL 시료를 원심분리시켜 상징수를 버린 후, 0.63M phosphate buffer solution의 버퍼로 세척, 원심분리 후 다시 재 부유 시켜 시료를 준비하였다. 준비된 항생제 내성균 시료의 농도는 108 CFU/mL 이었다. 준비된 시료에 차아염소산 나트륨(NaOCl)으로 특정 염소 농도를 주입하여 시간별로 시료를 추출하여 항생제 내성의 제거 정도를 살펴보았다. 반응 시간 동안에는 염산(HCl 1+500)을 이용하여 초기 pH 7.6을 유지하도록 하였다. 사용된 염소농도(Cl2)는 각각 0, 3, 7.5, 20 mg/L를 사용하였으며, 접촉시간동안에는 20℃ Incubator에서 150rpm으로 지속적으로 혼합시켰다. 이 염소 소독 실험은 각각 2번씩 실시하여 결과의 재연성을 살펴보았다.
모델 항생제 내성유전자인 pB10는 무엇인가?
/pB10)를 모델 항생제 내성균으로 사용하였다. 모델 항생제 내성유전자는 pB10을 사용하였는데 이는 다제 항생제 내성(amoxicillin, streptomycin, sulfame thoxazole, tetracycline) 및 수은(mercury) 내성 플라스미드로, 여러 종류의 환경 미생물들에 전달될 수 있는 플라스미드이다(Schluter et al., 2003). 항생제 내성 유전자 전달은 위의 E.
수계에서의 항생제 내성유전자의 사멸 또는 전이정도를 파악하는 기법을 개발하여 항생제 내성균의 사멸과의 비교가 필요한 이유는 무엇인가?
즉 사멸되거나 상처받은 내성균은 기존의 배양방법을 통해 제거 정도를 산정할 경우 자라지 않기 때문에 제거 된 것으로 판단된다. 그러나, 항생제 내성유전자가 유전전이 벡터(vector) (예, plasmid)에 존재하게 되면 이를 포함하는 항생제 내성균이 죽었다하더라도 이러한 유전물질은 미생물간의 접촉을 통해 다른 환경 미생물에게 전달될 수 있다(Dodd, 2012). 즉 수계에서의 항생제 내성유전자의 사멸 또는 전이정도를 파악하는 기법을 개발하여 항생제 내성균의 사멸과의 비교가 필요하다.
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