[논문]지방산 종류에 따른 Diacylglycerol의 효소적 개질 연구

이미영; 홍순택; 이기택

doi:10.7744/cnujas.2014.41.2.141

지방산 종류에 따른 Diacylglycerol의 효소적 개질 연구
Enzymatic modification of diacylglycerol with different type of fatty acids 원문보기

농업과학연구 = CNU Journal of agricultural science, v.41 no.2, 2014년, pp.141 - 147

이미영 (충청남도 보건환경연구원) , 홍순택 (충남대학교 식품공학과) , 이기택 (충남대학교 식품공학과)

Abstract ▼ AI-Helper

Diacylglycerol-oil (DAG oil) and four kinds of fatty acids [C16:0, C18:0, perillar oil-hydrolyzate(C18:3, 59.7%) and docosahexaenoic acid(DHA, C22:6, 63.7%)] were enzymatically esterified with 1:0.5, 1:1 and 1:1.5 molar ratio (DAG oil: fatty acids) to produce structured DAG. The reaction mixture were catalyzed by addition of sn-1,3 specific Lipozyme RMIM with 10 wt% of total substrates, and reacted for 1, 3, 6 and 24 hr at $62^{\circ}C$ with 220 rpm on the shaking water bath. The produced DAG were analyzed by TLC. In the result, the proportion of each fatty acid [(C16:0, C18:0, perilla oil-hydrolysate(C18:3, 59.7%) and DHA(C22:6, 63.7%)] on DAG products were increased as molar ratios of substrate increased. Among them, DHA showed the least reaction rate in which 24.2 % of DHA was found in the structured DAG molecules after 24 hr reaction with 1:1.5 molar substrate amount ratio.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

한편, 위의 반응 중에 1,2-DAG 및 1,3-DAG의 합성 이외에 MAG 및 TAG 분자들의 합성도 이루어 졌고 이에 함성된 DAG이외의 acylglycerol 조성에 대하여 알아보았다.

제안 방법

2 ㎛ film thickness, Bellefonate, PA, USA)를 이용하였으며, detector는 fame ionized detector(FID), column 온도는 150℃에서 5 min 동안 유지시키고 4℃/min씩 220℃까지 증가시킨 후 45 min 동안 유지하였다. Carrier gas는 1 mL/min유속으로 헬륨가스를 사용하였고 injector 온도와 detector 온도는 각각 250℃와 260℃에서 분석하였다. Split ratio는 50:1로 하고 시료는 1 μL를 injector에 주입하여 실시하였다.
DAG oil(C18:2 53.7%, DAG 87%)과 C16:0, C18:0, perilla oil hydrolysate (C18:3 59.7%)와 고DHA(C22:6, 63.7%)의 지방산 4종을 1:0.5, 1:1, 1:1.5 몰 비율로 혼합하고 TAG의 sn-1,3 위치특이성을 갖는 고정화 효소 Lipozyme RMIM을 혼합한 총 기질 질량의 10% 해당하는 양을 첨가하여 shaking water bath에서 반응하였다. 반응기는 screw 마개가 달린 200 mL 유리 삼각플라스크를 사용하였으며 62℃를 유지하면서 220 rpm으로 교반하면서 1, 2, 3, 6, 24 hr 반응하였고, 각 반응 시간마다 시료 2 mL씩 취하여 PTFE syringe filter(25 mm, 0.
DAG oil과 4종 지방산의 합성으로 얻어진 재구성 DAG 의 지방산 조성을 분석하기 위하여 유지 혼합물의 효소반응 1, 2, 3, 6, 24 hr 마다 반응물을 취하여 여과한 후, 20μL를 취하여 n-hexane 40 μL에 녹여 hexane : diethylether : acetic acid (50:50:1, v:v:v) 혼합용액을 전개용매로 하여 thin-layer chromatography (TLC, silica gel 60F254, 20×20 cm, Merck, Germany)를 실시한 후, 0.2% 2,7- dichlorofluorescein (in methanol)을 분무하여 254 ㎚ UV lamp에서 구분되어지는 각 band 부분(MAG, 1,2-DAG, 1,3-DAG, TAG)을 긁어 test tube에 취하여 methylation 한 후 지방산을 분석하였다.
DAG oil과 지방산 4종〔C16:0, C18:0, perillar oil 가수 분해물(C18:3 59.7%), DHA(C22:6 63.7%)〕을 기질로 하여 혼합 비율을 각각 1:0.5, 1:1, 1:1.5 몰로 달리하고, sn-1,3위치 특이성이 있는 고정화 효소 Lipozyme RMIM(Rhizomucor miehei)을 총 기질의 10 wt%를 가하여 62℃, 220 rpm을 유지하면서 1, 3, 6, 24 h 반응시켜 시간별로 재구성 DAG를 합성하였다. 지방산 조성을 분석한 결과 반응기질로 사용한 지방산 모두 [C16:0, C18:0, perillar oil hydrolysate (C18:3, 59.
7%)〕을 기질로 하여 esterification 반응 후 이들 지방산이 DAG 분자에 결합된 재구성 DAG를 합성하였다. 각 기질의 사용량과 반응시간을 달리하면서 얻어진 재구성 DAG의 fatty acid 조성을 분석하고, HPLC를 이용하여 acylglycerol 조성을 분석하였다.
5 몰 비율로 혼합하고 TAG의 sn-1,3 위치특이성을 갖는 고정화 효소 Lipozyme RMIM을 혼합한 총 기질 질량의 10% 해당하는 양을 첨가하여 shaking water bath에서 반응하였다. 반응기는 screw 마개가 달린 200 mL 유리 삼각플라스크를 사용하였으며 62℃를 유지하면서 220 rpm으로 교반하면서 1, 2, 3, 6, 24 hr 반응하였고, 각 반응 시간마다 시료 2 mL씩 취하여 PTFE syringe filter(25 mm, 0.45 ㎛)를 사용하여 lipase와 불순물을 제거하여 재구성 DAG를 얻었다. 이렇게 얻은 재구성 DAG를 대상으로 gas chromatography(GC)와 HPLC를 이용하여 지방산 및 acylglycerol의 조성을 분석하였다.
본 연구는 시판된 DAG oil과 탄소길이와 불포화도가 다른 지방산 4종〔C16:0, C18:0, perilla oil hydrolysate(C18:3, 59.7%), DHA(C22:6, 63.7%)〕을 기질로 하여 esterification 반응 후 이들 지방산이 DAG 분자에 결합된 재구성 DAG를 합성하였다. 각 기질의 사용량과 반응시간을 달리하면서 얻어진 재구성 DAG의 fatty acid 조성을 분석하고, HPLC를 이용하여 acylglycerol 조성을 분석하였다.
4% acetic acid를 첨가하여 사용하였고, 유속은 1 mL/min으로 하였다. 시료를 주입한 후 5 min 동안 이동상 A를 흘려주었고 10 min 동안 이동상 A와 B의 부피 비를 80:20으로 변화시킨 후 2 min 동안 유지한 후 다시 5 min 동안 이동상 A로 변화시킨 후 8 min 동안 유지하며 분석하였다. 검출기의 온도는 40℃로 하였고 질소가스의 유속은 2.
그리고 isooctane 2 mL와 포화 NaCl용액 1 mL를 가하여 충분히 vortex한 후 층의 분리가 용이하도록 원심분리(2000 rpm, 5 min) 하였다. 유기용매 층인 상층을 취하여 sodium sulfate anhydrous column을 통과시켜 수분과 불순물을 제거한 후 gas chromatography(Hewlett-Packard 6890 series, Avondale, PA, USA)를 이용하여 지방산 조성을 분석하였다. Column은 SP^TM-2560(100 m×0.
45 ㎛)를 사용하여 lipase와 불순물을 제거하여 재구성 DAG를 얻었다. 이렇게 얻은 재구성 DAG를 대상으로 gas chromatography(GC)와 HPLC를 이용하여 지방산 및 acylglycerol의 조성을 분석하였다.
재구성 DAG의 acylglycerol(MAG, DAG, TAG)의 조성을 알아보기 위해 normal phase HPLC를 실시하였다(Jeon et al., 2010). HPLC(Younglin Acme, Anyang, Korea)는 dual pump(SP 930D, Younglin, Anyang, Korea)가 장착된 것을 사용하였으며, detector는 evaporate light scattering detector(ELSD, SEDEX Model 75, SEDERE, Alfortville, France)를 column은 Hypersil BDS CPS 5 μL(250×4.

대상 데이터

HPLC(Younglin Acme, Anyang, Korea)는 dual pump(SP 930D, Younglin, Anyang, Korea)가 장착된 것을 사용하였으며, detector는 evaporate light scattering detector(ELSD, SEDEX Model 75, SEDERE, Alfortville, France)를 column은 Hypersil BDS CPS 5 μL(250×4.6 mm, Themo Hypersil LTD., Cheshire, UK)를 사용하였다.
새로운 지방산 조성의 지질을 합성하기 위해 사용한 효소는 Rhizomucor miehei로부터 얻은 TAG의 sn-1,3 위치특이성이 있는 lipase를 macroporous anion exchange resin에 고정시킨 Lipozyme RMIM을 Novo Nordisk Biochem. North American Inc. (Franklinton, NC, USA)로부터 구입하였다. 지방산 분석 시 지방산의 methyl ester를 위해 사용한 10% BF₃-methanol은 Supelco(Belle fonte, PA, USA)에서 구입하였고, 그 외 기기분석에 사용된 용매는 모두 high performance liquid chromatography(HPLC) grade를 사용하였다.
본 실험에서 기질로 사용한 DAG oil(87% DAG 함유)은 C사로부터 제공 받았으며, perilla oil hydrolysate는 대전 유성 하나로 마트에서 구입한 O사의 들기름으로 제조하여 사용하였다. 고DHA 지방산은 네오메가(대전)에서 공급받았다. 새로운 지방산 조성의 지질을 합성하기 위해 사용한 효소는 Rhizomucor miehei로부터 얻은 TAG의 sn-1,3 위치특이성이 있는 lipase를 macroporous anion exchange resin에 고정시킨 Lipozyme RMIM을 Novo Nordisk Biochem.
본 실험에서 기질로 사용한 DAG oil(87% DAG 함유)은 C사로부터 제공 받았으며, perilla oil hydrolysate는 대전 유성 하나로 마트에서 구입한 O사의 들기름으로 제조하여 사용하였다. 고DHA 지방산은 네오메가(대전)에서 공급받았다.
(Franklinton, NC, USA)로부터 구입하였다. 지방산 분석 시 지방산의 methyl ester를 위해 사용한 10% BF₃-methanol은 Supelco(Belle fonte, PA, USA)에서 구입하였고, 그 외 기기분석에 사용된 용매는 모두 high performance liquid chromatography(HPLC) grade를 사용하였다.

데이터처리

Split ratio는 50:1로 하고 시료는 1 μL를 injector에 주입하여 실시하였다. 지방산 조성은 peak area의 상대적인 비로 나타내었으며(Korea Food and Drug Administration, 2011), 2반복 분석하여 평균값을 구하였다.

성능/효과

5 area%를 보이면서 증가하였다. 다른 mole비율로 고DHA를 기질로 사용하였을 경우에는 가장 긴 24시간 반응에서도 최대 24.2 area%를 보여 다른 지방산 기질로 사용된 C16:0, C18:0, C18:3 보다 낮은 반응율을 보였다.
7 area%로써, 99%이상의 palmitic acid와 stearic acid로 이루어진 다른 지방산 기질(C16:0과 C18:0)보다는 순도가 낮았다. 따라서 실험된 모든 조건에서 이들을 이용하여 합성한 재구성 DAG중 1,2-DAG와 1,3-DAG에 존재하는 C16:0은 반응몰비율에 따라 C16:0은 19.3～53.3 area%이었으며, C18:0은 19.2～51.0 area%이었는데 반하여 C18:3은 8.5～20.8 area% (14.2～34.9 area% x 0.⁵⁹⁷⁾이었으며 C22:6는 1. 3～15.
3%의 1,2-DAG이었기 때문에 반응중에 일부 DAG분자들은 TAG분자들로 전환되었다고 볼 수 있다. 또한 기질의 양을 달리하였을 때 사용된 지방산의 종류에 따른 acylglycerol의 양은 TAG, 1,3-DAG, 1,2-DAG, 그리고 MAG에서 두드러진 큰 차이는 보이지 않았다.
2 area%를 보여 다른 지방산 기질로 사용된 C16:0, C18:0, C18:3보다 매우 낮은 반응율을 보였다. 또한 기질의 양을 달리하였을 때 사용된 지방산의 종류에 따른 재구성 DAG에 존재하는 acylglycerol의 양은 TAG, 1,3-DAG, 1,2-DAG, 그리고 MAG에서 두드러진 큰 차이는 보이지 않았다.
반응기질 [C16:0, C18:0, perillar oil hydrolysate(C18:3, 59.7%), 고DHA(C22:6, 63.7%)] 모두 반응 몰 비율이 증가할수록 반응물인 재구성 DAG에 존재하는 TAG의 비율이 증가하였는데 C16:0을 0.5 mole 비율의 기질로 사용한 경우 43.2에서 1.5 mole 비율의 기질로 사용한 경우 46.4 area%로 증가하였다. C18:0의 경우에는 36.
6 area%를 보였다. 위의 결과에 지시된 바와 같이 포화 지방산인 C16:0과 C18:0를 비교하였을 때, 사용된 지방산의 몰 비율이 높아지면 각각의 합성된 DAG 분자 안에 결합된 지방산들의 함량도 높아졌다. 한편, perilla oil hydrolysate (C18:3)를 반응기질로 사용하였을 경우, 0.
6 area%로 각각 증가하였다. 위의 반응기질들을 0.5에서 1.5 mole 비율로 반응하였을 경우 반응물인 재구성 DAG에 존재하는 DAG의 구성 비율은 전체적으로 1,3-DAG가 1,2-DAG보다 많이 존재하면서 각각 24.7～45.9 area%과 6.8～16.4 area%를 보였다. 기질로 사용된 DAG oil의 구성비는 Table 2에 나타난 바와 같이 63%의 1,3-DAG와 24.
5 몰로 달리하고, sn-1,3위치 특이성이 있는 고정화 효소 Lipozyme RMIM(Rhizomucor miehei)을 총 기질의 10 wt%를 가하여 62℃, 220 rpm을 유지하면서 1, 3, 6, 24 h 반응시켜 시간별로 재구성 DAG를 합성하였다. 지방산 조성을 분석한 결과 반응기질로 사용한 지방산 모두 [C16:0, C18:0, perillar oil hydrolysate (C18:3, 59.7%), DHA(C22:6, 63.7%)] 몰 비율이 증가 할수록 DAG 중 기질로 사용된 각 지방산(C16:0, C18:0, C18:3, C22:6)의 조성이 증가하였다. 특히 고DHA를 기질로 사용하였을 경우 24시간 반응에서도 최대 24.
8 area% 이었기 때문에 합성된 재구성 DAG의 지방산 조성중 원래 기질이 함유한 각 C16:0과 C18:0의 양을 고려하더라도 C18:3과 C22:6의 결합율은 C16:0과 C18:0보다 낮았다. 특히 고DHA를 지방산의 기질로 사용한 경우 사용된 기질의 mole 비율보다는 반응시간이 DAG분자에 대한 지방산 결합율에 더 큰 영향을 미치는 것으로 나타났다. 따라서 지방산을 구성하고 있는 탄소의 수와 이중결합의 수에 따라 esterification 반응 정도가 달라지는 것으로 생각되며, 이는 지방산 중 cis 이중결합이 굽어있는 3차 구조를 형성하고 이로 인한 steric hindrance(입체장애)로 인하여 효소와의 반응이 어려워지기 때문인 것으로 생각된다.
3 area%이었다. 한편, 1 mole의 C16:0을 사용하여 반응 하였을 경우에서는 3시간 후에 1,2-DAG와 1,3-DAG의 C16:0 함량은 39.1, 35.3 area%의 조성을 보였고, 이후 반응 시간을 24 시간동안 진행하였을 경우 각각 33.6와 35.4 area%의 조성을 보였다. C16:0의 몰비율을 1.
2 area%를 보였다. 한편, C18:0을 기질로 사용하여 반응하였을 때 0.5 mole 비율로 반응하였을 경우 24시간 후에는 1,2-DAG와 1,3-DAG의 C18:0 함량은 18.3, 24.1 area%의 조성을 보였고 1 mole 비율로 24시간 반응 후 1,2-DAG와 1,3-DAG의 C18:0 함량은 32.3과 35.8 area%의 조성을 보였는데 1.5 mole에서는 각각 39.3과 45.6 area%를 보였다. 위의 결과에 지시된 바와 같이 포화 지방산인 C16:0과 C18:0를 비교하였을 때, 사용된 지방산의 몰 비율이 높아지면 각각의 합성된 DAG 분자 안에 결합된 지방산들의 함량도 높아졌다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	Diacylglycerol는 무엇인가?	Diacylglycerol(DAG)은 glycerol 1분자에 2개의 fatty acid가 ester 결합된 형태로써 monoacylglycerol(MAG)과 함께 식품제조 시에 유화제로 널리 사용되고 있다. DAG는 천연적으로 식용유지에 존재하기도 하는데 정제정도 및 정제유의 품질 등에 따라 일정량이 존재하고 있다(Kristensen et al.
	Diacylglycerol은 식품제조시 어떻게 사용되어지는가?	Diacylglycerol(DAG)은 glycerol 1분자에 2개의 fatty acid가 ester 결합된 형태로써 monoacylglycerol(MAG)과 함께 식품제조 시에 유화제로 널리 사용되고 있다. DAG는 천연적으로 식용유지에 존재하기도 하는데 정제정도 및 정제유의 품질 등에 따라 일정량이 존재하고 있다(Kristensen et al.
	Diacylglycerol이 식용유지에 무엇에 따라 일정량 존재하는가?	Diacylglycerol(DAG)은 glycerol 1분자에 2개의 fatty acid가 ester 결합된 형태로써 monoacylglycerol(MAG)과 함께 식품제조 시에 유화제로 널리 사용되고 있다. DAG는 천연적으로 식용유지에 존재하기도 하는데 정제정도 및 정제유의 품질 등에 따라 일정량이 존재하고 있다(Kristensen et al., 2005; Cho et al.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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